Name: 用于表征用于超声触发药物释放的荧光标记微气泡的多时间尺度显微镜方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 学习多时间尺度显微镜技术，用于表征荧光标记微气泡在超声触发药物释放中的激活机制与生物效应。该方法结合明场、荧光和活体显微镜技术，为癌症治疗等临床应用提供重要见解。

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作者声明不存在利益冲突。

结合了不同的光学显微技术，以获取纳米颗粒从微泡表面传递到周围介质各个步骤的信息。体内成像用于观察微泡的振荡、纳米颗粒从微泡壳的释放、血管外渗以及穿透肿瘤细胞外基质的过程。体外成像相比更复杂的体内实验体系，可实现对多种超声参数的快速筛选。结合多种成像模式的优势在于能够在不同时间尺度上获得互补的信息，这一特性对于表征和优化微泡以实现有效递送并获得治疗效果至关重要。该方法适用于研究所有类型微泡的递送机制，包括携带荧光标记纳米颗粒和药物的微泡体系。
用于研究单个微泡的显微镜方法中最关键的步骤如下。对于荧光显微镜，应将纳米颗粒进行荧光标记，以便可视化颗粒的释放过程。此外，样品溶液应充分稀释，以在共聚焦、明场和荧光显微镜方法中分离出单个微泡进行分析。另外，选择合适的超声驱动频率和声压以最有效地激发微泡（即在其共振状态）非常重要。如果研究问题涉及纳米颗粒载荷的递送，则适当的超声参数应纳入研究范围。除了共振条件外，这些微泡还应在或超过其纳米颗粒释放阈值的条件下驱动，通常需要相对较高的声压幅度（MI &#62; 0.3）51。对于明场显微成像，关键是要选择具有足够高帧率的高速相机，以最小化运动模糊并避免混叠效应。
明场显微镜主要受限于成像帧率和可用光源的强度；更高的帧率可提供更详细的时间分辨信息以观察气泡动力学过程，但由于曝光时间更短，需要更强的照明。原则上，可通过增加激光光源的强度来提高荧光成像的帧率，从而更细致地研究颗粒释放过程。然而，即使使用高量子产率的荧光染料，高强度激光也会被荧光标记的微泡吸收并产生热量。这种热量可能干扰相关实验，在极端情况下甚至引发光热空化现象。52因此，在实际操作中，所施加的激光能量密度存在上限。然而，高强度的激光照射也可被有意用于诱导脂质体释放颗粒53温度影响气泡动力学及超声响应，具体取决于气泡类型54因此，如果 体外 并且要客观比较活体内外方法， 体外 本方案中讨论的方法应在 37 °C 下进行。另一个局限性是 体外 本文讨论的方法存在一个局限性，即气泡并非处于自由场环境中，因为微气泡会漂浮在样品支架膜下方。此外，在对单个微气泡成像时存在选择偏倚。然而，通过对单个气泡进行重复实验，可以研究气泡尺寸的影响，并消除混杂因素——尺寸分布的干扰。若能在气泡浓度不至于引起气泡间相互作用的前提下，理解气泡响应随尺寸变化的规律，则可据此计算任意气泡群体的响应。&#160;最后，明场和荧光显微镜方法均可提供包含微泡的二维（2D）图像信息。若研究问题需要超越二维成像的分析，可通过将本方案中描述的装置与侧向成像装置结合，实现多平面成像，从而解析气泡的三维（3D）行为。55.
