Name: 线粒体疾病脑 膜炎基因 模型中量化动物活动的实验方法比较分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 了解两种半自动化检测方法，用于量化秀丽隐杆线虫的运动活性，并应用于线粒体疾病模型和药物筛选。这些方法具有高效、可重复和可扩展的特点，支持中等通量和高通量实验设计。

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我们感谢Anthony Rosner博士在本项目早期筹备过程中提供的组织支持，同时感谢Erin Haus对方案分析所作的贡献。本研究由Juliet's Cure FBXL4线粒体疾病研究基金、Jaxson Flynt C12ORF65研究基金以及美国国立卫生研究院（R01-GM120762、R01-GM120762-08S1、R35-GM134863和T32-NS007413）资助。本内容仅由作者负责，不代表资助方或美国国立卫生研究院的官方观点。

1. 使用 ZebraLab 软件在载玻片上的液体培养基中分析线虫运动活性
<ol>
	<li>线虫的培养与操作
	<ol>
		<li>培养 秀丽隐杆线虫 在含有线虫生长培养基（NGM）并涂布有 大肠杆菌 以OP50作为食物来源。按照先前所述方法，在20 °C条件下维持线虫培养8.</li>
		<li>同步线虫进行定时产卵52 在目标发育阶段研究线虫。本方案中分析了L4期线虫。</li>
		<li>在含有或不含待测药物处理或缓冲液对照的NGM平板上培养对照和突变线虫品系。为评估药物处理效果，将所需浓度的药物储备液配制于S.基础溶液中；将计算好的特定体积药物溶液均匀涂布于NGM平板表面，待其干燥。将处于特定幼虫期或成虫期的线虫转移至含药物的处理平板，并在分析前维持培养所需时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于运动活性视频记录及ZebraLab分析的蠕虫实验装置
	<ol>
		<li>每种菌株和条件下，使用线虫挑取工具挑选5条同步化的L4期线虫。用移液器将20 µL S. 基础溶液滴加到置于体视显微镜（连接摄像头）下的玻璃载片上，将5条线虫转移至液滴中（图1A，B）。将5条线虫从含有NGM的培养皿中转移至 E. coli 仅在记录前的瞬间将OP50加入液体滴中。 
		注意：在录制完之前的视频之前，继续将其他线虫保留在培养皿中。这可以避免在操作过程中（干燥时间约15-20分钟）因20 µl液滴干燥而导致其他线虫受损。</li>
		<li>在一张载玻片上用移液器滴加多个液滴，以获得多个技术重复（图1A). 从不同的NGM平板中选取线虫（生物学重复）。不要使用盖玻片。</li>
		<li>调整显微镜的工作距离，以观察单个液滴的完整区域。设置并保持低视频分辨率（&#60;1024 x 768）以在软件中上传文件。</li>
		<li>让线虫在载玻片上于室温下适应1分钟，然后开始记录。</li>
		<li>以每秒15帧（fps）的速度记录一滴液滴中线虫游泳活动1分钟。对培养板上每一份额外的液滴重复进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>秀丽隐杆线虫 在ZebraLab软件中进行运动活动记录分析
	<ol>
		<li>使用该选项 ZEBRALAB AVI 上传视频至软件。点击该选项 使用 AVI 文件进行量化&#160;(图1C).</li>
		<li>要创建新方案，请选择 文件 &#62; 生成实验方案，然后输入用于分析的区域数量。选择 位置计数：1.</li>
		<li>开放 实验方案参数 并选择 1 分钟 在 实验时长 窗口。为不同的实验时长选择相应的实验持续时间。选择或取消选择该窗口 无时间区间 并选择 整合期，取决于所需的数据输出。在本研究中 无时间区间 被选中（图1D). 
		&#8203;注意：时间窗是指对活动进行平均所取的时间范围。</li>
		<li>如果已有创建的方案，请选择 开放实验方案 并选择已保存的协议（.vte 格式）。</li>
		<li>选择 文件 和 打开视频 上传之前录制的每个单独的视频文件。</li>
		<li>选择 区域 图标所示 图1E （黑色箭头）以构建单个检测区域，并在包含线虫的整个液滴周围创建一个区域。单击 选择，然后点击下方的绿色圆圈图标（灰色箭头） 区域 &#62; 构建 &#62; 清晰的标记. 
