Name: 3D生物反应器培养大规模制备滑液间充质干细胞来源外泌体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 了解利用3D生物反应器从滑液间充质干细胞高效制备GMP级外泌体的完整方案。该方法显著提升外泌体产量，适用于关节炎治疗与再生医学研究。

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国家自然科学基金（编号：81972116，编号：81972085，编号：81772394）；广东省自然科学基金重点项目（编号：2018B0303110003）；广东省国际科技合作项目（编号：2021A0505030011）；深圳市科技计划项目（编号：GJHZ20200731095606019，编号：JCYJ20170817172023838，编号：JCYJ20170306092215436，编号：JCYJ20170413161649437）；中国博士后科学基金（编号：2020M682907）；广东省基础与应用基础研究基金（编号：2021A1515010985）；深圳市医疗卫生“三名”工程（SZSM201612079）；广东省高水平医院建设专项经费。

本研究经深圳市第二人民医院人体伦理委员会批准。从人滑膜间充质干细胞（hSF-MSCs）分离外泌体的示意图 体外 方案如图所示 图1.
1. 人滑膜间充质干细胞的培养与鉴定
<ol>
	<li>使用注射器和针头从临床骨关节炎（OA）患者中采集 20 mL 滑膜液（SF）。
	<ol>
		<li>对 OA 患者的膝关节进行消毒。用 7# 针头从髌骨外侧的股四头肌腱处穿刺进入关节腔。</li>
		<li>抽取 10 mL 关节液。用输液贴覆盖穿刺部位，并按压 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 10 分钟后，弃去滑膜液上清液。</li>
	<li>用 10 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀，在 4 °C 条件下以 1,500 × g 离心 10 分钟，弃去 PBS。</li>
	<li>用 10 mL 人源间充质干细胞（MSC）培养基重悬沉淀，细胞密度为 5 × 104 个细胞/mL（见材料表），然后将细胞悬液接种至 100 mm 培养皿中。</li>
	<li>将培养皿置于 37 °C、含 5% CO2 的培养箱中孵育。</li>
	<li>48 小时后，通过更换培养基并用 1× PBS 洗涤去除未贴壁细胞。每 3 天更换一次培养基，持续 2 周。</li>
	<li>收集细胞培养上清液。</li>
	<li>使用流式细胞术鉴定滑膜液来源的间充质干细胞（SF-MSCs）。
	<ol>
		<li>消化第三代（P3）SF-MSCs，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，收集细胞沉淀。 
		注：传代是指将细胞继代培养至另一培养皿中。从滑膜液中分离并首次接种于培养皿中的原代细胞标记为第零代（P0）。当细胞融合度达到约 75% 时，消化并脱离培养皿，接种至新的培养皿中，标记为第一代（P1）。</li>
		<li>向细胞沉淀（5 × 104）中加入 400 µL 封闭缓冲液（含 1% BSA 的 1× PBS），室温（RT）静置 15 分钟。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于 100 µL 1× PBS 中。</li>
		<li>每管加入 1 µL CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、HLA-DR 单克隆荧光抗体（稀释比例 1:100）（见材料表），室温避光孵育 30 分钟。</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤两次，弃去上清液。收集细胞沉淀，并重悬于 100 µL 1× PBS 中。</li>
		<li>使用流式细胞仪检测，每样本检测至 10,000 个细胞，采用 525/50 和 585/40 滤光片检测荧光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 三维生物反应器细胞培养
<ol>
	<li>微载体准备
	<ol>
		<li>将0.75 g干燥微载体（见材料表）溶胀，并在1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中水化（每克微载体使用50 mL DPBS），室温下至少孵育3小时。</li>
