Name: 原发性小鼠视网膜色素上皮细胞的有效解剖与培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学习小鼠视网膜色素上皮细胞的高效分离与培养方法，利用酶解处理在三天内获得融合单层细胞。该技术为研究眼部疾病机制和开发治疗策略提供了可靠的体外模型。

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本工作由马萨诸塞州眼耳医院的眼科基因组学研究所资助。

遵循了ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用声明的指南。
注意：该方法已在不同遗传背景的小鼠中证明有效，包括 C57BL/6J、B10.D2-Hco H2d H2-T18c/oSnJ 和白化小鼠，适用于不同年龄阶段。建议使用 8 至 12 周龄的小鼠以获取视网膜色素上皮（RPE）细胞。较年老小鼠的 RPE 细胞在培养中增殖能力较低，而较年轻小鼠的细胞数量较少且体积较小，因此需要合并来自不同个体的眼组织以获得可存活的培养物。
1. 试剂和膜插件的准备
<ol>
	<li>准备以下试剂。
	<ol>
		<li>制备 HBSS-H−（不含钙、不含镁的 HBSS 缓冲液 + 10 mM HEPES）：将 1 mL 的 1 M HEPES 加入 99 mL 的 HBSS-（不含 Ca/Mg）缓冲液中。4 °C 保存，最长可保存 1 个月。</li>
		<li>制备 HBSS-H+（含钙、含镁的 HBSS 缓冲液 + 10 mM HEPES）：将 1 mL 的 1 M HEPES 加入 99 mL 的 HBSS+（含 Ca/Mg）缓冲液中。4 °C 保存，最长可保存 1 个月。</li>
		<li>制备透明质酸酶溶液（1 mg/mL）：将 10 mg 透明质酸酶加入 10 mL 的 HBSS-H− 中，并使用 10 mL 注射器通过 0.4 µm 无菌注射器滤器过滤。使用前新鲜配制，并在室温（RT；20–25 °C）下放置。</li>
		<li>制备 FBS 溶液：将 20% FBS 与 HBSS-H+ 混合。将 2 mL FBS 加入 8 mL HBSS-H+ 中。使用前新鲜配制。</li>
		<li>制备 RPE 培养基：在 α MEM 中加入 N1 培养基添加剂 1/100（v/v）、谷氨酰胺 1/100（v/v）、青霉素-链霉素 1/100（v/v）、非必需氨基酸溶液 1/100（v/v）、氢化可的松（20 µg/L）、牛磺酸（250 mg/L）和三碘甲腺原氨酸（0.013 µg/L），并添加 5% FBS 或不含 FBS1,23,24。如需要，FBS 可进行热灭活；但未观察到显著差异。RPE 分离时需新鲜配制。用于细胞培养维持时，4 °C 保存，最长可保存 1 个月。</li>
		<li>制备胰蛋白酶-EDTA：将新鲜胰蛋白酶-EDTA（0.25%）分装成小份单次使用量（约 8 mL），于 -20 ᵒC 冻存。每次使用前在室温下解冻。避免反复冻融。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备膜插件（例如 Transwell 插件）。
	<ol>
		<li>将 6.5 mm 膜插件在 37 °C、5% CO2 培养箱中用 RPE 培养基平衡至少 30 分钟。每两只小鼠眼球来源的 RPE 细胞使用一个膜插件进行接种。</li>
		<li>孵育后，将下室中的培养基更换为 700 µL 的 PBS。</li>
		<li>移除上室中的培养基，并在膜插件上加入 100 µL 浓度为 10 µg/mL 的小鼠层粘连蛋白（溶于 PBS），在室温下包被至少 2 小时（较短的孵育时间可能导致细胞在插件上的贴附不良）。</li>
		<li>额外包被一个膜插件，用于 TER 测量时作为空白对照。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 小鼠眼球的解剖与去核
<ol>
	<li>通过将小鼠放入 CO2 室并以每分钟30-70%腔室体积的充气速率缓慢释放 CO2，使小鼠因 CO2 窒息安乐死。</li>
	<li>将带锯齿的斜头显微镊分别置于小鼠眼睛两侧，轻轻按压以使眼球突出（摘除眼球）。</li>
	<li>闭合夹住眼球的镊子，然后在前后移动的同时轻柔牵拉，将整个眼球连同视神经从眼外肌中分离，确保巩膜上无残留结缔组织。</li>
	<li>将摘除的眼球用70%乙醇冲洗，然后置于六孔板的一个孔中，加入3 mL 冰上预冷的 HBSS-H−。</li>
	<li>重复步骤2.2至2.4以摘除小鼠的另一只眼球。所有操作应在30分钟内完成。 
	注意：建议在积累一定经验前，每次仅处理两只眼球。</li>
</ol>
3. 视网膜色素上皮（RPE）的收集
注意：以下步骤需在层流罩内的无菌条件下进行。为避免在冰上孵育时间过长导致视网膜色素上皮（RPE）细胞死亡，每次收集的眼球不得超过两个。
<ol>
	<li>使用解剖体视显微镜、Dumont #5 镊子和弯头剪刀，小心清除附着在眼球上的所有结缔组织、血液和肌肉，注意不要切破巩膜。根据需要定期更换 3 mL HBSS-H− 缓冲液，以保持眼球新鲜清洁，避免污染 RPE 培养物。</li>
	<li>以视神经作为手柄固定眼球，用锋利的碳钢 #11 刀片在角膜中央打一个小孔。</li>
	<li>使用 Dumont #5 剪刀通过上述小孔在角膜上做三个切口，确保有足够的空间取出晶状体。</li>