研究微泡的另一种方法是声学表征56然而，测量单个微泡的回波需要在超声束内定位并分离出单个微泡56，这通常通过使用细管或光镊或声镊技术来解决57,58为了通过声学方法测量气泡尺寸，可在远高于微泡共振频率的条件下，于几何散射 regime 对微泡进行超声辐照，该条件不会引发微泡的体积振荡。59. 一种的使用 &#34;声学相机&#34; 是一种用于成像单个微泡在超声作用下径向动力学的方法，其中使用高频超声探头来测定微泡对低频驱动波的径向响应60该方法的缺点是仅能用于确定微泡半径的相对变化；因此，还需另一种方法来确定气泡的绝对半径。 例如，通过光学成像61,62当微泡暴露于高于其共振频率的超声波时，此类方法的缺点是在如此高的频率下，穿透深度会降低59，限制了其可用性 体内 应用。其他形式的显微镜也可用于微泡研究，例如扫描电子显微镜、原子力显微镜和透射电子显微镜63然而，这些替代显微技术可达到的空间和时间分辨率通常较为有限，且存在以下缺点：成像通常通过离线分析在超声暴露之前或之后进行，且通量通常较低63另一种替代方法是使用光散射法，该方法可用于实时研究单个微泡的径向动力学，但与声学散射方法相比，其信噪比较低。64.
在超声暴露期间进行实时活体显微成像是一种强大的方法，可用于获取关于血管结构、微泡、纳米颗粒或其他分子（例如本例中的葡聚糖）在超声作用下行为的新见解。进行实时活体显微成像的一个普遍限制是仅能对组织的微小区域成像，且光在组织中的穿透深度有限。如果成像视野内的血管中微泡和/或纳米颗粒数量极少，则几乎无法获得有关纳米颗粒行为及其外渗的信息。此外，由于视野有限，光路与超声路径之间的精确对准至关重要。如果超声压力足够高以致引起微泡破裂，则还需选择合适的脉冲重复频率，以确保在两次超声脉冲之间有新的微泡重新灌注进入成像区域。此外，由于超声会在观察窗室的盖玻片和物镜表面发生反射，因此将超声换能器以一定角度放置非常重要，可减少反射，避免驻波形成，从而防止校准后的压力场发生畸变。另一个实际问题是，显微镜系统需要留出足够的空间，以便在物镜上方或下方安装超声换能器和波导。背侧观察窗室中的肿瘤因受到腔室和盖玻片的限制而厚度有限；但如有需要，也可采用其他模型，例如乳腺脂肪垫中的皮肤褶肿瘤65，或对各器官中肿瘤进行腹腔活体成像66。此类肿瘤可在相应的微环境中正位生长，因而更具临床相关性。
本研究中描述的方法阐明了荧光标记微泡在利用气泡和超声进行药物递送基础研究中的潜力。这种显微镜方法的结合为微泡对超声辐照及其相关声学参数空间的响应提供了有价值的见解，并在相关的时间和长度尺度范围内清晰地展示了微泡及其载荷的行为特征。

超声是应用最广泛的医学成像技术。它具有无创、快速、安全、成本效益高和便携等优点1,2,3。然而，血液对超声的散射能力较弱，可通过静脉注射超声造影剂来增强血池的对比度3。这种增强的血池对比度可用于定量评估器官灌注，以辅助诊断，例如，用于冠状动脉疾病4和转移性肝病5的检测。事实上，肿瘤血管系统已被证实是一个重要的预后因素6。目前，大量研究致力于微泡介导的靶向分子成像，并致力于设计可用于治疗目的的造影剂。
市售超声造影剂通常由包膜微泡悬浮液组成7,8，其直径范围为 1 µm 至 10 µm9。由于超声造影剂微泡略小于红细胞7，因此可安全到达最小的毛细血管，而不会引起阻塞3。与组织相比，微泡的超声背向散射系数显著增加10，这归因于其可压缩的气体核心11。此外，微泡的回波具有高度非线性，即其频谱包含驱动频率的谐波和次谐波。同时，回波强度强烈依赖于微泡的共振响应12。由于组织仅产生线性散射，因此在谐波成像中，少量微泡即可实现高检测灵敏度13,14。这种非线性对比信号甚至足够强，可用于在体内追踪单个微泡15。
超声造影剂的外壳可防止气泡溶解和融合，从而延长其在血池中的循环时间16外壳可由脂质、聚合物或变性蛋白质组成3,8它可降低界面张力，从而限制拉普拉斯压力驱动的溶解作用17 并形成对气体扩散的阻抗屏障18为了进一步提高稳定性，造影微泡通常充入在血液中溶解度低的高分子量气体。11微泡外壳显著改变了微泡对超声辐照的响应11未包被&#160;气泡具有特征性的共振频率，该频率与其尺寸成反比。由于脂质包膜具有固有的刚性，包裹脂质层的气泡相较于无包膜气泡，其共振频率更高。3此外，外壳通过膨胀粘度耗散能量，这是包膜气泡阻尼的主要来源。3稳定外壳的另一个优势在于其可进行功能化修饰， 例如， 通过将靶向配体结合到微泡表面实现靶向。这种靶向性使这些微泡具有多种应用，尤其适用于超声分子成像14,19.