		<li>倾去上清液，用新鲜DPBS（每克微载体50 mL）洗涤微载体5分钟。弃去PBS，更换为新鲜1×DPBS（每克微载体50 mL）。</li>
		<li>通过高压灭菌（121 °C，15分钟，15 psi）对微载体进行灭菌。待灭菌后的微载体沉降后，倾去上清液。</li>
		<li>在培养基中短暂冲洗微载体（每克微载体50 mL），室温下进行。待微载体沉降后，弃去上清液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>灌注式生物反应器
	<ol>
		<li>通过高压灭菌（121 °C，15分钟，15 psi）对生物反应器进行灭菌。</li>
		<li>计数SF-MSCs数量，将2.5 × 107个SF-MSCs和微载体接种至生物反应器中，并加入符合GMP标准的MSC培养基（250 mL）进行灌注培养。</li>
		<li>将生物反应器置于37 °C、含5% CO2的培养箱中，以15 rpm的转速旋转。每6天更换一次培养基。</li>
		<li>培养14天后，收集细胞培养上清液和微载体用于进一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 外泌体鉴定与安全性检测
<ol>
	<li>超速离心
	<ol>
		<li>将细胞培养上清液在 4 °C 条件下以 300 x g 离心 10 分钟，收集上清液；弃去细胞碎片。</li>
		<li>将上清液在 4 °C 条件下以 2,000 x g 离心 10 分钟，收集上清液；弃去较大的囊泡（凋亡小体和部分较大的微囊泡）。</li>
		<li>将上清液再次在 4 °C 条件下以 10,000 x g 离心 30 分钟，以去除较大的囊泡；收集沉淀物并将其重悬于 40 mL 的 1x PBS 中。</li>
		<li>将重悬的沉淀物在 4 °C 条件下以 120,000 x g 离心 70 分钟，弃去上清液，并将含有外泌体的沉淀物重悬于 500 µL 的 1x PBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米颗粒追踪分析（NTA） 
	注意：每次运行时，以 30 µL/min 的流速将 500 µL 样品注入检测室。分析温度应控制在 24.4 °C–24.5 °C。
	<ol>
		<li>用无菌 1x PBS 将新分离的外泌体样品稀释至 1 mL，使颗粒浓度达到 107–109 /mL，并将其注入纳米颗粒追踪分析系统（参见材料表）。</li>
		<li>根据制造商的说明书手动设置捕获和分析系统。通过激光散射观察颗粒，并以数字视频记录其布朗运动。</li>
		<li>使用软件（参见材料表）对录制的视频进行分析，每次运行需追踪至少 200 个单独颗粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜
	<ol>
		<li>用冷的 1x DPBS 中的 4% 多聚甲醛固定外泌体 5 分钟。</li>
		<li>将 5 µL 外泌体样品滴加至铜网上。本实验中外泌体浓度为 1 mg/mL，由蛋白检测试剂盒定量（参见材料表）。</li>
		<li>将外泌体在冰上用 3% 磷钨酸嵌入染色 10 分钟。去除多余的酸液，并在室温下干燥样品。</li>
		<li>在 100 kV 加速电压下使用透射电子显微镜对外泌体样品进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质印迹
	<ol>
		<li>向外泌体中加入 300 µL 裂解缓冲液（1% Triton X-100，0.1% SDS，0.1 M Tris HCl，pH 7）以及蛋白酶抑制剂混合物（参见材料表）。</li>
		<li>通过移液上下吹打混匀外泌体与裂解缓冲液，并在冰上静置 20 分钟。</li>
		<li>将混合物在 4 °C 条件下以 9,391 x g 离心 10 分钟，收集上清液。使用蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度（参见材料表）。</li>
		<li>加入 100 µL 的 4x 蛋白上样缓冲液，并在 100 °C 下加热 10 分钟。</li>
		<li>上样 15 µL 浓度为 10 mg/mL 的蛋白样品，进行凝胶电泳（120 V，70 分钟），随后在 4 °C 条件下以 100 V 电转印 60 分钟。</li>