		注意：所选区域内将检测到定义液滴中所有线虫的活动（图1E，F).</li>
		<li>前往 校准 &#62; 吸取 刻度图1E）并从视频区域左侧向右侧画一条水平线。标示出用于校准的实际距离。然后选择 应用于组.</li>
		<li>取消选择用于构建区域的图标（箭头所示） 图1E）并选择或取消选择 透明. 
		注意：在本研究中， 透明 被选中并取得了更好的结果。</li>
		<li>调节 检测灵敏度 和 活动阈值 以实现对所有不同类型的检测 秀丽隐杆线虫 分析的线虫品系。 
		注意：本实验中，检测灵敏度设置为8，爆发值（Burst）和冻结值（Freezing）分别为15和2（图1F).</li>
		<li>设置 显示比例 在 70 以可视化动物在活动分析过程中的运动轨迹。然后选择 应用于组 (图1F).</li>
		<li>点击 实验 &#62; 执行 &#62; 保存为，然后在 开始一个窗口打开。请选择 您是否希望以计算机的最大速度处理视频媒体？ 快速分析视频（例如，1 分钟的视频记录可在 ZebraLab 软件中于 5 秒内完成分析）。</li>
		<li>另一个窗口打开： 运行实验；点击 开始 继续进行实验。</li>
		<li>视频录制完成后，分析将停止。点击 实验 &#62; 停止这将单滴样本的分析结果保存到电子表格中。</li>
		<li>对每个单个液滴的视频重复进行分析。每个液滴为一个技术重复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>斑马鱼行为分析仪数据输出与分析 
	注意：实验结束后，每个视频的数据将分别保存为所选文件夹中的独立电子表格。在数据输出文件中，单个液滴内所有线虫运动的整合活动水平以“actinteg”下的像素变化形式记录。
	<ol>
		<li>打开从每段视频分析中获得的电子表格，然后手动将它们整合到一个文件中。 
		&#8203;将突变型和野生型数据归一化为对照组的百分比。此处进行了统计学分析，以比较各组之间的平均活性水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 利用 WormScan 软件分析在96孔板中液体培养基内线虫运动活性
<ol>
	<li>线虫的培养与操作
	<ol>
		<li>培养 秀丽隐杆线虫 如第1.1.1节所述</li>
		<li>按照第1.1.2节所述方法同步线虫。</li>
		<li>按照第1.1.3节所述，在特定培养基上培养线虫至L4期或成虫第1天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于WormScan活动分析的线虫在96孔板中的实验装置
	<ol>
		<li>加入50 µL质量体积比为2%的 大肠杆菌 在96孔透明平底微孔板的每个孔中加入含有OP50的S基础培养基液体悬浮液，具体操作如前所述49,53.</li>
		<li>在体视显微镜下，从NGM平板中手动挑选15条同步化的L4期或成虫第1天的线虫，移至96孔微孔板各实验孔的液体培养基中。在扫描前，让线虫在液体培养基中适应20分钟。 
		注意：其他动物发育阶段和年龄均可根据研究需要进行替换。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>96孔板中WormScan活动分析及数据导出至电子表格
	<ol>
		<li>使用标准平板扫描仪，对每个96孔透明平底微孔板依次进行两次扫描，两次扫描间隔小于10秒。 
		注：此处使用分辨率为1,200点/英寸、16位灰度的图像扫描仪生成JPEG图像。使用该图像扫描仪扫描四个96孔板所需时间少于10分钟。</li>
		<li>对齐两次连续扫描（图2A) 使用开源软件49. 
		注意：该软件会生成一幅差分图像，用于评估感兴趣区域内两幅连续图像之间的像素变化图2B）以及一个相对 WormScan 评分该 WormScan 评分相当于当扫描仪的像素阈值设为 5 时，基于扫描仪产生的光强度所引起的运动反应变化图2C).</li>
		<li>将 WormScan 中的数据导出为电子表格。将包含数据的电子表格保存至本地计算机。将数据归一化为对照组百分比（POC），并在不同突变体或处理条件下对生物学重复实验进行比较。使用学生t检验对突变体与对照组的均值进行统计学分析。 t测试。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

