Name: 研究温度对液细胞传输电子显微镜对纳米粒子核化和生长的影响 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: 探索液相透射电镜中温度对金纳米颗粒成核与生长的影响。该方法利用原位加热实验实时观测纳米材料合成动态，揭示温度调控纳米化学机制，为材料设计提供定量数据支持。

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我们衷心感谢法兰西岛大区（为安装在巴黎大学的 JEOL ARM 200 F 电子显微镜提供的 SESAME E1845 号资助）、SEAM 实验室卓越计划（GLOIRE 项目）以及法国国家科学研究中心（纳米计划专项）提供的经费支持。&#160;我们感谢 Madeline Dukes 和 Daniel Franck 分享图 1 和图 2 中所示液体池的示意图与光学照片。

1. 为STEM HAADF成像校准透射电子显微镜
<ol>
	<li>按照制造商的说明进行显微镜的校准。</li>
	<li>使用常规干燥样品对显微镜进行校准，不要使用液体样品。</li>
	<li>为尽量减缓生长速度，需尽量降低电子束剂量率（见讨论部分），这意味着应使用较小的聚光镜光阑和较小的束斑尺寸以降低束流强度。</li>
</ol>
2. E芯片操作
注意：商用液体样品台几乎适用于所有透射电子显微镜（TEM），但应使用专为特定显微镜品牌和极靴设计的样品台。液体池由两个基于MEMS的硅芯片组成，称为E芯片，每个芯片均为带有500&#160;× 50 µm窗口的硅基底，窗口覆盖有50 nm厚的非晶氮化硅（SiN）薄膜，该薄膜具有电子透明性（图1A）。这两个E芯片尺寸不同。较小的芯片为2 × 2 mm，带有金制间隔物，用于固定两个E芯片之间的距离（此处为150 nm）以及液体层厚度。较大的芯片为4&#160;× 6 mm，其硅基底内部嵌有电阻，可实现对液体样品的均匀加热（图1B）。由于在洁净室中加工方式的原因，E芯片具有两个不同的面：一个面的窗口看起来较小（以下简称正面），另一个面的窗口较大并呈凹陷形状（以下简称背面）。
<ol>
	<li>操作E-chips时，切勿用镊子触碰窗口区域，应仅夹持芯片的边缘。为避免划伤硅基底表面，请使用碳涂层尖端的镊子。</li>
	<li>若将E-chip放置于表面，务必确保芯片背面与表面接触，因为氮化硅薄膜较为脆弱，且沉积于芯片正面。</li>
</ol>
3. 液体池样品杆的清洗（实验前）
<ol>
	<li>取下覆盖在样品杆尖端的盖子。使用镊子取下假液池。取下与假液池配合使用的垫圈。 
	注意：假液池是指没有氮化硅（SiN）窗口、仅由硅构成的液池，用于在真空泵中存放液池样品杆。请注意黄铜螺丝的状态，因为它们随着时间推移容易碎裂。特别是当螺丝头部已损坏时，必须更换螺丝；否则，实验后可能难以拧下，且产生的微小碎屑还可能干扰样品加载。</li>
	<li>使用注射器和外部聚醚醚酮（PEEK）管路，手动向样品杆内部注入 2 mL 蒸馏水，管路连接至样品杆后端。 
	注意：样品杆内部有 3 条微流体通道，均需用水清洗干净。注意观察从样品杆前端流出的水：如果因前次实验导致水流带有颜色，则需持续向样品杆内注入清水，直至流出液体无色为止。</li>
	<li>若在实验过程中需向液池内注入溶液（本实验中为水中 1 mM 的 HAuCl4 溶液），请先用该溶液填充样品杆的管路。</li>
	<li>使用气枪吹干液池样品杆的尖端。</li>
</ol>
4. 液体池（E-chips）的制备
<ol>
	<li>液体池的清洗。
	<ol>
		<li>用丙酮填充一个玻璃培养皿。</li>
		<li>用甲醇填充一个玻璃培养皿。 
		&#8203;警告：由于甲醇具有毒性，盛有甲醇的培养皿必须置于通风橱内操作。处理甲醇时应佩戴适当的防护装备（手套）。</li>
		<li>将一片小型和一片大型E-chip放入盛有丙酮的培养皿中，静置2分钟。 
		&#8203;注意：E-chip 涂有一层保护层，需在实验前去除。丙酮可去除光刻胶并清除 E-chip 上的残留物。为增强清洗效果，可轻轻搅动溶液。</li>
		<li>将两个E-chips放入盛有甲醇的培养皿中，静置2分钟。甲醇将清除E-chips上的丙酮及残留碎屑。 
		警告：将E-chips在丙酮和甲醇之间转移时，必须尽快完成，以避免E-chips在空气中干燥。</li>
		<li>使用气枪吹干液相池。用镊子夹住E-chip的同时使用气枪。注意不要过度按压气枪扳机，否则E-chip可能从镊子中脱落。若发生脱落，需用丙酮和甲醇重新开始清洗步骤。</li>
		<li>使用双目放大镜或光学显微镜检查氮化硅窗口的完整性（图2). 