		<li>通过荧光蛋白质印迹法检测非外泌体特异性标志物（calnexin）和外泌体生物标志物（CD9、CD63 和 CD81）（参见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安全性检测
	<ol>
		<li>针对细菌、真菌和Mycobacterium tuberculosis的检测，执行步骤 3.5.2–3.5.5。</li>
		<li>将 100 µL 外泌体溶液（1 mg/mL）接种至血琼脂培养平板（参见材料表），在 37 °C 培养 24 小时。</li>
		<li>将 100 µL 外泌体溶液（1 mg/mL）接种至沙保弱氏琼脂培养基平板（参见材料表），在 35 °C 培养 48 小时。</li>
		<li>将 100 µL 外泌体溶液（1 mg/mL）接种至罗氏培养基平板（参见材料表），在 37 °C 培养 3 周。</li>
		<li>通过肉眼观察判断是否存在细菌、真菌和Mycobacterium tuberculosis菌落。 
		注意：评估外泌体安全性的标准为培养平板上无微生物生长。</li>
		<li>针对支原体检测，执行步骤 3.5.7–3.5.9。</li>
		<li>将外泌体重悬于试剂盒提供的 50 µL 缓冲液中，并在 95 °C 加热 3 分钟。</li>
		<li>使用支原体 PCR 检测试剂盒对外泌体溶液中的支原体进行扩增（参见材料表）。</li>
		<li>在 1.5% 琼脂糖凝胶（120 V，30 分钟）上检测 PCR 产物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 体外 外泌体功能检测
<ol>
	<li>外泌体标记
	<ol>
		<li>将100 µL外泌体（1 mg/mL）用1 mM Dil（1000倍稀释）标记（参见 材料表）并在室温下孵育30分钟。</li>
		<li>通过超速离心在 100,000 x g 条件下回收外泌体 g 70分钟。将沉淀重悬于500 µL的1x PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cy3-miR-140 模拟物加载至外泌体中
	<ol>
		<li>将1 µg/µL外泌体蛋白与5 µmol/mL Cy3-miR-140混合，总体积为400 µL电穿孔缓冲液（1.15 mM磷酸钾（pH 7.2）、25 mM氯化钾和21%（v/v）（参见 材料表).</li>
		<li>将混合物转移至预冷的0.4 cm电穿孔杯中，使用基因转染系统在300 V/100 µF电容条件下进行电穿孔（参见 材料表).</li>
		<li>电穿孔后立即在室温下孵育混合物30分钟，以确保外泌体膜完全恢复。</li>
		<li>用一单位的RNase A处理混合物（参见 材料表孵育20分钟，以去除外泌体外的miRNA模拟物。</li>
		<li>在120,000 x g条件下超速离心外泌体混合物 g 孵育90分钟，弃去上清液，并将外泌体重悬于500 µL的1×PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>外泌体摄取实验
	<ol>
		<li>将软骨细胞（1 x 107在含1 mL添加10% FBS的DMEM/F12培养基的35 mm共聚焦培养皿中培养。</li>
		<li>24小时后，用DiI标记的外泌体（100 ng/mL）或载有cy3-miR-140的外泌体（100 ng/mL）处理软骨细胞1小时。</li>
		<li>用1×PBS洗涤3次，然后在室温下用DAPI（10 ng/mL）孵育10分钟。</li>
		<li>使用适当的滤光片，在共聚焦激光扫描荧光显微镜（CLSM）中记录荧光信号（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 统计分析
<ol>
	<li>使用适当的统计软件进行统计分析。 
	注：每个图中的代表性数据以均值 ± 标准差（SD）表示。使用统计软件对两组之间的比较采用学生 t 检验（Student's t-test）。对于多组之间的比较，则采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 多重比较检验。P 值 &#60;0.05（*）、&#60;0.01（**）或 &#60;0.001（***）。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