M.L.、N.D.M.、N.S. 和 E.N.-O. 无相关财务披露。M.J.F. 是 MitoCUREia, Inc. 的联合创始人，RiboNova, Inc. 的科学顾问委员会成员（持有股权），并担任 Khondrion 和 Larimar Therapeutics 的科学委员会成员兼付费顾问。M.J.F. 过去或目前曾作为付费顾问参与多家致力于线粒体疾病治疗的临床前和/或临床阶段药物开发的公司（Astellas [前身为 Mitobridge] Pharma Inc.、Cyclerion Therapeutics、Epirium Bio、Imel Therapeutics、Minovia Therapeutics、NeuroVive、Reneo Therapeutics、Stealth BioTherapeutics、Zogenix, Inc.），和/或作为资助研究合作方与以下公司合作（AADI Therapeutics、Cardero Therapeutics、Cyclerion Therapeutics、Imel Therapeutics、Minovia Therapeutics Inc.、Mission Therapeutics、NeuroVive、Raptor Therapeutics、REATA Inc.、RiboNova Inc.、Standigm Therapeutics 和 Stealth BioTherapeutics）。

本文总结了在多种表型水平（包括线虫剧烈摆动、运动行为、咽部泵动和趋化性）上研究C. elegans神经肌肉活动的详细信息及其研究依据。本文从相对通量、优势和局限性等方面比较了16种不同的活动分析方法，用于定量分析单个线虫或不同年龄阶段、不同实验时长的线虫群体的活动能力。其中，重点介绍了两种半自动化分析方法的新颖改进与&#160;应用，结果表明，在L4幼虫发育阶段以及成虫第1天的年轻成虫中，一种已建立的线粒体复合物I疾病C. elegans品系gas-1(fc21)的运动活动能力相较于野生型（WT）对照组显著降低。
特别是，由于野生型（WT）线虫在固体培养基上的运动呈现出非常规律的正弦波模式，因此秀丽隐杆线虫（C. elegans）的神经肌肉功能和运动活性已在固体培养基上得到广泛研究。实验观察者可通过显微镜检测其运动轨迹的规律性及运动速度的异常，并进行人工评分，但这类检测方法通常通量较低且操作繁琐。为了提高实验通量，应选择自动化和高通量的检测方法。线虫活动能力的损伤可在液体培养基中进行量化，通过...

