高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

本方案可实现小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞的高效分离与培养。健康的原代小鼠RPE细胞培养物是研究眼部疾病潜在机制的宝贵模型。在3天内即可获得融合且具有活性的RPE细胞培养物，并可维持培养数周。

该方案已成功用于研究早发性年龄相关性黄斑变性的发病机制，后者是发达国家老年人失明的最主要原因。准确呈现解剖步骤至关重要。操作细节对方案的成功极为关键，例如如何处理眼球以避免刺穿巩膜、具体应在何处进行切割，以及如何将眼杯浸入胰蛋白酶中以保持其开放状态。

首先准备该实验方案所需的所有试剂。然后，使用Dumont 5号镊子和弯头剪刀仔细清除眼球表面的所有结缔组织、血液和肌肉，注意不要损伤巩膜。将眼球定期转移至含有3 mL不含HEPES的HBSS缓冲液的新培养皿中，以保持眼球的新鲜与清洁，避免任何污染。

用视神经作为抓手握住眼球，并用锋利的碳钢11号刀片在角膜中央打一个孔。通过该孔用Dumont 5号剪刀在角膜上做三个切口，确保有足够的空间取出晶状体。握住视神经，用斜角剪刀的底部轻轻按压锯齿缘，直至晶状体完全脱出。

保持虹膜上皮完整，以防止在孵育过程中神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）脱落。将眼球置于不含HEPES的HBSS缓冲液中。在37摄氏度、5%二氧化碳充气的培养箱中，用透明质酸酶溶液孵育去晶状体的眼球45分钟，以使神经视网膜与视网膜色素上皮（RPE）分离。

将每只眼睛放入新的孔中，每孔加入1.5毫升冰冷的HBSS HEPES缓冲液，置于冰上孵育30分钟。清洗后，将每只眼睛转移至含新鲜HBSS HEPES缓冲液的35毫米培养皿中。使用8厘米Vannas剪刀沿原有切口剪开角膜，直至锯齿缘，然后在锯齿缘下方剪切，以去除虹膜上皮和角膜。

用弯头镊子夹住锯齿缘，使用斜角显微镊轻轻拉开神经视网膜，注意避免损伤视网膜色素上皮（RPE）层。随后，切断视网膜与视神经的内部连接。剪断视神经，并将每只眼球杯转移至不同的12孔板中，每孔预先加入1.5毫升新鲜的胰蛋白酶-EDTA溶液。

确保眼球杯保持张开状态并完全浸没在胰蛋白酶中。将眼球杯置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育45分钟。收集每个眼球杯以及在胰蛋白酶孵育过程中脱落的任何视网膜色素上皮（RPE）片层，转移至含有1.5毫升每孔胎牛血清（FBS）溶液的12孔板中。

如果视网膜色素上皮（RPE）细胞片仍留在胰蛋白酶溶液中，使用微量移液器将其转移至含FBS溶液的孔中。用手握住每个视杯的视神经部位，将其倒置振荡，放入含有1.5毫升20% FBS的HBSS HEPES缓冲液的12孔板中，直至RPE细胞片完全脱落。使用微量移液器收集所有RPE细胞片和RPE细胞簇，避免收集任何白色巩膜或脉络膜碎片，以免污染培养物，并将其放入15毫升离心管中。

从同一只小鼠中取出两只眼球置于同一管中。随后，将RPE混合物在室温下以340 × g离心两分钟，并弃去上清液。用1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA混合液轻轻重悬RPE沉淀，并在37摄氏度水浴中孵育一分钟，以将RPE细胞片分散为单个细胞。

然后轻柔吹打10次，避免产生气泡。加入9毫升 freshly prepared RPE 培养基以稀释并终止胰蛋白酶作用，随后在室温下以340 × g离心2分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀小心地重悬于150微升含5% FBS的RPE培养基中。

接下来，从先前制备的经层粘连蛋白包被的膜插件的下室中移除 PBS，并加入 700 微升 RPE 培养基。移除膜插件上室中的层粘连蛋白，将 RPE 细胞悬液逐滴均匀地接种至室的中央。将膜插件置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中，静置培养至少 24 小时。

然后在显微镜下检查膜插件，确保大部分视网膜色素上皮（RPE）细胞已贴附于插件上，且融合度至少达到50%。在最初72小时内不要更换培养基。采用本方案分离的RPE细胞表现出典型的RPE细胞大小、形态和色素沉着。一周后可观察到高度极化的RPE单层细胞，两个细胞核通过紧密连接相连，同时可见顶膜微绒毛和基底褶皱。

通过跨上皮电阻（TER）值确认RPE单层细胞的极化状态，其平均值高于200 ohms·cm²，并且随时间保持稳定。在使用FITC标记的牛POS进行的吞噬实验中，观察到POS被吞噬和消化，表明已形成具有功能性的融合RPE细胞单层。活性培养物需要较短的解剖时间，这一点可通过操作经验获得。

一些视网膜色素上皮（RPE）细胞可能仍附着在神经视网膜上，但如果有多片RPE细胞持续附着，则实验方案将无法成功。每次操作都必须使用新鲜的透明质酸酶，以避免此问题。这些具有功能性的原代小鼠RPE细胞培养物是研究多种眼病中RPE病理生物学机制的重要工具。

例如，本方案使得在年龄相关性黄斑变性的小鼠模型中研究视网膜色素上皮（RPE）的病理生物学成为可能。