使用 scRNA-Seq 和 scATAC-Seq 对视网膜基因表达和染色质可及性进行多重分析
March 12th, 2021
在这里，作者展示了MULTI-seq用于表型的效用，以及随后配对的scRNA-seq和scATAC-seq在表征视网膜转录组和染色质可及性图谱方面的效用。
该协议将使使用单细胞RNA-seq进行初始表型分析成为可能。并且，当与单细胞ATAC-seq配对时，基因调控网络的重建。使用MULTI-seq可降低初始研究的成本，并且固定单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq的配对样品可以对基因调控网络进行时程分析。
研究人员可以利用该协议来了解控制发育和疾病进展的遗传网络。首先，向每个样品中加入20微升锚定条形码溶液，然后移液混合。在冰上孵育五分钟。
然后向每个样品中加入20微升共锚溶液，并在冰上再孵育五分钟。向每个样品中加入一毫升冰冷的1%BSA和PBS，并在4摄氏度下以300×g离心细胞5分钟。在不干扰细胞沉淀的情况下除去上清液。
然后加入400微升冰镇1%BSA和PBS。在 300 x g 下在 4 摄氏度下离心五分钟。使用血细胞计数器确定每个样品的细胞浓度，并计算凝胶珠乳液或GEM所需的细胞总数和体积。
将每个样品的计算体积合并到新的无菌1.5毫升管中，并确定合并样品的最终细胞浓度。在GEM生成和条形码后，使用大小选择进行基因表达cDNA纯化，确保不要丢弃第一轮选择中的上清液，其中包含样品条形码。将上清液转移到新的无菌1.5毫升微量离心管中并将其储存在冰上。
涡旋基于顺磁珠的尺寸选择试剂，并向上清液中加入260微升试剂和180微升100%异丙醇。将混合物移液 10 次，并在室温下孵育 5 分钟。将试管放在磁性架上，等待溶液清除。
溶液澄清后，取出并丢弃上清液。向珠中加入500微升80%乙醇30秒，然后弃去上清液。重复此操作，总共洗涤两次。
短暂离心珠子并将它们放回磁性架。将计时器设置为两分钟。然后用P10移液管除去残留的乙醇，并在磁性架上风干珠子剩余的两分钟。
从磁性架上取出磁珠，并将其重悬于100微升洗脱缓冲液中。彻底移液以重悬，并在室温下孵育两分钟，然后将磁珠放回磁性架并等待溶液清除。将上清液转移到新鲜的1.5毫升微量离心管中。
如图所示重复净化，使用一半体积的洗脱缓冲液。对于用于scATAC序列的样品，使用P200移液管从微量离心管中取出任何液体，并在乙醇干冰中快速冷冻样品。要解离用于scRNA测序的样品中的细胞，请使用木瓜蛋白酶执行解离步骤，如文本手稿中所述。
在室温下以300×g离心细胞三分钟，并在不破坏细胞沉淀的情况下除去上清液。加入一毫升冷藏的PBS，混合10次或直到细胞完全悬浮。再次，在4摄氏度下以300×g离心五分钟，然后用PBS重复洗涤两次。
开始以最低速度设置涡旋试管，并逐滴加入900微升冷冻甲醇，同时继续轻轻涡旋试管以防止细胞结块。将细胞在冰上孵育15分钟。使用血细胞计数器确定固定细胞的浓度，并使用台盼蓝评估固定步骤的功效。
将冷冻组织和固定细胞储存在零下80摄氏度。多序列条形码可实现多个样品的组合测序及其随后的计算反卷积。可以根据每个单元格的条形码表达确定其原产地样本。
这些组合样本可以作为单个数据集进行分析，用于细胞聚类和细胞类型鉴定。由于每个细胞在GEM生成之前都有条形码，因此细胞双联体很有可能显示多个MULTI序列条形码的表达，因此可以在聚类和细胞类型鉴定之前识别和去除大多数双峰。单细胞ATAC测序可用于生成具有与单细胞RNA测序发现的细胞类型相匹配的细胞类型的数据集。
单细胞RNA测序基因表达和单细胞ATAC测序DNA可及性信息的配对能够重建基因调控网络。尝试实验方案时，请记住，民族醇蒸发的两分钟时间对于后续洗脱步骤中的序列检索至关重要。使用配对的单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq重建基因调控网络，为基因过表达和敲除研究产生靶标。
MULTI-seq可以在此阶段用于鉴定细胞类型特异性效应。
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概述
本研究展示了MULTI-seq在表型分析中的应用，随后通过配对单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞ATAC测序（scATAC-seq）来表征视网膜细胞的转录组和染色质可及性。该方法允许进行具有成本效益的初步调查，同时能够分析基因调控网络随时间的变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因组学
- 细胞生物学
背景
- 单细胞RNA-seq用于初步表型分析。
- 与单细胞ATAC-seq配对能够重建基因调控网络。
- MULTI-seq降低了初步调查的成本。
- 允许基因调控网络的时间序列分析。
研究目的
- 理解控制发育的基因网络。
- 通过细胞视角研究疾病进展。
- 利用成本效益高的方法进行高通量测序。
使用的方法
- 使用了单细胞RNA-seq和单细胞ATAC-seq平台。
- 专注于视网膜细胞反应。
- 采用了关键步骤，包括孵育、离心和多重条形码编码。
- 详细说明了样品准备、固定和测序步骤。
主要结果
- 展示了scRNA-seq和scATAC-seq的有效配对用于全面的分析。
- 识别了视网膜样品中基因表达和染色质可及性的调整。
- 提供了关于发育和疾病过程中基因调控网络动态的见解。
结论
- 本研究增进了对视网膜细胞基因调控网络的理解。
- 直接为阐明发育和疾病相关机制做出贡献。