Caenorhabditis elegans 因其仅含有302个神经元即可协调线虫的所有行为（包括交配、摄食、产卵、排便、游泳以及在固体培养基上的运动）而被广泛认为是神经科学领域出色的模式生物1。这些雌雄同体的线虫也被广泛用于研究多种人类疾病机制，这得益于其基因组已被充分表征，并且C. elegans与人类之间约有80%的基因具有高度同源性2,3,4。C. elegans长期以来被用于研究人类线粒体疾病5,6,7,8,9,10，这类疾病是一组遗传和表型高度异质性的遗传性代谢障碍，其共同特征是细胞能量生成能力受损，临床上常表现为显著的神经肌肉功能障碍、运动不耐受和疲劳11,12,13,14。因此，利用C. elegans模型可对不同类型遗传亚型的线粒体疾病中动物活动能力和神经肌肉功能的定量特征进行临床前建模，并评估潜在治疗手段对其神经肌肉功能和整体活动能力的改善效果。
秀丽隐杆线虫（C. elegans）的神经肌肉活动可通过多种实验方法进行客观测量，包括可在固体或液体培养基中进行的手动和半自动化方法（表1）1,15。准确量化 C. elegans 的活动已被证明对揭示肌肉和神经系统功能与发育相关机制具有重要意义16,17,18。本研究总结并比较了17种可在科研实验室中用于评估 C. elegans 疾病模型神经肌肉功能和活动的实验方法，涵盖在不同发育阶段和年龄下的基础状态以及对候选治疗干预的反应情况下的四项关键指标（表1）。本研究详细概述了可用于表征 C. elegans 摇摆频率（每分钟体弯曲次数）、运动活性、咽部泵动和趋化性等指标的现有实验方法，针对每种方法分别说明了其实验与分析方法、优缺点、所需设备与软件，以及支持高通量基因筛选或药物筛选的通量能力。每种检测方法的通量能力根据实验方案的复杂性进行分类，包括线虫培养方式、处理时间、使用单孔板或多孔板，以及完成实验设置和数据分析所需的人工时间，分为低、中、高三类。
对虫体摆动19、运动活性20、咽部泵动17,21以及趋化性22,23的手动分析是评估线虫活性的成熟方法，需使用体视显微镜24。测量线虫在液体培养基中的摆动活性时，需分析每分钟身体弯曲的频率；而线虫的运动活性则可在固体或液体培养基上进行测定。然而，对单个线虫活性的手动分析本质上耗时较长，且不可避免地引入人为偏差。自动化分析线虫活性可最大限度减少人为偏差，并显著提高实验通量25。在液体培养基中记录的线虫摆动视频可通过 wrMTrck（一种 ImageJ 插件）进行分析26。然而，wrMTrck 最初设计的实验条件限制了其应用，因为单个液滴中线虫数量过多会导致个体重叠，从而难以实现准确追踪。尽管这一实验局限性已被解决27，但 wrMTrck 方法仍无法支持高通量筛选。
在 C. elegans 线粒体疾病模型中，存在多种方法可用于定量评估线虫在基线状态及候选疗法干预下的运动活性&#160;。这些方法包括 ZebraLab（ViewPoint Life Sciences）、Tierpsy Tracker28、宽视野线虫追踪平台（WF-NTP）29、WormMotel、WormWatcher30、WormLab31、Infinity Chip32 和 WMicrotracker One33（表1）。这些方法能够在多孔板上同时分析多种线虫品系或不同条件下的运动行为，从而支持高通量药物筛选应用。其中部分方法具有一些特殊考量因素，可能限制或增强其通用性，例如是否需要昂贵设备或可开放获取的软件，以及实验操作流程的难易程度差异。总体而言，并不存在一种适用于所有 C. elegans 运动活性研究的完美实验系统或标准方案。因此，关键在于根据研究者的具体实验目标和实际需求，谨慎选择最合适的方法。
咽泵活动是评估 C. elegans 神经肌肉功能的另一项重要指标。C. elegans 的咽部由20个肌细胞、20个神经元以及20个其他细胞组成，这些细胞共同作用，使线虫在其消化道前端摄取大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）34,35,36。已有多种手动方法用于测定咽泵频率17,21,37,38。大多数方法依赖体视显微镜和摄像设备来观察并记录咽泵频率，再由实验人员直接计数21。也可通过一种称为电咽图（electropharyngeogram, EPG）的细胞外记录技术实现自动化的咽泵频率分析，该方法可提供每次泵动持续时间的额外信息39。此外，在微流控系统 WormSpa 中也可进行咽泵频率分析，该系统将单个线虫限制在特定腔室中40,41。目前还有一种商用技术——ScreenChip 系统（InVivo Biosystems），可辅助咽泵频率的分析。该系统通过将单个线虫固定于定制芯片中，实现对摄食行为相关神经肌肉活动的测量、可视化和分析。这种咽泵定量方法可用于评估药物、衰老及其他因素对神经元和生理反应的影响42,43,44,45。
C. elegans 的趋化性是指线虫在受到置于线虫生长培养基（NGM）平板上某一特定区域的气味物质刺激时所产生的定向移动行为。通过评估趋化反应，可对线虫神经元及神经肌肉系统的整体功能进行量化，其方法是在规定的时间内观察并测量线虫向气味物质移动的实际距离46。多虫追踪系统（Multi-Worm Tracker）是一种自动化方法，可用于提高定量分析线虫向吸引物移动或远离排斥物时所行进距离的实验效率47。
本文详细描述了两种新建立的、用于量化线虫活动的半自动化方法。第一种方法利用ZebraLab这一商业软件——该软件最初用于研究Danio rerio（斑马鱼）的游泳活动——将其创新性地应用于中等通量检测，在液体培养基中基于运动引起的像素变化来定量分析C. elegans的整体运动活性（表1，图1）。该方法可在载玻片上同时分析大量条件和样本，并快速获得数据输出，但不适用于多孔板格式。第二种方法是对WormScan方法的一种新改进48,49（图2），该方法使用平板扫描仪生成两次连续扫描的差分图像，可结合开源软件实现对繁殖力和存活率等整合生理表型的半自动化定量分析。本文进一步开发了一种适用于高通量分析的WormScan新改进方法，用于在96孔平底板中，每孔15条幼虫四期（L4）线虫群体中，在液体培养基内定量其运动活性。这种半自动化、低成本的WormScan方法可便捷地应用于高通量药物筛选，以及对不同发育阶段和年龄动物的分析48,49。
此处分析的方案及其有效性 秀丽隐杆线虫 使用ZebraLab和WormScan半自动化方法演示了运动活性的检测 秀丽隐杆线虫 线粒体复合体 I 疾病模型， gas-1(fc21). gas-1 (K09A9.5 基因) 是人类的直系同源基因 NDUFS2 （NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基（铁硫蛋白）亚基2）（图3）。该 秀丽隐杆线虫 gas-1(fc21）突变株在人类同源基因中携带纯合的p.R290K错义突变 NDUFS250，导致繁殖力和寿命显著下降，呼吸链氧化磷酸化（OXPHOS）能力受损51，以及线粒体数量和膜电位降低，并伴有氧化应激增加5,8尽管在过去二十年中已被广泛用于研究线粒体疾病和运动活动 gas-1(fc21）突变体此前未见报道。此处，&#160;ZebraLab 和 WormScan 方法被用于独立量化运动活性 gas-1(fc21）与野生型（WT，N2 Bristol）线虫相比，既用于验证实验方法的有效性，也用于展示实验方案及生物信息学分析在不同条件下的相对实用性和效率。ZebraLab 软件可快速定量分析多种并行条件下线虫的运动活动情况 秀丽隐杆线虫 线粒体疾病模型，可用于靶向药物筛选或验证研究。特别是 WormScan 分析，非常适合快速开展化合物库的高通量药物筛选，并优先筛选出能够改善动物神经肌肉功能和运动活性的候选药物，用于临床前研究。 秀丽隐杆线虫 原发性线粒体疾病模型