	<li>握住视神经，用弯头剪刀的底部轻轻按压锯齿缘，直至晶状体完全脱出。保留虹膜上皮，以防止在孵育过程中神经视网膜和 RPE 脱落。将眼球放入 HBSS-H 缓冲液中。</li>
	<li>重复步骤 3.1–3.4 以解剖第二只眼球。</li>
	<li>将无晶状体的眼球置于含透明质酸酶溶液的 12 孔板中，在 37 °C、5% CO2 恒温培养箱中孵育 45 分钟（每孔 1.5 mL），以使神经视网膜与 RPE 分离。</li>
	<li>将每个眼球转移至新的孔中，每孔加入 1.5 mL 冷的 HBSS-H+ 缓冲液，在冰上孵育 30 分钟，以终止透明质酸酶活性。孵育时间不得超过 45 分钟。</li>
	<li>清洗后，将每个眼球放入含新鲜 HBSS-H+ 缓冲液的 35 mm 培养皿中，使用 8 cm Vannas 剪刀沿原有切口剪开角膜，直至锯齿缘&#160;。然后，在锯齿缘下方剪开，以去除虹膜上皮和角膜。</li>
	<li>用弯头镊子夹住眼杯边缘/锯齿缘，使用弯头显微镊子小心剥离神经视网膜，确保不损伤 RPE 层。随后剪断视神经处的内部连接。若部分 RPE 细胞仍附着于神经视网膜上，可适当延长孵育时间，但总时间不得超过 45 分钟。</li>
	<li>剪断视神经，将每个眼杯转移至另一块 12 孔板中，每孔含 1.5 mL 新鲜胰蛋白酶-EDTA 溶液。确保眼杯保持张开状态并完全浸没在胰蛋白酶中。在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 45 分钟。</li>
	<li>收集每个眼杯以及在胰蛋白酶孵育过程中脱落的任何 RPE 片段，转移至另一块 12 孔板中，每孔含 1.5 mL 胎牛血清（FBS）溶液。若 RPE 片段仍留在胰蛋白酶溶液中，使用微量移液器将其转移至含 FBS 溶液的孔中。</li>
</ol>
4. 小鼠原代RPE细胞的分离
<ol>
	<li>用手握住每个眼球杯的视神经部分，将其倒置并轻轻摇晃，放入含有1.5 mL含20%胎牛血清（FBS）的HBSS-H+的12孔板中，直至视网膜色素上皮（RPE）层完全脱落。</li>
	<li>使用微量移液器收集所有RPE层片和RPE细胞团块，并转移至15 mL离心管中。避免混入任何白色巩膜或脉络膜组织碎片，以防污染培养物。将同一只小鼠的两个眼球样本合并至同一离心管中。</li>
	<li>在室温下以340 × g 离心2分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA轻柔重悬RPE沉淀，在37 °C水浴中孵育1分钟，使RPE层片解离为单个细胞。孵育后，用移液器轻柔吹打10次，注意移液过程中避免产生气泡。</li>
	<li>加入9 mL新配制的RPE培养基以稀释并终止胰蛋白酶活性，随后在室温下以340 × g 离心2分钟。</li>
	<li>吸除上清液，使用微量移液器将细胞沉淀轻柔重悬于150 µL含5% FBS的RPE培养基中，确保细胞均匀悬浮，且移液过程中避免产生气泡。</li>
	<li>取步骤1.2中制备的经层粘连蛋白包被的膜插件，移除底部腔室中的PBS，并加入700 µL RPE培养基。</li>
	<li>移除膜插件上腔室中的层粘连蛋白，将RPE细胞悬液以滴加方式均匀地分布于腔室中央，注意移液过程中避免产生气泡。</li>
	<li>将膜插件置于37 °C、5% CO2的培养箱中，静置至少24小时，期间避免扰动。</li>
	<li>24小时后，在显微镜下检查膜插件，确认大部分RPE细胞已贴壁，融合度至少达到50%（图1A）。在最初72小时内不得更换培养基，这一点至关重要。</li>
</ol>
5. 极化RPE单层的培养
<ol>
	<li>分离的RPE细胞在培养中至少维持72小时后再更换RPE培养基，以确保细胞充分贴壁。接种时细胞融合度达到50%或以上，是形成合适极化RPE单层的关键。</li>
	<li>细胞贴壁后，每周更换两次新鲜且预热的RPE培养基（步骤1.1.5）。在培养最初的72小时后，可从培养基中去除血清。 
	&#8203;注意：培养一周后，细胞应达到融合状态，呈六边形、双核、有色素沉着并具有极性（图1B），每6.5 mm Transwell小室的细胞数量约为50,000个。培养两周后，可观察到由健康细胞组成的RPE单层。RPE培养物表现出顶端微绒毛、基底褶皱和紧密连接（图1C）。</li>
</ol>
6. TER 测量
注意：培养 RPE 细胞至少 4 天后进行 TER 测量，以确保 RPE 单层细胞具有良好的完整性和极化状态。
<ol>
	<li>用70%乙醇清洁伏特欧姆计的电极，并小心擦干。</li>
	<li>从培养箱中取出Transwell小室，在3分钟内完成经上皮电阻（TER）测量，以避免因温度波动导致测量值变化。测量TER时，将伏特欧姆计的短电极浸入上室，长电极浸入膜插件的下室。避免接触视网膜色素上皮（RPE）单层细胞，以防细胞脱落。</li>
	<li>计算TER时，先从样品读数中减去空白值（即涂有层粘连蛋白但无细胞的膜插件）的读数，再将所得数值（单位为欧姆）乘以膜插件的表面积（对于6.5 mm膜插件，表面积为0.33 cm2）。培养72小时后，结果应至少达到200 Ω × cm2；两周后TER值应高于400 Ω × cm2。TER值偏低的RPE培养物应予以弃用。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