间充质干细胞由于具有自我更新能力、可分化为具有特定功能的组织细胞以及旁分泌效应，已在再生医学中得到广泛应用16,17。其中，外泌体介导的旁分泌效应尤其受到关注18。外泌体携带间充质干细胞的生物信息，能够发挥其生物学功能，并克服间充质干细胞在储存和运输方面的困难。因此，来源于间充质干细胞的外泌体已被用于治疗干预，在骨关节炎（OA）治疗中尤其受到广泛关注。
目前，有两种方法可用于扩增间充质干细胞（MSCs）：二维（2D）培养和三维（3D）培养19二维培养是培养间充质干细胞（MSCs）的一种常规方法 体外 低成本研究。然而，该方法耗时较长，且扩增规模有限。此外，间充质干细胞在二维微环境中的传代培养会迅速导致干性下降20,21，这是MSCs最关键...

骨关节炎（OA）由关节软骨及下方骨组织的退变引起，仍是导致残疾的重大难题1,2。由于软骨缺乏血液和神经供应，一旦受损，其自我修复能力极低3,4。在过去几十年中，基于自体软骨细胞移植（ACI）的治疗方法在骨关节炎治疗方面取得了一定进展5。为了分离和扩增软骨细胞，需从骨关节炎关节的非负重区域获取少量软骨组织，这一过程会对软骨造成损伤。此外，该治疗还需进行第二次手术以植入扩增后的软骨细胞6。因此，无需损伤软骨的一体化治疗方案正在被广泛探索。
间充质干细胞（MSCs）被认为是一种具有前景的骨关节炎（OA）治疗替代方案7,8。MSCs来源于多种组织，在特定刺激下可分化为软骨细胞。重要的是，MSCs可通过抗炎作用调节免疫反应via anti-inflammation9。因此，MSCs在OA治疗中具有显著优势，既能修复软骨缺损，又能调节免疫反应，尤其适用于炎症环境。在OA治疗中，来源于滑膜液的MSCs（SF-MSCs）近年来受到广泛关注，因其软骨细胞分化能力较其他来源的MSCs更强10,11。值得注意的是，在骨科临床实践中，从关节腔中抽取炎性滑膜液是缓解OA患者疼痛症状的常规治疗方法。所提取的炎性滑膜液通常作为医疗废物处理。患者和医生均易于接受将自体来源的SF-MSCs用于OA治疗，且伦理争议极少。然而，SF-MSC疗法的应用受到致瘤风险、长期储存以及远距离运输障碍的限制。
外泌体由包括间充质干细胞（MSCs）在内的多种细胞分泌，携带了亲代细胞的大部分生物信息。作为一种无细胞疗法，外泌体已得到深入研究12,13。根据美国政府临床试验网站（ClinicalTrials.gov）提供的最新资源，目前已有更多大规模的外泌体临床研究在癌症、高血压以及神经退行性疾病等领域启动并开展。采用滑膜来源间充质干细胞（SF-MSC）外泌体治疗骨关节炎（OA）可能是一项令人期待且具有挑战性的尝试。符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的大规模外泌体生产是实现临床转化的关键。目前小规模外泌体分离通常基于二维（2D）细胞培养方法进行，但大规模外泌体生产策略仍需优化。本研究建立了一种在无异源成分条件下大规模培养SF-MSC并制备外泌体的方法。通过超速离心从细胞培养上清液中分离外泌体后，进一步验证了其安全性与功能。

<table><tbody><tr><td>BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>蛋白质浓度测定</td></tr><tr><td>血琼脂平板</td><td>南京伊健生物化学科技有限公司</td><td>P0903</td><td>细菌培养</td></tr><tr><td>CD105 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1243C</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD34 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1143C</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD45 抗体</td><td>BD Bioscience</td><td>555483</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD63 抗体</td><td>Abclonal</td><td>&amp;nbsp;A5271</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>CD73 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1242C</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>CD81 抗体</td><td>ABclonal</td><td>&amp;nbsp;A5270</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>CD9 抗体</td><td>Abclonal</td><td>&amp;nbsp;A1703</td><td>蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>CD90 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1167C</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Thermo</td><td></td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描荧光显微镜</td><td>ZEISS</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cytodex 微载体</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>微载体</td></tr><tr><td>Dil</td><td>ThermoFisher</td><td>D1556</td><td>外泌体标记</td></tr><tr><td>EZ-PCR 支原体检测试剂盒</td><td>BI</td><td>20-700-20</td><td>支原体检测</td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman</td><td></td><td>间充质干细胞鉴定</td></tr><tr><td>Gene Pulser II 电穿孔系统</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1652660</td><td>基因转染</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.2</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>Version 8.0.2</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR 抗体</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1111C</td><td>流式细胞术</td></tr><tr><td>罗氏结核菌培养基</td><td>南京伊健生物化学科技有限公司</td><td>T0573</td><td>结核分枝杆菌培养</td></tr><tr><td>MesenGro 培养基</td><td>StemRD</td><td>MGro-500</td><td>间充质干细胞培养</td></tr><tr><td>Nanosight NS300</td><td>Malvern</td><td>Nanosight NS300</td><td>纳米颗粒追踪分析</td></tr><tr><td>NTA 2.3 软件</td><td>Malvern</td><td></td><td>数据分析</td></tr><tr><td>Odyssey FC 成像系统</td><td>基因有限公司</td><td></td><td>荧光蛋白质印迹法</td></tr><tr><td>OptiPrep 电穿孔缓冲液</td><td>Sigma</td><td>D3911</td><td>基因转染</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>蛋白酶抑制剂</td></tr><tr><td>核糖核酸酶 A</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td>去除 RNA</td></tr><tr><td>沙保弱琼脂平板</td><td>南京伊健生物化学科技有限公司</td><td>P0919</td><td>真菌培养</td></tr><tr><td>透射电子显微镜（TEM）</td><td></td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>旋转细胞培养系统（RCCS）</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4HD</td><td>三维培养</td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>外泌体离心</td></tr></tbody></table>