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 野生分离株</td><td>&amp;nbsp;秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td>N2 布里斯托尔株</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>奥林巴斯（Olympus）</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>gas-1(fc-21)</td><td>CGC</td><td>CW152</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>赛默飞世尔科技（ThermoFisher）</td><td>4951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>线虫生长培养基（NGM）</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>OP50 大肠杆菌（Escherichia coli）</td><td>CGC</td><td></td><td>尿嘧啶营养缺陷型 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 菌株</td></tr><tr><td>培养皿（60 mm）</td><td>&amp;nbsp;VWR 国际公司（VWR international）</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>S. 基础培养基（S. Basal）</td><td>VWR：1 L H₂O 中含 5.85 g NaCl、1 g K₂HPO₄、6 g KH₂PO₄ 和 5 mg 胆固醇</td><td>VWR 101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660</td><td></td></tr><tr><td>扫描仪</td><td>爱普生（EPSON）</td><td>V800</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>奥林巴斯（Olympus）</td><td>MVX10 显微镜</td><td></td></tr><tr><td>96 孔平底板</td><td>&amp;nbsp;VWR 国际公司（VWR international）</td><td>29442-056</td><td></td></tr><tr><td>WormScan 软件</td><td>Mathew 等人 &lt;sup&gt;45&lt;/sup&gt;</td><td>S1 独立 Java 平台</td><td>用于自动化分析扫描培养板的差分图像的软件</td></tr><tr><td>ZebraLab 软件</td><td>ViewPoint</td><td></td><td>用于斑马鱼行为的自动化定量与追踪分析的软件，由 ViewPoint 公司设计（http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening），此处应用于 C. elegans。该系统适用于高通量行为分析</td></tr></tbody></table>