尽管此前已开发出多种小鼠RPE细胞分离与培养方法1,13,20,22,26,27，但Fernandez-Godino的方法首次采用膜插件，使RPE细胞在体外培养中可高效生长数周1,9。该方案的另一重大改进1,9是使用酶解溶液替代机械剥离法来解离RPE细胞1,13,<sup cl...

本方案最初由Fernandez-Godino等人于2016年报道1，描述了一种高效分离和培养小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，该方法可在Transwell板上于一周内形成具有功能性和极性的RPE单层细胞。&#160;视网膜色素上皮&#160;位于眼球内神经视网膜与布鲁赫膜之间的一层单层结构。该单层由高度极化且富含色素的上皮细胞构成，细胞间通过紧密连接相连，呈六边形排列，形似蜂巢2尽管视网膜色素上皮（RPE）在组织学结构上看似简单，但它执行着多种对视网膜和正常视觉循环至关重要的功能2,3,4RPE单层的主要功能包括光吸收、为光感受器提供营养和更新、清除代谢终产物、调控视网膜下腔的离子稳态以及维持血-视网膜屏障2,3视网膜色素上皮（RPE）在眼部免疫系统的局部调节中也具有重要作用5,6,7,8,9,10,11视网膜色素上皮（RPE）的变性及/或功能障碍是多种眼部疾病共有的特征，例如视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙、白化病、糖尿病视网膜病变和黄斑变性。12,13,14,15遗憾的是，人体组织的可获取性有限。由于小鼠与人类具有高度保守的遗传同源性，小鼠模型成为研究眼病的合适且有用的工具16,17,18,19此外，使用培养的原代RPE细胞具有多种优势，例如可进行基因操作和药物筛选，从而加速针对这些威胁视力疾病的新型疗法的开发。9,11.
现有的小鼠RPE分离与培养方法缺乏可重复性，且无法再现RPE的特征 体内 具有足够的可靠性。细胞在培养数天后 tends to 失去色素沉着、六边形形态以及跨上皮电阻（TER）13, 20由于从小鼠建立原代RPE细胞培养是一项具有挑战性的过程，本优化方案基于已有的大鼠和人眼RPE细胞分离方案而制定21,22,23 解剖小鼠眼球，收集视网膜色素上皮（RPE），并培养小鼠RPE细胞 体外