微泡造影剂在超声介导的药物递送应用中具有广阔前景。微泡在血管受限空间内振荡时，可在毛细血管壁上引起微流以及局部的法向应力和剪切应力3。在高声压条件下，大幅振荡可能导致微泡发生剧烈的惯性空化而崩塌，进而引起血管破裂或内陷20。这些剧烈现象可诱导产生诸如声致通透性等生物效应21，促进治疗药物通过内皮壁的细胞间隙或跨细胞途径进入间质组织。此外，该过程还可能增强治疗药物穿过富含基质的肿瘤细胞外基质21,22以及生物膜23,24的能力，尽管这一机制目前尚不明确26。
超声介导的药物递送在临床前研究27,28和临床试验中均显示出良好的应用前景22。此外，在使用相对低频超声（约1 MHz）时，已有报道表明微泡可在局部且短暂地增加血脑屏障通透性，从而促进药物进入脑实质，这一现象在临床前和临床研究中均有证实29,30,31,32,33,34。
超声介导的药物递送通常有两种方法：治疗物质可与微泡共同给予，或附着在微泡壳上，或被装载于微泡壳内28,35,36第二种方法在药物递送效率方面已被证明更为高效37微泡可通过其外壳附着或直接将载有药物或遗传物质的纳米颗粒（如脂质体或聚合物纳米结构）掺入外壳内进行装载。35,36负载纳米颗粒的微泡可通过（聚焦）超声激活，实现纳米颗粒的局部释放28,33,38,39,40若此类微泡与细胞直接接触，已有研究表明 体外 有效载荷甚至可以通过一种称为声学打印（sonoprinting）的过程沉积到细胞质膜上34,35.
微泡超声辐照的超声参数空间十分广泛，且 体内 生物条件进一步增加了复杂性。因此，聚焦超声与载有纳米颗粒的微泡相结合，为靶向治疗领域带来了挑战。
本研究的目的是提供一系列可用于详细成像微泡响应的实验方案，以超声参数为变量，研究导致微泡外壳破裂及随后释放荧光标记外壳材料的机制。该套方案适用于外壳含有荧光染料的微泡。 图1 展示了由挪威特隆赫姆 SINTEF 开发的聚合物-纳米颗粒-蛋白质稳定的微泡的示意图。这些微泡内充满全氟丙烷气体（C3F8）且稳定外壳的纳米颗粒含有NR668，这是一种尼罗红荧光染料的亲脂性衍生物38,43纳米颗粒由聚(2-乙基丁基氰基丙烯酸酯)（PEBCA）构成，并经过聚乙二醇（PEG）修饰。PEG功能化可减少单核吞噬细胞系统对纳米颗粒的调理作用和吞噬作用，从而延长其在体内的循环时间14,44因此，聚乙二醇化可增加到达靶部位的纳米颗粒数量，从而提高治疗效果16.&#160;图2 展示了四种显微镜方法的使用如何使研究人员能够覆盖所有相关的时间和长度尺度。需要注意的是，光学显微镜可达到的空间分辨率受衍射极限的限制，该极限取决于光的波长以及物镜和样品照明光源的数值孔径（NA）。45对于当前系统，光学分辨率极限通常为200 nm。此外，活体显微镜可用于亚细胞水平的成像。46本研究中所用的纳米颗粒与蛋白稳定的微泡，其适用于活体显微成像的最小尺度为小毛细血管的尺寸（≥10 µm）。 体外 高速光学成像（每秒1000万帧）和高速荧光成像（每秒50万帧）实验用于单个微泡的研究。纳秒时间尺度下的高速明场成像适用于研究振动微泡的时间分辨径向动力学。相比之下，高速荧光显微镜可直接可视化荧光标记纳米颗粒的释放过程。此外，可利用Z轴扫描三维（3D）共聚焦显微镜和扫描电子显微镜研究微泡壳层结构（后者实验方案未包含在本研究中）。活体显微成像采用多光子显微镜对背侧窗室中生长的肿瘤进行成像，以实时获取局部血流信息及荧光标记纳米颗粒的命运动态。 体内47这些显微技术的结合最终提供了对治疗性微泡制剂在超声作用下行为的详细洞察 体外 和 体内.