动物活动量测定实验方法的比较分析 秀丽隐杆线虫 线粒体疾病模型

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans 被广泛认为是一种重要的转化动物模型，可用于高效研究多种人类疾病的机制和治疗方法。线虫特别适用于高通量的遗传学和药物筛选，因其具有发育周期短、子代数量多、寿命短、身体透明、维护成本低、基因组工具丰富、突变体资源库完备以及可用于体内和体外生理学研究的成熟实验方法，从而有助于深入理解治疗靶点和疗法。线虫的运动行为是一个特别相关的表型，在线粒体疾病中常出现功能受损；这类疾病病因和临床表现高度异质，但共同特征是细胞能量生成能力下降。尽管已有多种方法可用于研究线虫行为，但这些方法在实验成本、复杂程度以及对基因组或药物高通量筛选的适用性方面差异显著。本文比较了16种不同的活动分析方法在相对通量、优势与局限性方面的表现，这些方法用于定量分析单个或群体 C. elegans 线虫在不同发育阶段、年龄和实验时长下的线虫运动、摆动、咽部泵动和/或趋化性。文中详细展示了两种半自动化方法的实验方案，用于定量分析线虫运动活性，其创新性地应用了现有软件工具，即 ZebraLab（中等通量方法）和 WormScan（高通量方法）。应用这些方法获得的数据表明，在线粒体复合物 I 疾病模型（gas-1(fc21)）突变线虫中，与野生型（N2 Bristol）C. elegans 相比，L4 幼虫阶段即出现动物活动能力相似程度的下降，并在成虫第1天进一步加重。该结果验证了 ZebraLab 和 WormScan 软件工具在定量分析线虫运动行为方面的有效性与客观性，表明这两种新应用具备不同程度支持在线粒体疾病临床前动物模型中开展行为学高通量药物筛选的潜力。

在液体培养基中分析 C. elegans 的运动活性，可简便地捕获线粒体疾病线虫模型的整合表型，而该表型在固体培养基上可能难以量化。本研究使用 ZebraLab 对已建立的线粒体复合体 I 疾病模型 gas-1(fc21) 菌株在 L4 幼虫阶段的运动活性进行定量分析，并与野生型线虫（WT）在液体培养基中的表现进行比较。每滴液体中 5 条线虫的活动被记录 1 分钟，每种菌株共记录 19 段视频（技术重复），每种菌株总计分析 95 条线虫。每种菌株均获得 4 次生物学重复实验。线虫活动以像素变化量显示（图 3A），或经归一化处理后以对照百分比（POC）表示（相对于 N2 Bristol 野生型对照）（图 3B）。与野生型线虫（100% ± 11.35%，均值 ± 标准差，n = 95，每条件在 4 次生物学重复中的 19 次技术重复）相比，gas-1(fc21) 线虫在 L4 阶段的运动活性显著降低 38%（62% ± 16% 像素...

本研究介绍了两种用于分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）复合体 I 疾病 gas-1(fc21) 蚓体运动活性的半自动化方法，分别为 ZebraLab（中通量检测）和 WormScan（高通量检测），并提供了多种研究方法之间的比较分析，以量化线虫行为及整合性神经肌肉功能。