		&#8203;注意：确保两个 E-chips 的窗口清洁且无破损。如果 E-chips 看起来不洁净，可尝试将其重新浸入丙酮和甲醇中清洗。如果窗口仍有污物或已破损，则必须更换新的 E-chips。</li>
		<li>使用氩气和氧气混合气体对E-chips进行2分钟的等离子体清洗。等离子体清洗可使E-chips具有亲水性。等离子体清洗设置的具体参数如下：氩气流速 = 35 sccm，氧气流速 = 11.5 sccm，气体流速超时时间 = 20 s，前向射频目标功率 = 50 W，前向射频范围 = 5 W，最大反射射频功率 = 5 W。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将液体池装入透射电子显微镜样品杆中（图3).
	<ol>
		<li>将垫圈O形环装入液体池样品杆内（图3B）。检查所用垫圈是否清洁。若不清洁，需用蒸馏水快速清洗，并用洁净的滤纸吸干。为去除垫圈上的碎屑和纤维，可将其在两片帕拉菲尔膜（parafilm）之间反复按压多次。</li>
		<li>将小型 E-chip 置于液体池样品杆内（图3C）。为减少氮化硅薄膜向显微镜真空侧弯曲，应将液体池窗口设置为交叉配置。因此，小E芯片的窗口须与样品杆的长度方向平行，并使正面朝上。确保小E芯片已完全插入密封垫内。</li>
		<li>制备液体样品（此处为 1 mM 的 HAuCl₄ 水溶液）4 在水中。</li>
		<li>滴加 &#8776;2 &#181;使用微量移液器将液体样品 L 加载到小型 E 芯片上（图3D）。如果小型E芯片已进行适当的等离子清洗，水溶液样品将均匀地铺展在芯片表面。</li>
		<li>用滤纸吸去多余的液体。用裁剪锋利的滤纸小片，减小液体在小型E芯片上的液层厚度，直至形成一个平坦的穹顶状。</li>
		<li>将大尺寸E芯片放入液体池样品杆中（图3E将大号E-chip正面朝下放置在小号E-chip上（两个芯片的正面必须相对）。大号E-chip上的电极必须与样品台上的电极焊盘接触。</li>
		<li>将盖子重新滑回液体池样品杆上。逐渐拧紧每个螺丝（图3F).</li>
		<li>使用裁剪好的滤纸吸干E-chips中可能渗出的液体。通过绕轴旋转液体池样品杆，检查液体池两侧是否均无液体渗出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在抽气站中测试液体池的真空密封性。如果泵的真空度达到 5 x 10-2 然后继续实验方案。如果窗口破损（极有可能），请检查其完整性，并更换一组新的E-chips，从头开始实验方案。</li>
	<li>使用双目放大镜或光学显微镜最后一次检查氮化硅窗口的完整性。有时，即使窗口已破裂，液相池仍可能维持抽气站的真空状态。这是因为当窗口破裂且液体溢出时，溶质可能在窗口破裂处形成盐的聚集体，从而覆盖住破孔。若发生此情况，请准备一套新的E-chip。</li>
	<li>将液体池样品杆装入透射电子显微镜并检查真空度。即使液体池能够耐受抽气站的真空且窗口无明显问题，液体池的微泄漏仍可能导致无法达到透射电镜运行所需的真空水平。如果显微镜无法达到运行所需的真空度（2-5 × 10⁻⁶ mbar），则必须将样品杆从显微镜中取出并重新检查密封情况。-5 Pa），取出样品台并准备一组新的E-chips。</li>
</ol>
5. 使用液体样品台的流动模式
<ol>
	<li>用两个注射器各吸取几毫升待注入溶液（本实验中为水中1 mM的HAuCl4溶液）。</li>
	<li>将两根外部PEEK管连接至注射器，将两个注射器安装到注射泵上。将两根外部PEEK管插入液体池样品杆的两个进液口，并插入一根额外的外部PEEK管作为液体池样品杆的出液管。</li>
	<li>以每分钟5 µL的流速从每个进液口注入溶液。</li>
</ol>
6. 液体环境的加热
<ol>
	<li>将电源连接至样品杆。将电源连接至安装有加热软件的计算机。</li>
	<li>启动计算机并打开加热软件。开启电源。</li>
	<li>单击设备检查按钮。如果软件提示 &#34;通过&#34; 然后实验可以继续。否则，大尺寸E-chip可能存在以下问题（E-chip装载不当、电极断裂）&#8230;).</li>
	<li>点击 实验 标签。单击 手册 以启动加热的手动模式。</li>
	<li>选择目标温度，并相应调整升温速率。按下“应用”以将E-chips加热至目标温度（图4). 
