柏林亥姆霍兹中心晶体学片段筛选的工作流程与工具

利用X射线晶体学对称为片段的小分子有机化合物进行筛选，是发现药物研发或生物化学工具化合物开发起始分子的高效方法。晶体学片段筛选不仅能够揭示片段的身份，还能确定这些片段在目标蛋白质表面结合的位置及结合方式。该技术可应用于所有具有生化或医学意义且能够获得合适蛋白质晶体的靶标蛋白。

结果的质量与样本处理的质量密切相关。我们相信，以下的可视化演示将有助于研究人员开展高质量的实验。本次实验操作的演示者为 Tatjana Barthel，她是本实验室的博士研究员及博士生。

首先，打开已预热至室温的筛选板袋子，取下盖子和铝箔。将试剂储液槽中的5毫升浸泡液倾倒出来。然后使用12通道移液器，向筛选板的每个96孔储液槽中加入40微升浸泡液。

将便捷操作架放置在筛选板上方，并使用附带的夹子将其固定在装置的左右两侧。将筛选板和便捷操作架置于显微镜下，通过移动框架上相应的亚克力玻璃片，滑动打开第一个孔。使用新的移液枪头，从储液槽中吸取0.4 µL浸泡溶液，加入含有片段的孔中。

确保液滴覆盖干燥的碎片。将含有最大晶体的结晶板置于第二台显微镜下，并剪开其中一个孔位的密封膜。在第一台显微镜下，使用合适尺寸的环状工具，将一颗晶体转移至筛选板的孔中。

在已准备好的玻璃比色板中清洗接种环，然后轻轻接触滤纸使其干燥。每次转移后均需执行此操作，以避免交叉污染。使用显微镜确认晶体已正确放置。

对第二个晶体重复上述步骤。转移到下一个孔，对所有剩余的孔重复该操作。当晶体全部转移至筛选板的96个孔后，将筛选板连同简易取用框架一起从显微镜下取出，放置于实验台或桌面上。

然后从筛选板上取下易取框架，用密封箔密封筛选板，并将其放入结晶培养箱或柜子中，孵育先前优化的浸泡时间。孵育两小时已足够，但过夜可能更为方便。准备一个装有三个Unipuck盖子的Unipuck泡沫杜瓦罐，并加入半罐液氮，将其放置在地面上。

将装有一半液氮的杜瓦瓶移至实验台，并将其完全装满至瓶口边缘。在整个实验过程中保持液氮充满至瓶口上沿，并频繁补充液氮。从培养箱中取出筛选板，揭去其表面的铝箔封膜。

将便捷操作架放在上方。滑动打开第一个孔。从液滴中取出一颗晶体，并通过快速垂直浸入液氮中进行瞬时冷却。

将样品放入正确的载样杯位置，并在样品追踪记录表上做好相应记录。对第二个晶体重复此操作。前往下一个孔，重复其他晶体的定位操作，直至所有三个载样杯均装满。

将Unipuck底座预冷至液氮中，并将其放置在盖子顶部。将Unipuck存放在运输杜瓦瓶或储存杜瓦瓶中的储存架上。在低温条件下保持于液氮中，直至进行测量。

对筛选板中剩余的样品重复进行晶体收获并将其储存在Unipucks中的相同操作步骤。此处展示了进行片段浸泡和晶体收获后晶体形态的差异性。即使外观略有劣化的晶体也被纳入，因为它们仍能产生有用的数据。

数据在BESSY II同步辐射光源的14.1和14.2光束线上采集。对每个样品均进行了衍射数据收集。数据分析使用FragMAXapp软件，重点结合XDSAPP进行数据处理、fspipeline进行结构精修，以及PenDA进行命中识别。

在不使用DMSO的浸泡条件下，针对AR蛋白复合物获得了15个命中结果。在此前针对同一靶点的F2X初筛实验中，浸泡条件中包含DMSO，共发现20个命中结果。这意味着，若省略DMSO，仍可识别出75%的命中化合物。

实验成功的关键在于，在整个操作过程中必须正确且小心地处理晶体。晶体学片段筛选已发展成为一种广泛应用的技术，常被学术界和制药行业采用。