通过病毒样颗粒（“纳米刀”）递送Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物至永生化细胞和原代细胞

纳米刀能够快速、高效且以剂量依赖的方式递送Cas9和向导RNA复合物，适用于永生化细胞和原代细胞，并且无需使用抗转基因。该方法的主要优势在于纳米刀制备简便且相对经济。它们可以以剂量依赖性和瞬时的方式递送Cas9和向导RNA复合物，从而限制脱靶效应，同时实现高效的基因组编辑。

纳米刀的制备方案非常简单。然而，生产细胞的质量、来源以及转染前的接种情况，对于获得高产量的病毒样颗粒至关重要。本次实验操作将由我实验室的工程师Laura Guiguettaz进行演示。

第一天，在10厘米的细胞培养皿中加入10毫升改良的DMEM培养基和青霉素-链霉素，接种350万至400万个HEK 293T细胞。24小时后，当细胞融合度达到70%时，更换为新鲜的DMEM培养基，并使用P-1000移液器以逐滴方式加入转染试剂溶液。从第四天开始收获纳米刀，用10毫升移液器收集培养基上清液。

在此阶段，培养基颜色变为黄色是正常现象。将收集的上清液在500 G条件下离心五分钟，以去除细胞碎片，并小心吸取九毫升上清液，避免扰动细胞沉淀。在4°C条件下，使用超速离心机以209,490 G离心75分钟，沉淀纳米刀（nanoblades）。

离心后，缓慢吸除上清液，并用 100 µL 冷的 PBS 重悬白色沉淀。用封口膜封住管口，在 4 °C 下轻轻振荡孵育 1 小时。然后，通过上下吹打重新悬浮沉淀。

在 PBS 中配制 10% 蔗糖溶液，并通过 0.2 微米注射器滤器过滤。取 2.5 毫升 10% 蔗糖溶液加入超速离心管中。将离心管倾斜，用低速移液器缓慢加入 9 毫升含有病毒样颗粒（VLP）的样品，同时逐渐将离心管转至垂直位置。

将离心管放入转子吊桶中，在4°C条件下以209,490 G离心90分钟。离心结束后，小心移除上清液，并将离心管倒置在纸巾上以去除残留液体。为了教学目的并更好地观察病毒沉淀物，可制备载有荧光蛋白mCherry的纳米刀片。

一分钟后，加入 100 µL PBS。将试管用封口膜封口后置于振荡仪上的试管架中，在 4 °C 条件下孵育一小时，并通过移液吹打重悬沉淀。通过将一份含有非离子型表面活性剂的裂解缓冲液加入四份 PBS 中，配制稀释缓冲液。

取2微升浓缩的纳米刀（nanoblades）加入50微升稀释缓冲液中，短暂涡旋混匀。将25微升该混合液转移至另一新管中，该管内预先加入25微升稀释缓冲液，重复此步骤，共制备六管纳米刀系列稀释液。通过向50微升稀释缓冲液中加入2微升重组Cas9核酸酶并短暂涡旋，制备标准对照，并进行八次连续稀释。

使用多通道移液器，将每种VLP稀释液各2.5微升以及每种标准品各2.5微升小心地点样到硝酸纤维素膜上。待颗粒被膜吸收后，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭45分钟。弃去TBST，将膜与Cas9辣根过氧化物酶抗体在4摄氏度孵育过夜。

用TBST洗涤膜三次，并使用增强型化学发光底物试剂盒检测信号。用纳米刀转导靶细胞时，将细胞培养基更换为含有纯化纳米刀的500微升培养基。细胞孵育4至6小时后，更换为正常体积的新鲜培养基。

在该实验方案中，细胞在转染当天以70%至80%的融合度接种，以确保分布均匀；转染后24小时形成合胞体，导致细胞体积增大并出现多个细胞核。转染40小时后，大多数细胞形成合胞体并开始从培养板上脱落。通过在硝酸纤维素膜上进行点印迹法对纳米刀片（nanoblades）中装载的Cas9蛋白量进行定量，结果显示其化学发光信号强于参照的重组Cas9蛋白。

根据已知量的Cas9蛋白绘制了重组Cas9稀释液的化学发光信号定量校准曲线。随后，对每批纳米刀（nanoblade）制备物中的Cas9蛋白浓度进行了测定，结果显示不同批次间Cas9浓度存在差异。T7核酸内切酶实验表明，纳米刀的切割效率在不同批次之间也有所不同。

例如，一批样品的总体编辑效率为20%，而另一批样品的效率为60%。使用抗Flag琼脂糖微珠对Flag-DDX3蛋白进行免疫沉淀，随后利用抗Flag抗体对回收的蛋白进行蛋白质印迹分析。通过PCR检测DDX3基因座中Flag标签的定点插入，所用引物包括跨越插入位点的上下游引物，或针对Flag插入位点下游DDX3基因座的特异性正向与反向引物。

正确控制细胞的汇合度并获得均匀的细胞分布非常重要。在纳米刀离心后，重悬沉淀并获得均一的高浓度病毒颗粒样品也至关重要。纳米刀技术使科学家能够通过快速、协调地将Cas9与向导RNA复合物递送至基因组特定位点，从而研究双链DNA断裂修复的机制。

他们还实现了在天然免疫系统的原代细胞中失活长链非编码RNA，以研究其功能。