<table><tbody><tr><td>10 ml BD Luer-Lok 尖端注射器，一次性</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>VWR International</td><td>21008-103</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>VWR International</td><td>21008-951</td><td></td></tr><tr><td>Alpha 最低必需培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526-500ML</td><td></td></tr><tr><td>弯头显微镊子</td><td>WPI</td><td>501727</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Thermo</td><td>HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V</td><td></td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液，无钙，无镁</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 45&amp;deg; 医用生物学镊子，尖端 0.05 x 0.01 mm，长度 11 cm</td><td>WPI</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 易握透明聚苯乙烯细胞培养皿，35 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>经热灭活处理</td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液，含钙和镁，无酚红</td><td>Life Technologies</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s 平衡盐溶液，含钙和镁，无酚红 B6</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3506 1G</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0396</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>Thermo</td><td>CLASS II A2 4 115V PACKAGECLA</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白 1 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020-1 MG</td><td>在 37°C 下用 PBS 稀释至 1 mg/ml</td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 微型剪刀，长 8 cm</td><td>WPI</td><td>503216</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸 100X</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>N1 添加剂 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530-5ML</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>无菌 Bard-Parker 碳钢手术刀片，尺寸 11</td><td>Fisher-Scientific</td><td>08-914B</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-0625</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理的 12 孔板</td><td>Fisher-Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>组织培养处理的 6 孔板</td><td>Fisher-Scientific</td><td>14-832-11</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 支持膜，6.5 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>三碘甲腺原氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-5516</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)，含酚红</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>镊子，Dumont #5 医用生物学，11 cm，弯头，不锈钢，尖端 0.02 x 0.06 mm Mod</td><td>WPI</td><td>500232</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀，长 8 cm，不锈钢</td><td>WPI</td><td>501790</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 25 mm 注射器滤器，孔径 0.45&amp;mu;m</td><td>Fisher-Scientific</td><td>6780-2504</td><td></td></tr></tbody></table>

高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

Efficient Dissection and Culture of Primary Mouse Retinal Pigment Epithelial Cells

眼部疾病影响着全球数百万人，但人类组织样本的有限可及性严重阻碍了相关研究。由于小鼠在解剖结构和生理特性上与人类具有高度相似性，因此小鼠模型成为研究眼病病理生理机制的有力工具。视网膜色素上皮（RPE）的改变，包括形态和功能的变化，是多种眼部疾病共有的特征。然而，原代小鼠RPE细胞的成功分离与培养极具挑战性。本文是对Fernandez-Godino等人于2016年发表的实验方案所更新的视听版本，旨在高效地分离和培养原代小鼠RPE细胞。该方法具有高度可重复性，能够获得结构完整、极性良好且富含色素的RPE单层细胞，可在Transwell小室中稳定维持数周。该模型为研究眼病背后的分子与细胞机制开辟了新的途径，同时也为测试可用于治疗目前尚无有效疗法的重要眼病（包括遗传性视网膜病变和黄斑变性）的治疗策略提供了平台。

本方案已用于从基因修饰小鼠中分离和培养视网膜色素上皮（RPE）细胞1。在不同小鼠品系或性别之间未观察到差异。该研究结果有助于理解与年龄相关性黄斑变性等眼部疾病机制相关的某些重要方面，后者是老年人视力丧失的最常见原因9。按照本方案分离的RPE细胞在接种后24小时已完全贴附于膜插件上，并在72小时后表现出典型的RPE细胞大小、形态和色素沉积1。一周后，由呈六边形、含色素的RPE细胞形成高度极化的单层RPE细胞层，细胞间通过表达ZO-1的紧密连接相连，且可见双核结构（图1C、2）。透射电子显微镜图像显示细胞具有顶端微绒毛和基底褶皱结构（图1C）。RPE单层细胞的极性通过跨上皮电阻（TER）值得以确认，其平均值高于200 Ω×cm2，且随时间保持稳定（图2）。
通过吞噬作用实...