通过三维生物反应器培养大规模制备滑膜液间充质干细胞来源外泌体

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

间充质干细胞（MSCs）分泌的外泌体被认为是治疗软骨损伤和骨关节炎的有前景的候选药物。临床应用所需的外泌体需要大规模生产。为此，人滑膜液间充质干细胞（hSF-MSCs）被培养在微载体微珠上，随后在动态三维（3D）培养系统中进行培养。通过采用3D动态培养，本方案成功地从SF-MSC的培养上清液中获得了大规模的外泌体。外泌体通过超速离心法收集，并利用透射电子显微镜、纳米颗粒示踪分析和蛋白质印迹法进行鉴定。同时，还检测了外泌体的微生物安全性。外泌体检测结果表明，该方法能够生产出大量符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的外泌体。这些外泌体可用于外泌体生物学研究以及骨关节炎的临床治疗。

根据国际细胞治疗学会推荐的人类间充质干细胞定义的最低标准14,15，采用流式细胞术鉴定SF-MSCs的表面标志物。流式细胞术分析显示，本研究中培养的SF-MSCs符合间充质干细胞的鉴定标准。这些细胞对CD34、CD45和HLA-DR呈阴性（低于3%），对CD73、CD90和CD105呈阳性（高于95%）（图2）。
在倒置显微镜下观察到，SF-MSCs在微载体上增殖（图3A）。将细胞从二维培养板和三维培养微载体上消化并洗涤后，对细胞数量进行了计数。与二维培养相比，自第6天起，三维培养显著促进了SF-MSC的增殖速度（图3B）。结果显示为三次独立实验的结果。 
为鉴定二维和三维培养的滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）来源的外泌体（Exos...