	注意：E-chips 可加热至 100 °C &#176;C. 如果实验中使用水溶液（如本实验），避免将E-chips加热至90 ℃以上 &#176;C. 否则，液态样品可能会干燥。加热液体时，温度可能暂时超过目标温度，随后回落至设定温度。应采用较低的加热速率以尽量减少此类过冲现象（1 &#176;C/s 即可。</li>
	<li>点击 环境温度 回到室温（25 &#176;C）。点击 停止 以突然停止加热。单击 结束会话 结束加热实验。</li>
</ol>
7. 纳米颗粒生长的扫描透射电子显微成像
<ol>
	<li>使用STEM模式和HAADF探测器操作显微镜。选择样品上未受电子束照射的区域，靠近观察窗口的角落处，此处液体层厚度最小。在不同液体温度下采集纳米颗粒生长的视频（图5）。 
	注意：金纳米颗粒会在扫描区域内立即出现并持续生长。以每秒一帧的速率进行视频记录，可在良好的信噪比和时间分辨率之间取得较优平衡，适用于观察生长过程。</li>
</ol>
8. 单个纳米颗粒的STEM纳米衍射
<ol>
	<li>获取多个纳米物体的STEM HAADF图像，并使用STEMx软件选取图像中的单个纳米颗粒以获取其衍射图样（图6）。 
	注意：STEM纳米衍射是一种可在液相生长实验过程中对单个纳米颗粒进行衍射图样采集的技术22。</li>
	<li>在获取STEM HAADF图像后，于图像上选择多个纳米物体，STEMx软件将自动同步电子束探针与CCD相机的位置，从而在每个探针位置采集相应的衍射图样。为避免衍射斑点重叠，应使用较小的STEM探针会聚角（本实验中为7.4 mrad），即采用较小的聚光镜光阑（本实验中为10 µm）。</li>
</ol>
9. 实验后液体池样品杆的清洗
注意：此处描述的是液体池样品杆的标准清洗流程。如果该清洗方法效果不足，可使用稀释的硝酸和甲醇冲洗液体池样品杆中可能存在的纳米颗粒聚集体。但在使用前应查阅液体池样品杆的化学兼容性文档。无论如何，清洗过程最后必须注入蒸馏水进行冲洗。
<ol>
	<li>取下盖子。取出使用过的E-chips。取下内部密封圈。 
	注意：使用过的E-chips可储存在专用盒子中。之后可对液体池解封后仍附着在SiN窗口上的纳米物体进行离位透射电子显微镜（TEM）或扫描电子显微镜（SEM）分析15。不建议将E-chips用于另一次原位实验，但如果在解封液体池时SiN薄膜未破损，则仍可重复使用。随后可在不同溶剂中进行过生长实验。23</li>
	<li>向液体池样品杆的进液口和出液口管道中各注入5 mL蒸馏水。</li>
	<li>使用超声波清洗槽清洗液体池样品杆尖端，持续20分钟。接触垫可浸入清洗槽中，但仅限被盖子覆盖的部分。切勿将通气孔浸入液体中。</li>
	<li>使用气枪将液体池样品杆吹干。</li>
	<li>重新安装与假液体池配套使用的密封圈。重新装入假液体池和盖子。</li>
	<li>将样品杆存放于真空储存装置中。</li>
</ol>
10. 使用 Fiji（ImageJ）进行实验后分析
注意：建议将拍摄的视频每一帧拆分为单张图像。此实验后分析步骤的目的是将纳米颗粒的原始视频转换为可用Fiji分析的二值化视频。使用中值滤波以增强纳米颗粒与背景之间的对比度（图7B &amp;#38; 7E）。这对于促进视频的二值化处理至关重要。
<ol>
	<li>单击以在 Fiji 中打开包含视频图像的文件目录 文件 | 导入 | 图像序列序列选项窗口将弹出。选择适当的起始图像（如果需要舍弃视频的起始部分）。输入图像序列的增量数值（该数值对应 STEM 扫描到达图像底部所需的帧数）。勾选复选框 转换为8位灰度图将图像序列保存为 tiff 格式。</li>
	<li>裁剪掉视频中所有不需要的伪影（例如标尺或液体池窗口的边缘）。</li>
	<li>点击 过程 | 滤镜 | 中值 对所有图像应用中值滤波。将处理后的图像序列以 tiff 格式保存。 
	注意：此时会弹出一个窗口，提示输入中值滤波的半径值。我们使用了2像素的半径，但也可根据需要调整参数。Fiji中还提供其他可用的滤波方法以优化图像处理效果。特别是，如果背景强度不均匀，可使用“减去背景”算法使背景趋于平坦。操作时，请点击 过程 | 扣除背景在本研究中，该过程会在初始图像背景中产生微小的白色斑块，可能被误认为是假性纳米颗粒。因此，我们未采用此方法，但建议在其他数据集上尝试，因为液体池中心到边缘的液层厚度逐渐增加，通常会导致低倍率液相透射电镜图像中背景强度不均匀。</li>
	<li>点击 图像 | 调整 | 阈值手动调节以更精确地设定二值化阈值，直到仅有纳米颗粒呈现红色为止。按下应用按钮。 将图像序列转换为二值图像 窗口将弹出。取消勾选 为每幅图像计算阈值将二值图像序列以 tiff 格式保存（图7C &amp;#38; 7F). 