本方案最初由 Fernandez-Godino 等人于 2016 年报道1，描述了一种高效分离和培养小鼠 RPE 细胞的方法，这些细胞在 Transwell 培养板上一周内即可形成具有功能性和极性的 RPE 单层。该操作过程约需 3 小时。

眼部疾病影响全球数百万人，但人类组织样本的匮乏限制了相关研究。小鼠模型是研究这些疾病的重要工具。

本方案可实现小鼠视网膜色素上皮（RPE）细胞的高效分离与培养。健康的原代小鼠RPE细胞培养物是研究眼部疾病潜在机制的宝贵模型。在3天内即可获得融合且具有活性的RPE细胞培养物，并可维持培养数周。该方案已成功用于研究早发性年龄相关性黄斑变性的发病机制，后者是发达国家老年人失明的最主要原因。准确呈现解剖步骤至关重要。操作细节对方案的成功极为关键，例如如何处理眼球以避免刺穿巩膜、具体应在何处进行切割，以及如何将眼杯浸入胰蛋白酶中以保持其开放状态。首先准备该实验方案所需的所有试剂。然后，使用Dumont 5号镊子和弯头剪刀仔细清除眼球表面的所有结缔组织、血液和肌肉，注意不要损伤巩膜。将眼球定期转移至含有3 mL不含HEPES的HBSS缓冲液的新培养皿中，以保持眼球的新鲜与清洁，避免任何污染。用视神经作为抓手握住眼球，并用锋利的碳钢11号刀片在角膜中央打一个孔。通过该孔用Dumont 5号剪刀在角膜上做三个切口，确保有足够的空间取出晶状体。握住视神经，用斜角剪刀的底部轻轻按压锯齿缘，直至晶状体完全脱出。保持虹膜上皮完整，以防止在孵育过程中神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）脱落。将眼球置于不含HEPES的HBSS缓冲液中。在37摄氏度、5%二氧化碳充气的培养箱中，用透明质酸酶溶液孵育去晶状体的眼球45分钟，以使神经视网膜与视网膜色素上皮（RPE）分离。将每只眼睛放入新的孔中，每孔加入1.5毫升冰冷的HBSS HEPES缓冲液，置于冰上孵育30分钟。清洗后，将每只眼睛转移至含新鲜HBSS HEPES缓冲液的35毫米培养皿中。使用8厘米Vannas剪刀沿原有切口剪开角膜，直至锯齿缘，然后在锯齿缘下方剪切，以去除虹膜上皮和角膜。用弯头镊子夹住锯齿缘，使用斜角显微镊轻轻拉开神经视网膜，注意避免损伤视网膜色素上皮（RPE）层。随后，切断视网膜与视神经的内部连接。剪断视神经，并将每只眼球杯转移至不同的12孔板中，每孔预先加入1.5毫升新鲜的胰蛋白酶-EDTA溶液。确保眼球杯保持张开状态并完全浸没在胰蛋白酶中。将眼球杯置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育45分钟。收集每个眼球杯以及在胰蛋白酶孵育过程中脱落的任何视网膜色素上皮（RPE）片层，转移至含有1.5毫升每孔胎牛血清（FBS）溶液的12孔板中。如果视网膜色素上皮（RPE）细胞片仍留在胰蛋白酶溶液中，使用微量移液器将其转移至含FBS溶液的孔中。用手握住每个视杯的视神经部位，将其倒置振荡，放入含有1.5毫升20% FBS的HBSS HEPES缓冲液的12孔板中，直至RPE细胞片完全脱落。使用微量移液器收集所有RPE细胞片和RPE细胞簇，避免收集任何白色巩膜或脉络膜碎片，以免污染培养物，并将其放入15毫升离心管中。从同一只小鼠中取出两只眼球置于同一管中。随后，将RPE混合物在室温下以340 × g离心两分钟，并弃去上清液。用1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA混合液轻轻重悬RPE沉淀，并在37摄氏度水浴中孵育一分钟，以将RPE细胞片分散为单个细胞。然后轻柔吹打10次，避免产生气泡。加入9毫升 freshly prepared RPE 培养基以稀释并终止胰蛋白酶作用，随后在室温下以340 × g离心2分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀小心地重悬于150微升含5% FBS的RPE培养基中。接下来，从先前制备的经层粘连蛋白包被的膜插件的下室中移除 PBS，并加入 700 微升 RPE 培养基。移除膜插件上室中的层粘连蛋白，将 RPE 细胞悬液逐滴均匀地接种至室的中央。将膜插件置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳的培养箱中，静置培养至少 24 小时。然后在显微镜下检查膜插件，确保大部分视网膜色素上皮（RPE）细胞已贴附于插件上，且融合度至少达到50%。在最初72小时内不要更换培养基。采用本方案分离的RPE细胞表现出典型的RPE细胞大小、形态和色素沉着。一周后可观察到高度极化的RPE单层细胞，两个细胞核通过紧密连接相连，同时可见顶膜微绒毛和基底褶皱。通过跨上皮电阻（TER）值确认RPE单层细胞的极化状态，其平均值高于200 ohms·cm²，并且随时间保持稳定。在使用FITC标记的牛POS进行的吞噬实验中，观察到POS被吞噬和消化，表明已形成具有功能性的融合RPE细胞单层。活性培养物需要较短的解剖时间，这一点可通过操作经验获得。 一些视网膜色素上皮（RPE）细胞可能仍附着在神经视网膜上，但如果有多片RPE细胞持续附着，则实验方案将无法成功。每次操作都必须使用新鲜的透明质酸酶，以避免此问题。这些具有功能性的原代小鼠RPE细胞培养物是研究多种眼病中RPE病理生物学机制的重要工具。例如，本方案使得在年龄相关性黄斑变性的小鼠模型中研究视网膜色素上皮（RPE）的病理生物学成为可能。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