本文介绍了一种利用三维生物反应器从滑膜液间充质干细胞中大量制备符合药品生产质量管理规范（GMP）级别的外泌体的实验方案。

间充质干细胞（MSCs）分泌的外泌体被认为是治疗软骨损伤和骨关节炎的有前景候选手段。

我们介绍一种利用三维生物反应器从滑膜液间充质干细胞中大量制备符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的外泌体的实验方案。这些外泌体可用于外泌体生物学研究及临床关节炎治疗。本实验操作将由梁玉洁博士演示。通过在4°C、1,500 × g条件下离心10分钟，开始从滑液中收集人源间充质细胞（MSCs）。离心后弃去上清液，并用10毫升PBS重悬细胞沉淀。将重悬的细胞在4°C、1,500 × g条件下再次离心10分钟，弃去PBS，然后用10毫升人源MSC培养基重悬细胞沉淀，细胞密度为5 × 10⁴ 个细胞/毫升，随后将细胞悬液接种至100毫米培养皿中。将培养皿置于含5%二氧化碳的环境中，37°C条件下孵育。两周后，收集细胞培养上清液，通过流式细胞术鉴定滑膜液间充质干细胞（SF-MSCs）。操作时，将第三代（P3代）SF-MSCs经离心处理，条件为4°C、1,000 ×g离心5分钟。然后，弃去上清液，收集细胞沉淀。接着，向细胞沉淀中加入400 µL封闭缓冲液，细胞浓度为5 × 10⁴，于室温静置15分钟。15分钟后，按前述方法离心细胞悬液，再将分离得到的沉淀重悬于100 µL 1× PBS中。按照论文中所述，每管加入一微升单克隆荧光抗体（稀释比例为1:100），并将试管置于室温孵育30分钟。孵育结束后，用1×PBS洗涤细胞两次，再将细胞重悬于100微升1×PBS中。随后，使用流式细胞仪的红色和FITC通道检测最多10,000个细胞中的荧光染料。为制备微载体，将0.75克干燥的微载体以每克50毫克的浓度在1×DPBS中溶胀并水合，室温下孵育至少3小时。然后倾去上清液，并用新鲜DPBS洗涤微载体5分钟。更换为新鲜的1×DPBS，使微载体浓度保持在每克50毫克，随后在121摄氏度、15磅/平方英寸压力下高压灭菌15分钟，以实现微载体的灭菌。 然后，让灭菌后的微载体自然沉降，再倾去上清液。在室温下，用培养基以每克培养基含50毫克微载体的浓度冲洗微载体。待微载体沉降后，弃去上清液。为准备灌注式生物反应器，按照前述方法通过高压灭菌对生物反应器进行灭菌。完成后，计数SF-MSCs细胞数量，并将2.5 × 10⁷个SF-MSCs及微载体加入装有250 mL GMP级MSC培养基的灌注式生物反应器中。将生物反应器置于37 °C、含5% CO₂的培养箱中，以每分钟15转的速度培养。每六天更换一次培养基。14天后，收集细胞培养上清液和微载体用于进一步分析。在4摄氏度条件下，以300 × g离心细胞培养上清液10分钟，收集上清液并弃去细胞碎片。在 4 摄氏度下，将上清液依次以 2,000 × g 离心 10 分钟，然后以 10,000 × g 离心 30 分钟，以去除较大的囊泡并收集沉淀。将沉淀重悬于 40 毫升 PBS 中后，在 4 摄氏度下以 120,000 × g 离心 70 分钟。随后，将含有外泌体的沉淀重悬于 500 微升 PBS 中。用无菌 PBS 将 freshly isolated 的外泌体样品稀释至每毫升 10⁷ 到 10⁹ 个颗粒的浓度，每次运行向纳米颗粒追踪分析（NTA）系统注入 500 微升样品，流速为每分钟 30 微升，温度为 24.4 至 24.5 摄氏度。根据制造商的操作说明，手动设置捕获与分析系统。通过激光散射观察颗粒，并以数字视频记录其布朗运动。接下来，使用软件分析录制的视频，每次运行需追踪至少200个单独的颗粒。进行蛋白质印迹时，向外泌体中加入300微升裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂混合液，通过上下吹打混匀。然后将样品置于冰上静置20分钟。在4 °C条件下，将混合物于9,391 ×g离心10分钟，随后使用蛋白检测试剂盒测定上清液中的蛋白浓度。检测完成后，加入100 µL 4×蛋白上样缓冲液，在100 °C加热样品10分钟。接着，取15 µL浓度为10 mg/mL的蛋白样品，以120伏电压进行70分钟凝胶电泳，随后在4 °C条件下以100伏电压电转印60分钟。通过荧光Western印迹检测非外泌体特异性标志物（如钙网蛋白）以及外泌体生物标志物（如CD9、CD63和CD81）。在该研究中，采用流式细胞术鉴定滑膜间充质干细胞（SF-MSCs）的表面标志物。流式细胞术分析显示，培养的SF-MSCs对CD34、CD45和HLA-DR呈阴性，对CD73、CD90和CD105呈阳性，符合间充质干细胞的鉴定标准。在倒置显微镜下观察发现，丝素蛋白-间充质干细胞（SF-MSCs）可在微载体上增殖。自第6天起，SF-MSC在3D培养中的增殖速度较2D培养更快。通过蛋白质印迹法鉴定2D和3D培养条件下SF-MSCs分泌的外泌体，结果显示外泌体表达CD63、CD9和CD81，而不表达钙网蛋白（calnexin）。纳米颗粒分析显示，二维和三维外泌体的直径约为120纳米。透射电子显微镜分析揭示了二维和三维外泌体的形态，呈现出大致球形的囊泡结构。通过NTA分析，对外泌体中30至160纳米尺寸范围的颗粒浓度进行了检测。经过3D培养后，颗粒浓度为每毫升4.0 × 10⁶。然而，经过2D培养后，相同尺寸颗粒的浓度为每毫升2.5 × 10⁶。此外，3D培养产生的外泌体蛋白多于2D培养。代表性分析显示，Dil标记的外泌体被原代软骨细胞内化。可见Dil标记的外泌体在3小时达到峰值，进入原代软骨细胞。体外递送研究表明，外泌体可将磺化氰3标记的microRNA-140递送至软骨细胞。接种细胞、启动生物反应器中的反应以及上清液的收集是本方案中最重要的步骤。三维培养常用于贴壁细胞的大规模培养。其他方法如旋转式生物反应器也可用于外泌体的大规模生产。我们的方法提高了外泌体的产量，从而实现了基于间充质干细胞外泌体的临床前应用。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