	注意：建议在视频的每一帧中检查阈值是否合适。</li>
	<li>仅当视频中纳米颗粒出现对比度反转时，才执行此步骤。&#160;点击 流程 | 二值化 | 膨胀如有必要，再重复一次。点击 流程 | 二值化 | 填充孔洞 (图7G，参见讨论部分）。</li>
	<li>点击 分析 | 分析 颗粒。定义实验过程中观察到的被分析纳米颗粒的尺寸范围。检查 总结. 
	注意：至少需要定义所观察到的纳米颗粒的最小尺寸。否则，二值化图像序列中出现的小黑点（噪声）将被误认为是纳米颗粒。初次设置时，可选择肉眼识别出的最小纳米颗粒的尺寸，但随后需通过反复试验来理解该参数的影响，并优化自动数据分析（见讨论部分）。在此步骤之前，若要获取纳米颗粒的面积，请点击 分析 | 设置测量 并检查 领域. 其他测量方法也可使用。</li>
	<li>保存 结果 和 摘要 窗口。每帧中的纳米颗粒数量在 摘要 数据窗口</li>
</ol>

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<li>Schneider, N. M., Park, J. H., Norton, M. M., Ross, F. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+analysis+of+evolving+interfaces+during+in+situ+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Structural+and+Chemical+Imaging%22%5BJournal%5D)">Automated analysis of evolving interfaces during in situ electron microscopy.</a> Advanced Structural and Chemical Imaging. 2, (2016).</li>
<li>Yao, L., Ou, Z., Luo, B., Xu, C., Chen, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine+learning+to+reaveal+nanoparticle+dynamics+from+liquid-phase+TEM+videos%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Machine learning to reaveal nanoparticle dynamics from liquid-phase TEM videos.</a> ACS Central Science. 6, 1421-1430 (2020).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案描述了在温度可控的液体介质中，通过辐射分解驱动金纳米颗粒成核与生长过程的实验方法。结合自动化的视频处理技术，可测量温度对纳米颗粒合成关键参数的影响，如纳米颗粒的密度、尺寸、形貌及原子结构。这些重要数据可用于评估温度对成核速率和生长速率的作用，检测可能发生的相变过程，并可视化决定胶体溶液最终形态的晶面形成过程。结合对反应介质成分的调控能力，温度可控的液体池透射电子显微镜（TEM）技术为进一步在接近真实合成条件的情况下直接观察各类纳米结构的成核与生长过程提供了新的途径。本文结果的解读及其与成核-生长模型的比较将在他处讨论。本文旨在强调开展有意义的原位TEM实验时必须考虑的若干方法学要点。
首先，必须明确反应介质中的电子束效应，因为这些效应可能极大地影响实验结果。在此，由于水的辐射分解是纳米颗粒形成的驱动力，因此随着电子剂量率的增加，生长速度迅速加快，从而影响最终纳米结构的形貌11,15。因此，为了研究温度对纳米颗粒成核与生长的影响，有必要在相同电子剂量率下进行生长实验的比较。在STEM模式下，电子剂量率等于束流（单位：电子/秒）除以成像区域面积（单位：nm2）。因此，保持恒定的电子剂量率意味着每次实验需维持相同的束流（即相同的聚光镜光阑和束斑尺寸）以及相同的放大倍数。使用CCD相机或法拉第杯对成像条件下的束流进行量化，对于数据的解释和可重复性至关重要。放大倍数及相应的剂量率应根据研究目的进行选择：若希望观察大量纳米颗粒的生长过程，以获得具有统计意义的生长动力学数据（图5）；或在单个纳米颗粒尺度上研究生长机制，以识别纳米颗粒表面的优先吸附位点（图10）。如果成核和生长过程过快，尤其是在高倍率下，应选择较小的聚光镜光阑和较小的束斑尺寸，以尽量降低剂量率。此外，通过降低分析溶液中金属前驱体的浓度也可减缓纳米颗粒的成核与生长，但需注意，辐射产物的浓度会随温度升高而增加。一般而言，还必须考虑整个样品所经历的电子辐照历史。例如，若在相邻区域快速连续进行多次生长实验，由于研究区域内金前驱体浓度逐渐降低，纳米颗粒的密度将随时间减少。该效应可通过在空间和时间上分隔生长实验，并采用流动模式的液体样品台来最小化。