原发性小鼠视网膜色素上皮细胞的有效解剖与培养

视网膜色素上皮（RPE）是眼部一种具有多种功能的上皮组织。本文介绍一种从小鼠RPE中建立原代细胞培养的实验方案。...

小鼠视网膜色素上皮原代细胞培养

该方案描述了小鼠器官型外植体的制备方法 神经视网膜，与视网膜色素上皮（RPE）共同培养于R16定义培养基中，该培养基不含血清和抗生素。与传统方法相比，该方法操作相对简便、成本较低且耗时较少。 体内...

长期无血清培养具有完整视网膜色素上皮的小鼠视网膜组织外植体

本文描述了一种从小鼠眼球中逐步分离视网膜色素上皮（RPE）细胞的简化方案。该方案包括小鼠眼球的摘除与解剖，随后进行RPE细胞的分离、接种与培养。...

原代小鼠视网膜色素上皮细胞的分离

一种易于操作的原代猪视网膜色素上皮细胞培养方法 体外 被展示。...

猪视网膜色素上皮细胞的原代培养

本文描述了一种从小鼠眼球中分离视网膜胶质穆勒细胞的详细实验方案。该方案从小鼠眼球的摘除和解剖开始，随后进行穆勒细胞的分离、接种和培养。...

原代小鼠视网膜胶质穆勒细胞的分离

视网膜色素上皮（RPE）在脉络膜和视网膜之间起着至关重要的屏障作用，有助于维持视网膜细胞类型（如光感受器细胞）的健康与功能。本文中，我们描述了一种简单且有效的成年小鼠RPE分离与培养方案。...

一种简化的小鼠成年视网膜色素上皮细胞分离与培养方法

本文介绍了一种从新生Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离原代视网膜穆勒细胞的详细方案。该操作流程包括眼球摘除、视网膜组织解剖、细胞提取与鉴定，以及后续细胞培养的关键注意事项。...

从Sprague-Dawley（SD）大鼠中分离与原代培养视网膜Müller细胞

输卵管（FT）被认为是浆液性卵巢癌（SOC）的另一个起源部位。本方案描述了一种用于分离和培养输卵管上皮细胞的新型方法。 离体 输卵管上皮细胞的培养。该系统可重现 体内...

离体 原代人输卵管上皮细胞的培养

本文介绍了一种从小鼠胰腺中快速、便捷地分离和培养原代胰腺腺泡细胞的方法。该方法为研究新鲜原代正常/未转化的外分泌胰腺细胞的生理学特性提供了一种有价值的途径。...

小鼠原代胰腺腺泡细胞的分离与培养

对人类诱导多能干细胞（iPS细胞）、由人类诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿视网膜色素上皮细胞（fetal...

人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microRNA表达谱

学习小鼠视网膜色素上皮细胞的高效分离与培养方法，利用酶解处理在三天内获得融合单层细胞。该技术为研究眼部疾病机制和开发治疗策略提供了可靠的体外模型。

高效分离与原代培养小鼠视网膜色素上皮细胞

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