秀丽隐杆线虫因其在转化医学研究中作为动物模型的核心作用而被广泛认可，可用于高效探究多种机制及治疗方法……

本方案采用两种不同的半自动化检测方法，可快速定量秀丽隐杆线虫（C.elegans）在液体培养基中的运动活性，且有望应用于秀丽隐杆线虫疾病模型的药物筛选。这两种技术的主要优势在于操作简便且易于重复。两种方法均有潜力以不同的通量水平评估药物对线虫行为的影响。这些运动性检测方法可用于评估线虫线粒体疾病模型的运动能力，其中线虫的神经肌肉系统功能受损。为分析在NGM平板上同步至L4期并接受或未接受药物处理的对照组与突变株线虫在液体培养基中的运动能力，使用线虫挑取工具和体视显微镜，将每种菌株和条件下的五条线虫转移至载玻片上独立的20 µL S. basal溶液液滴中。将来自不同NGM平板但相同实验条件的线虫分别加入同一载玻片上的多个液滴，以获得多个技术重复样本。当收集完所有线虫后，将样品置于载玻片上，在室温下静置适应1分钟，随后以每秒15帧的速度记录每滴液滴中线虫的游泳活动，每滴记录时长为1分钟。为使用ZebraLab软件分析所记录的秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动行为，选择ZEBRALAB AVI功能将视频上传至软件中，并点击“Quantization with AVI Files”选项。要创建新方案，请选择参数、方案参数和时间，并将实验时长设置为一分钟。根据所需的数据输出，选择“无时间分段”并取消选中“积分周期”，然后选择文件并打开视频，以上传每个先前录制的视频文件。为建立单一检测区域，使用圆形工具在包含线虫的整个液滴周围创建一个区域。将检测所选区域内所有线虫的活动。为进行距离校准，请在视频区域从左至右绘制一条水平线，然后选择“Calibration”（校准）、“Draw”（绘制）和“Apply to Group”（应用于组）。为了能够检测并分析不同品系的秀丽隐杆线虫（C. elegans），请取消选择“Area”（区域）图标，并在“Activity Threshold”（活动阈值）中调整“Detection Sensitivity”（检测灵敏度）。在活动分析进行过程中，若要可视化动物的运动轨迹，请将显示比例设置为70，并选择应用于组。要分析视频，请单击播放，选择实验，然后执行，以输入视频的文件名。保存后，将弹出一个窗口，询问是否以计算机的最大速度分析该视频。单击“是”。正在运行的实验窗口将打开。单击“开始”。当记录分析完成后，点击“实验”并停止，以将液滴中分析的活动数据保存到电子表格中。为了以96孔板形式分析线虫在液体培养基中的运动活性，当线虫发育至L4阶段时，向透明的96孔平底微孔板的每孔中加入50微升浓度为2%（质量/体积）的大肠杆菌OP50和S-基础培养基。使用体视显微镜手动挑选15条同步发育的线虫放入96孔板的每孔中，并让线虫适应环境20分钟。在适应期结束时，使用标准平板扫描仪对每块微孔板进行两次扫描，两次扫描间隔小于10秒。为分析扫描结果，使用开源软件对连续的两幅扫描图像进行比对，获取两幅图像间的像素变化数据以及相对线虫扫描评分，从而根据扫描仪在设定像素阈值为5时产生的光强来确定运动反应的变化。在此对单滴液体培养基中秀丽隐杆线虫（C. elegans）运动活性的分析中，线粒体复合物I疾病模型线虫在L4阶段的运动活性相较于野生型线虫显著降低了38%。类似地，对相同种群的线虫扫描分析显示，L4阶段疾病模型线虫的运动活性相较于N2 Bristol野生型线虫显著降低。通过蠕虫扫描分析发现，成年第一天阶段的线粒体复合物 I 疾病蠕虫也表现出运动活性的丧失。在建立每项检测时，务必注意使用正确数量的蠕虫。按照此操作流程，本实验室经常进行药物筛选。本实验室采用这两种技术，在线虫线粒体疾病临床前动物模型中评估目标药物对蠕虫活动的影响。

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行为

线粒体疾病脑 膜炎基因 模型中量化动物活动的实验方法比较分析

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使用径向运动检测法评估 C. elegans 模型中的运动功能障碍

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一种用于测量肌营养不良小鼠模型行走能力的简单且低成本检测方法

我们介绍了使用宽视场线虫追踪平台（WF-NTP）的实验方案，该平台可实现对大量秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

大型动物自动化行为分析 秀丽隐杆线虫 使用宽视野追踪平台的群体研究

线粒体呼吸对生物体的存活至关重要，因此，耗氧速率是衡量线粒体健康状况的理想指标。在本实验方案中，我们描述了如何使用市售的呼吸测定仪，来测量活体、完整且自由运动的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

完整 Caenorhabditis elegans 中氧气消耗速率的测定

本研究概述了利用免费提供的图像处理工具，对C. elegans中的突触大小与定位、肌肉形态以及线粒体形态进行定量测量的方法。该方法可使未来在 C.

用于研究细胞结构与细胞器形态的定量方法 秀丽隐杆线虫

本方案描述了两种灵敏的检测方法，可用于区分肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）的 C. elegans 模型中轻度、中度和重度运动功能障碍，也可广泛适用于运动能力改变的 C. elegans...

肌萎缩侧索硬化症的 C. elegans 模型中运动功能障碍的评估

本文介绍了一种高分辨率呼吸测定方案，用于分析PINK1B9基因缺失突变果蝇中的生物能量学。该方法采用底物-解偶联剂-抑制剂-滴定（SUIT）方案。...

使用高分辨率呼吸测定法分析 Drosophila melanogaster PINK1B9 缺失突变体中的线粒体功能

本方案提供了一种标准化的方法，用于在秀丽隐杆线虫（C.

在衰老过程中对C. elegans线粒体形态进行成像与定量分析

了解两种半自动化检测方法，用于量化秀丽隐杆线虫的运动活性，并应用于线粒体疾病模型和药物筛选。这些方法具有高效、可重复和可扩展的特点，支持中等通量和高通量实验设计。

动物活动量测定实验方法的比较分析秀丽隐杆线虫线粒体疾病模型

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动物活动量测定实验方法的比较分析 秀丽隐杆线虫 线粒体疾病模型

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