界面追踪算法对于自动分析视频并定量提取大尺寸纳米颗粒组装体的成核与生长结果极为有益。然而需要注意的是，图像二值化步骤始终依赖于具体的数据，这意味着为优化纳米颗粒/液体界面的检测而需施加在图像上的滤波方法和数据处理流程会因实验不同而有所差异。此外，将这些自动分析的结果与在少量图像上进行的手动测量结果进行对比至关重要，以便优化图像处理流程并明确其局限性。例如，在本研究中，随着高温下形成的三维纳米颗粒逐渐增厚，多重散射事件导致其核心在观察30秒后出现对比度反转，这是因为散射电子的角度展宽使得环形探测器角度范围内的信号收集减少。为了持续准确测量这些纳米颗粒的真实表面积，我们在图像二值化后采用了&#34;填充孔洞&#34;的数据处理方法，以填充环状对比结构的内部圆形区域（图7F，G）。然而，我们还需对物体进行轻微膨胀处理，以确保这些环状对比结构始终保持完全连接。后一步骤导致自动测量中纳米颗粒的平均表面积略有高估（图9）。类似地，在纳米颗粒检测过程中，我们必须设定一个被检测物体的最小尺寸（Smim），以避免将噪声误判为信号，但该参数会影响测得的成核速率。如图8所示，实验初期检测到的纳米颗粒数量逐渐增加，最终趋于平稳。当Smin较大时（50像素2，相当于1543 nm2），自动测量与手动测量在平台期数值上一致（60秒时为835个纳米颗粒），但在自动分析中，纳米颗粒的检测出现延迟：手动计数在12秒时已达到835个，而自动检测则需更长时间才能达到相同数量。这种检测延迟导致成核速率被低估。将Smin降低至20像素2（即617 nm2）可减小纳米颗粒组装成核时间的误差，但会导致纳米颗粒密度被高估，尤其是在实验早期阶段（图8），这也会影响成核速率的准确性。在液相透射电镜中，对具有高度动态行为且信噪比较低的纳米物体进行检测及其尺寸与形状测量是一项普遍挑战，未来可通过其他分割与去噪方法24或机器学习方法25进一步改善。
最后但同样重要的是，液体池的制备以及液体样品 holder 的清洗必须非常仔细地进行，以避免反应介质受到污染。
通常，在液相透射电子显微镜（LCTEM）分析过程中控制样品温度，能够为研究固-液界面化学反应的热效应提供机会。因此，我们希望本方法能够为其他原位透射电镜实验开辟道路，以揭示在温度可控的液体环境中硬质材料、软质材料或生物材料的动态行为。

金属纳米颗粒（NPs）具有优异的物理化学性质，可广泛应用于光学传感1、医学2和能源3等领域。湿化学合成法是一种高度通用的方法，可用于制备尺寸和形貌均一的金属纳米颗粒。在过去几十年中，研究人员已发展出多种策略以实现对纳米颗粒合成过程的调控，包括种子介导生长法4、晶面阻断法5、动力学控制合成法6、选择性刻蚀法7以及温度控制合成法8。然而，尽管驱动合成的化学反应本身相对简单，成核与生长机制却十分复杂，因为在纳米材料形成过程中有诸多参数共同作用，而仅通过在特定时间点从反应体系中取出样品进行离原位表征，难以准确解析各个参数的独立影响。为了真正理解成核与生长过程并建立有效的调控方法，我们必须采用原位表征技术，以实现在精确控制的液相环境中对这些过程进行实时观测。
在这一方面，液相透射电子显微镜（LCTEM）已成为揭示金属纳米颗粒合成过程的强有力方法9,10,11,12,13。通过在液体反应环境中直接成像单个纳米结构的动态演化过程，该技术加深了人们对成核与生长机制的理解，特别是晶体缺陷、晶种形貌以及有机配体在调控定向生长或刻蚀过程中的作用，从而获得具有特定形貌的纳米材料（如纳米棒、纳米星、纳米片、纳米壳）10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。当透射电子显微镜的电子束与液体相互作用时，辐射分解过程会产生强还原性和氧化性物质，改变辐照区域内的溶液化学环境，进而可用于驱动生长或刻蚀过程。值得注意的是，辐射产物的浓度已知随电子剂量率的增加而升高，而电子显微镜中的该参数可实现精确调控20。因此，研究人员已利用辐射分解对剂量率的依赖性来控制反应速率，并揭示其对纳米结构形成过程及最终形貌的动力学影响11,15,20。
尽管温度是纳米材料合成中的一个关键参数，但由于具备可靠温度控制的商用液体池最近才得以开发，此前利用液相透射电子显微镜（LCTEM）对其效应的研究尚未得到充分开展。然而，此类原位研究对于揭示温度变化所引发的复杂动力学和热力学效应至关重要。事实上，一方面，升高温度会显著影响生长过程中的晶面形成，加快原子和分子在液体中的扩散速率，并改变反应速率；另一方面，纳米结构的纳米相图对温度也极为敏感。本文中，我们利用近期开发的加热型液体池，在室温至100 °C的温度控制范围内，实时追踪金纳米颗粒在水中的辐射还原生长过程。该方法结合扫描透射电子显微成像与衍射技术，在日益接近真实合成条件的环境中进行观察，从而缩小了原位透射电镜观测与常规实验规模合成之间的差距。

<table><tbody><tr><td>2100 Plus 电子显微镜</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气动喷枪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARM 200F 电子显微镜</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>双目镜或光学显微镜</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳尖镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备加热软件的计算机</td><td>Protochips 公司软件</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>假 