3D生物反应器培养大规模制备滑液间充质干细胞来源外泌体

介绍了一种在高水平滑液环境中培养人关节软骨细胞的三维体系。滑液最能反映关节软骨的天然微环境，且易于获取和保存。因此，该体系可用于研究软骨再生以及筛选治疗关节炎的药物。...

一种用于在滑液中培养人关节软骨细胞的三维培养系统

建立从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞（MSCs）的方案，其中样本通过注射器抽吸无创采集。细胞分离后，采用流式细胞术进行细胞表型分析。 体外...

从迷你猪滑膜液和骨髓中分离间充质干细胞及其细胞表型分析

间充质干细胞/基质细胞（MSCs）的治疗潜力已有充分文献记载，但如何制备适用于患者的细胞仍存在争议。本文介绍在无异种成分条件下有效制备和施用经预处理的治疗性MSC球形聚集体（“球体”）的实验方案，适用于实验研究和临床应用。...

在无异源条件下通过三维培养制备并给予治疗性间充质干细胞/基质细胞（MSC）球体

干细胞向软骨分化需要精细调控培养条件。本文介绍一种利用磁力方法聚集细胞的技术，这是启动软骨分化的关键步骤。此外，我们还表明，在生物反应器中进行动态成熟培养可对细胞构建物施加机械刺激，从而增强软骨样细胞外基质的生成。...

三维磁性干细胞聚合并结合生物反应器成熟化用于软骨再生

本文介绍了一种简单且经济的实验方案，用于直接从新西兰白兔的滑膜液中分离和纯化间充质干细胞。...

利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

外泌体是一种新一代的药物递送载体。我们建立了一种高产量、高纯度的外泌体分离方案，用于siRNA递送。我们还将荧光标记的非特异性siRNA封装入外泌体中，并研究了负载siRNA的外泌体在癌细胞中的细胞摄取情况。...

外泌体的制备及其向癌细胞递送siRNA

本方案描述了从培养人脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）、收集上清液到通过超速离心法提取细胞外囊泡（EVs）的全部操作步骤。...

人脂肪源性间充质干细胞来源的细胞外囊泡的纯化与表征

本研究提出了一种用于慢性伤口愈合的核-壳结构3D生物打印支架的制备方案。从间充质干细胞中分离提取细胞外囊泡，并将其载入由海藻酸盐构成的芯层，壳层则由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶组成。该设计可实现支架的可控降解及细胞外囊泡的高效释放。...

利用同轴3D生物打印支架优化细胞外囊泡递送以管理慢性伤口

宏基因组文库可存档来自微生物的大片段连续基因组序列，且无需预先培养。构建一个……...

宏基因组文库的大规模筛选

内皮集落形成祖细胞（ECFCs）是研究血管稳态与修复的有力工具1,2。本文介绍一种新型无动物血清的方法，利用混合人血小板裂解物（pHPL）从肝素抗凝的成人外周血中分离并扩增ECFC，从而降低抗牛血清免疫反应的风险。...

成人人类内皮集落形成祖细胞的分离与大规模扩增

了解利用3D生物反应器从滑液间充质干细胞高效制备GMP级外泌体的完整方案。该方法显著提升外泌体产量，适用于关节炎治疗与再生医学研究。

通过三维生物反应器培养大规模制备滑膜液间充质干细胞来源外泌体

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