使用微流体混合平台为基因传递制订和定性脂质纳米粒子

该协议可用于生产高可重复性、快速性和低体积的核酸封装脂质纳米粒子。可根据临床应用调整配方参数，实现所需的生物分布。微流体墨盒的标准鱼骨设计允许混合过程中快速、精确和可控的层流。

该方法可以扩展并生成均匀、高度封装的粒子。由于大多数商业认可的基因治疗产品都依赖于病毒方法，因此此程序可以提供基因传递的见解，因为它的非病毒方法允许重复剂量的应用是必要的。首先，将每个液体库存溶液的适当数量添加到具有间歇性涡流的玻璃瓶中。

如表所示，随后在最终卷的533微升中加入200种证明乙醇。然后加入适量的mRNA库存，用柠檬酸盐缓冲剂稀释，以达到1.5毫升的最终体积在所需的浓度。要调入微流体通道，请首先将原始参数输入表中概述的仪器软件中。

接下来，打开仪表盖，将微流体墨盒放入旋转块中。将至少 500 微升乙醇装入 1 毫升注射器中，注意注射器尖端没有气泡或气隙，并将注射器插入墨盒的右入口。装载一个5毫升注射器与1.5毫升的柠檬酸盐缓冲器，注意没有气泡或缝隙，并插入注射器到墨盒的左入口。

将两个 15 毫升圆锥形管放入夹架中，作为废容器，然后单击 Go"混合解决方案。当仪器停止按底部蓝光关闭指示启动时，打开后期并正确处理锥形管和注射器。对于脂质纳米粒子的形成，设置表中指示的适当配方参数，并加载一个 1 毫升注射器，并配有以前准备的脂质混合物。

去除注射器尖端的任何气隙或气泡，并将注射器插入墨盒的右侧。将先前准备好的核酸溶液加载到 3 毫升注射器中，注意注射器尖端没有气泡或空气间隙，并将注射器插入墨盒的左入口。将标有样品名称的 15 毫升无 RNAase 圆锥形管放入左管夹中，并将 15 毫升废圆锥体放在右管夹中。

关闭仪表盖并单击 Go.脂质和 mRNA 溶液将流经微流体墨盒，脂质纳米粒子溶液将收集在圆锥管中。在制剂过程结束时保留锥形管，然后用 5 毫升 PBS 和生物安全柜稀释脂质纳米粒子。要进行缓冲交换，首先用 2 毫升 PBS、离心机预洗 100 千达顿孔大小的超中心过滤器，然后从底部隔间清空 PBS。

将稀释的脂质纳米粒子添加到预洗超中心过滤器的顶部隔间中，进行三次离心机清洗，丢弃流经，并在前两次洗涤后将 5 毫升 PBS 添加到超中心滤芯中。最后一次清洗后，将脂质纳米粒子溶液对照超中心过滤器的墙壁进行几次，以尽量减少纳米粒子的损失，然后再将纳米粒子溶液转移到无核素瓶中。然后添加PBS，使纳米粒子悬浮达到适当的实验浓度和体积。

为了评估脂质纳米粒子的封装效率，首先准备PBS中工作核酸溶液的两倍连续稀释，以生成标准曲线，从每毫升500毫微克开始，至少稀释5次。接下来，准备PBS中的纳米粒子样品稀释，以达到围绕标准曲线中点的适当理论浓度。然后准备核糖核糖核酸绿色RNA试剂，通过混合适量的RNA试剂、Triton X100 和 PBS 来检测脂质纳米颗粒内外是否存在RNA。

然后，要检测液体纳米粒子外是否存在RNA，只需混合适量的RNA试剂和PBS。将核酸标准和脂质纳米粒子溶液的负载复制到具有黑色荧光能力的 96 井板中，然后添加等量的 RNA 定量试剂，并且没有 Triton X100 到标准和样品复制。在不受光线保护的室温下摇动板读卡器五分钟，以获得样品的彻底混合，然后以 480 纳米的激发波长和 520 纳米的发射波长测量微板读卡器上的荧光。

为了测量脂质纳米粒子的水动力学大小和多分散性，首先在PBS中稀释纳米粒子溶液40次，并将溶液添加到半微晶圆。将 cuvette 加载到齐塔西器上，并选择一个标准操作程序来设置仪器，根据纳米粒子的材料、分散剂、温度和细胞类型来测量纳米粒子。然后单击"开始"测量脂质纳米粒子的水动力大小和多分散性。

为了测量脂质纳米粒子的 Zeta 潜力，在无核酸易感水中稀释纳米粒子溶液 40 次，并将溶液加载到填充线的 cuvette 中。将 cuvette 加载到 Zeta 电位分析仪中，注意电极与仪器接触，并设置仪器根据脂质纳米粒子的特定组成测量 Zeta 电位。然后单击"开始"测量 Zeta 脂质纳米粒子的潜力。

在这项分析中，在不同的天开发了多批与脂质配方相同的脂质纳米粒子和胺与磷酸盐的比例，以证明该技术的可重复性。如所述，第一批和第二批表现出具有类似多分散性的重叠大小分布，在批次之间的大小或封装效率方面没有显著差异。通常，配方参数的变化会诱发一些小而具有统计学意义的差异。

例如，将胺与磷酸盐的比例降低会导致封装效率降低 4%，同时纳米粒子的水动力直径也随之增加。脂质纳米粒子配制的电油脂不同，但胺与磷酸盐的比例相同，在封装效率方面有显著变化，颗粒直径略有差异。与封装脂质纳米粒子的mRA相比，质粒DNA的封装导致更大的颗粒，尽管这两种类型的纳米粒子都表现出类似的封装效率。

然而，流速过程参数的变化不会影响脂质纳米粒子的发育。脂质纳米粒子应用良好，最近批准的COVID-19疫苗是最佳例子。该技术作为一个伟大的工具集，并通过允许下肢配方筛选为未来的应用铺平道路。