e-chip</td><td>Protochips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>垫圈/O型圈</td><td>Protochips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>金水溶液</td><td>Merck</td><td></td><td>1 mM HAuCl&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; —— 需预先配制</td></tr><tr><td>大型液体加热 E-chip</td><td>Protochips</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One View 相机</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td>数量：2</td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poseidon Select</td><td>Protochips</td><td></td><td>液体池样品杆</td></tr><tr><td>电源 Keithley 2450</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>防护手套</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>红色 PEEK 管</td><td></td><td></td><td>数量：3</td></tr><tr><td>带扭矩的螺丝刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小型液体 E-chip</td><td>Protochips</td><td></td><td>150 nm 间隔层</td></tr><tr><td>STEM HAADF 探测器</td><td>Jeol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMx 软件</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td></td><td></td><td>数量：2</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>数量：2</td></tr><tr><td>真空泵</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过液相透射电子显微镜研究温度对纳米颗粒成核与生长的影响

Studying the Effects of Temperature on the Nucleation and Growth of Nanoparticles by Liquid-Cell Transmission Electron Microscopy

温度控制是近年来的一项新进展，为利用液体池透射电子显微镜研究纳米化学提供了额外的自由度。本文中，我们描述了如何制备原位加热实验，以研究温度对水中辐射还原驱动的金纳米颗粒形成过程的影响。该实验方案相对简单，涉及一种可均匀加热至100 °C的特殊液体池、一种具备液体流动功能的液体池透射电镜样品杆，以及一个集成化的温度控制系统接口。我们发现，金纳米颗粒的成核与生长机制在液体池中受到温度的显著影响。通过扫描透射电子显微成像（STEM）和纳米衍射技术，实时揭示了生长中纳米颗粒的密度、尺寸、形貌及原子结构的演化过程。利用自动化图像处理算法，从视频序列中提取出有用的定量数据，例如纳米颗粒的成核速率和生长速率。该方法为理解纳米材料液相合成过程中复杂的物理化学过程提供了新的依据。

图5展示了在25 °C和85 °C下，历时80秒采集的金纳米颗粒形成的两组STEM HAADF图像序列。在所有这些实验中，纳米颗粒的成核与生长均由水的辐射分解所驱动。在电子束诱导产生的化学物种中，强还原剂（即水合电子和氢自由基）可还原四氯金酸，从而在SiN窗口与液体界面处形成金纳米晶体。这两组在相同电子剂量率下进行的原位观测结果证实，本方法能够直观展示温度对液相中纳米颗粒形成过程的显著影响。在低温条件下，观察到大量细小纳米颗粒形成的致密聚集体；而在高温条件下，则生成少数尺寸较大且晶面清晰的纳米结构。由于STEM HAADF图像的衬度与金纳米颗粒的厚度成正比，因此在这些生长实验过程中可观察到两类不同产物：一类是衬度较高的三维纳米颗粒，另一类是衬度较低、呈三角形或六边形的大尺寸二维纳米结构（如图5中红色箭头所示）。
本方案中描述的视频分析方法可通过随时间测量观察区域内纳米颗粒的数量及其平均表面积，从而对成核和生长过程进行量化。如图8所示，在低温条件下，观察的几十秒内可形成超过800个纳米颗粒，而在高温条件下仅形成30个纳米颗粒。除两个三角形和六边形纳米片外，所有纳米颗粒在高温跟踪过程的第一张图像中就已全部存在。图9显示，纳米颗粒的平均表面积在85 °C时的增长速度比25 °C时快40倍。