- 突出了使用MULTI-seq进行高通量单细胞分析的实际应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding retinal gene regulatory networks is critical for identifying therapeutic targets in ocular diseases. The integration of scRNA-seq and scATAC-seq enables mechanistic de-risking by linking chromatin accessibility to transcriptional output. This approach supports target validation and predictive confidence in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through paired gene expression and chromatin accessibility profiling.
- Operational Value: Supports biological de-risking by clarifying regulatory mechanisms in retinal cell types.
- Predictive Value: Identifies targets for overexpression and knockout studies to validate functional relevance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates matched molecular readouts for compound screening in disease-relevant retinal models.
- Operational Value: MULTI-seq barcoding increases experimental throughput and reduces cost per sample.
- Scalability: Enables time-course analysis of gene regulatory networks across developmental or disease stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by profiling retinal cells across conditions.
- Operational Value: Fixation and barcoding steps allow sample preservation and multi-sample coordination.
- Translational Continuity: Supports biomarker alignment by linking chromatin states to cell-type-specific expression.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification, enabling hypothesis testing and pathway clarification before compound screening.
- Discovery Biology: Supports reconstruction of gene regulatory networks to clarify mechanism of action.
- Screening: Prepares standardized, barcoded retinal cell systems for reliable compound evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of gene expression and chromatin accessibility for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through matched multi-omic profiles.
- Enterprise Reuse: MULTI-seq enables cost-effective sample multiplexing across projects and time points.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic linkage of epigenomic and transcriptomic states.
- Operational Value: Standardization via fixation, barcoding, and cleanup protocols ensures reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by reducing ambiguity in target biology.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of retinal targets based on regulatory network activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell genomics and retinal tissue dissociation.
- Depends on access to scRNA-seq and scATAC-seq platforms and magnetic bead-based size selection.
- Necessitates cross-team standardization for barcode design and sample handling.
- Involves adaptation considerations for fixation efficiency across retinal cell types.
- Limited by doublet formation risk if barcode separation is insufficient during elution.