图6 展示了两个金纳米颗粒的典型扫描透射电子显微镜（STEM）图像及其衍射图样，这两个颗粒直接在图像上被选中（由图6A中的红色箭头指示）。在此，我们可以识别出金的面心立方（FCC）结构，其分别沿[001]（图6B）和[112]（图6C）晶带轴取向。
<img alt="微流控芯片设计与应用；示意图展示芯片实验室系统中的温度控制。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：E芯片及液体池支架尖端的示意图。 (A) 用于加热液体池的大尺寸E芯片（顶部）及其加热电阻，以及小尺寸E芯片（底部）。(B) 两个E芯片均装载于液体池支架中。大尺寸E芯片的电极与支架上的电极垫接触，其电阻可对液体池进行加热。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="膜完整性分析；显微镜图像显示完整、受损和破裂的氮化硅膜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：E芯片的光学显微镜图像，显示：（A）实验所需的完整SiN窗口。（B） E芯片边缘处受损的硅晶圆。如果损伤区域位于液体池密封后湿润区域之外（即损伤位于O形圈所定义区域之外），此类E芯片仍可使用。（C） E芯片表面的残留物。若重复清洗步骤后残留物仍无法去除（参见第4.1节），则不应使用该E芯片。（D 至 F） 损坏的SiN窗口（不可用的E芯片）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="六步微加工过程、金属沉积与图形化、显微分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：液体池加载至透射电镜样品杆的分步过程照片。（A） 单独的样品杆。（B） 将垫圈O型圈放入腔体中。（C） 将小型E芯片插入垫圈O型圈内。（D） 在小型E芯片上滴加一滴溶液。（E） 将大型E芯片覆盖在小型E芯片之上。（F） 通过拧紧盖子密封整个液体池。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于科学实验的温度控制系统界面，具有实时数据分析图表。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：控制液体池温度的加热软件界面截图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="延时显微镜图像显示纳米颗粒随时间的组装过程；实验结果以秒为单位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图5：金纳米颗粒生长过程的低倍STEM HAADF图像序列。（A）在25 °C下。（B）在85 °C下。每幅图像左下角标注了相应的时间。二维纳米结构由红色箭头指示。所有图像均采用相同的电子剂量率3.4 electron·s-1·nm-2采集。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="纳米颗粒电子显微镜；衍射图样分析；透射电镜图像；晶体学结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：单个纳米颗粒的扫描透射电子显微纳米衍射。（A）用于选择发生衍射的纳米颗粒的STEM图像（衍射采集过程中电子束探针的位置由红色箭头标示）。（B，C）两个选定纳米颗粒的衍射图样。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="颗粒分析；显微图像对比显示颗粒分布和粒径分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 7"> 
图 7：使用 Fiji 对 STEM HAADF 图像进行数据处理与分析。 图像采集于生长开始后 40 秒。（A 至 C） 在 25 °C 下采集的图像。（D 至 G） 在 85 °C 下采集的图像。（A, D） 原始 STEM 图像。（B, E） 处理后的图像（中值滤波）。（C, F） 二值图像。（G） 对像素进行两次膨胀操作，随后应用“填充孔洞”处理。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同温度下随时间变化的颗粒生长情况；25°C 和 85°C 下的曲线对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8：在 25 °C 和 85 °C 下金纳米颗粒数量随时间变化的曲线图。 25°C 下的两条曲线是通过自动测量获得的，其最小检测尺寸（Smin）分别为 20（红色）和 50（蓝色）像素2。绿色圆点表示在 25 °C 下采集的视频中手动计数得到的纳米颗粒数量，对应采集时间为 12 秒和 60 秒。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="25°C 和 85°C 下平均面积随时间变化的图表，突出显示温度对生长速率的影响。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig09.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 9"> 
图9：金纳米颗粒平均表面积随时间变化的曲线图（25 °C 和 85 °C）。绿色圆点表示在85°C下采集的视频中特定时间点手动测量的纳米颗粒平均面积。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米颗粒生长序列；随时间变化的透射电镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62225/62225fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图10"> 
图10：85 °C下单个金纳米立方体生长过程的高倍STEM HAADF图像序列。 本图像序列的电子束剂量率为83.6 electron.s-1.nm-2。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62225/62225fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

在液相电子显微镜实验中进行温度控制，为研究纳米颗粒在模拟其形成或应用环境的液体条件下的动态行为提供了新的视角。利用近期开发的加热型液体池，我们直接观察了温度对金纳米颗粒在水中成核与生长过程的影响。

温度控制是近期的一项进展，它通过液体池透射电子显微镜为研究纳米化学提供了额外的自由度。

温度控制是近年来的一项新进展，它通过液体池透射电子显微镜研究纳米化学过程提供了额外的自由度，特别是溶液中金纳米颗粒的形成过程。该方法能够在接近实际合成条件的环境下，对液体中单个纳米结构的动态行为进行成像，并精确调控环境的组成和温度。有趣的是，该方法还可通过模拟软物质或生物纳米材料在液体环境中的形成过程或应用介质，用于研究温度对其结构演化的影响。液体透射电子显微镜实验成功的关键因素在于样品制备的洁净程度，以及对电子束对纳米颗粒动力学影响的考量。在液体池制备过程中，首先在通风橱内将一个玻璃培养皿装入丙酮，另一个装入甲醇。将一小片和一大片 E-Chip 放入丙酮中浸泡两分钟，随后将两片芯片转移至甲醇中浸泡两分钟。甲醇清洗后，使用气枪和镊子将芯片干燥，并使用双目放大镜或光学显微镜检查氮化硅窗口的完整性。若芯片完好无损，用氩气和氧气的混合气体对E-Chip进行两分钟的等离子清洗，然后将垫圈O型环装入液体池支架中。将小型E-Chip放入液体池支架内，并在芯片上滴加约2 µL感兴趣的液体样品。使用裁剪锋利的滤纸，吸去芯片上多余的液体，直至液滴形成一个扁平的穹顶状，然后将大E-Chip正面朝下放置在小E-Chip上。将盖子重新滑入液体池支架中，并逐步拧紧每个螺丝。用滤纸吸去芯片上残留的多余液体，同时绕其轴线旋转液体池支架，确保所有液体均被吸除。在抽气站中测试液体池的真空密封性。当泵的真空度达到5 × 10⁻² Pa时，最后一次检查氮化硅窗口的完整性，然后将液体池样品杆装入显微镜。为建立流动模式，用目标溶液填充一支注射器，并将两根外部峰管连接至该注射器。将注射器置于注射泵上，并将外接峰管插入液体池支架的入口。为液体池支架的出口另接一根外接峰管。然后以每分钟5 µL的流速向每个入口注入溶液。为加热液体环境，打开加热软件并启动电源。单击“设备检查”按钮，然后打开“实验”选项卡。单击“手动”以激活手动加热模式，并根据实验需求选择目标温度以调整升温速率。然后点击“应用”以将E-Chip加热至目标温度。为了在STEM-HAADF模式下以良好的信噪比对辐射分解驱动形成的金纳米颗粒进行成像，请在观察窗口角落附近的样品区域中选择一个原始区域，该区域的液体厚度最小。记录成像条件，包括束斑大小、聚光镜光阑尺寸和放大倍数，以便后续校准照射到分析区域的电子剂量率和累积电子剂量。然后在不同温度下使用相同的成像条件采集纳米颗粒生长过程的视频。对于单个纳米颗粒的纳米衍射，先获取多个纳米物体的STEM-HAADF图像，然后使用STEMx软件采集图像中单个纳米颗粒的衍射图样。从这两组STEM-HAADF图像序列中可以观察到，在较低温度下可观察到大量小纳米颗粒形成的致密聚集体的生长过程。在高温条件下，可获得少量较大且晶面完整的纳米结构。由于STEM-HAADF图像的衬度与金纳米颗粒的厚度成正比，因此在这些生长实验中可观察到两类产物：一类是衬度较高的三维纳米颗粒，另一类是呈三角形或六边形的大尺寸二维纳米结构，其衬度较低。本方法所展示的自动化视频处理技术可用于测量纳米颗粒的成核速率与生长速率。在低温条件下，观察的几十秒内会形成超过 800 个纳米颗粒，而在高温条件下相同时间内仅形成 30 个纳米颗粒。相反，纳米颗粒的平均表面积在 85 摄氏度下的增长速度比在 25 摄氏度下快 40 倍。此处可观察到直接从典型 STEM 图像中选取的两个金纳米颗粒的衍射图样。可以观察到金的面心立方结构沿001和112晶带轴的取向长程视图。通过液相透射电子显微镜研究温度对纳米颗粒成核与生长的影响时，需要在相同电子剂量率下获取视频进行比较，因为辐射分解也会对纳米颗粒的形成产生影响。在打开液相池后，可进行离位的扫描电子显微镜或透射电子显微镜表征，以进一步分析纳米结构。温度可控的液体池透射电子显微镜为研究温度对固-液界面发生的多种化学反应的影响提供了可能，在材料科学、生命科学和地球科学领域开辟了众多研究途径。

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科研

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