<table><tbody><tr><td>100 MS/s 双通道任意波形发生器型号 8026</td><td>Tabor Electronics</td><td></td><td>任意波形发生器（可编程）</td></tr><tr><td>2100 L</td><td>ENI</td><td></td><td>放大器，用于窗式腔体装置</td></tr><tr><td>2 MDa 葡聚糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>33522 A</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>任意波形发生器，用于窗式腔体装置</td></tr><tr><td>A1R</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>ACE I</td><td>SCHOTT</td><td></td><td>可调光交流卤素光源</td></tr><tr><td>Atipemazol</td><td>Orion Pharma</td><td></td><td>唤醒动物的解毒剂</td></tr><tr><td>Baytril</td><td>Bayer</td><td></td><td>恩诺沙星</td></tr><tr><td>BD Neoflon 24 G</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Company</td><td></td><td>尾静脉导管</td></tr><tr><td>BNC 模型 575</td><td>Berkely Nucleonics Corporation</td><td></td><td>脉冲/延迟发生器</td></tr><tr><td>Branson 2510 超声波清洗机</td><td>Branson</td><td></td><td>超声波清洗槽</td></tr><tr><td>通道载玻片</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLINIcell 25</td><td>Laboratoires Mabio International</td><td></td><td>细胞培养盒（体积 10 mL，膜面积 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，膜厚 175 &amp;micro;m）</td></tr><tr><td>Cohlibri</td><td>Lightline</td><td></td><td>激光器（5 W，激发波长 532 nm）</td></tr><tr><td>DP03014 数字荧光示波器</td><td>Tektronix</td><td></td><td>示波器</td></tr><tr><td>芬太尼</td><td>Actavis Group HF</td><td></td><td>小鼠麻醉剂</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>细胞培养基补充剂</td></tr><tr><td>光纤水听器</td><td>Precision Acoustics</td><td></td><td>用于对准</td></tr><tr><td>氟马西尼</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td>唤醒动物的解毒剂</td></tr><tr><td>加热动物固定装置</td><td>定制设计</td><td></td><td>一种钢制固定装置，其内部腔体大小适合小鼠侧卧放置，窗式腔体平放并用两侧螺丝固定。腔体下方装置上有一个孔，用于确保换能器与皮肤之间的声学接触。该装置加热至最高 37&amp;deg;C，温度由插入小鼠直肠的温度探头反馈控制。该装置安装在 XY 定位平台上，以便独立移动动物，从而成像窗式腔体的不同区域</td></tr><tr><td>Hyper Vision HPV-X2</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>高速摄像机</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院&amp;nbsp;和威斯康星大学光学与计算仪器实验室</td><td></td><td>开源图像处理程序</td></tr><tr><td>体内 SliceScope</td><td>Scientifica</td><td></td><td>多光子显微镜</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Baxter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISOTON</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>过滤的磷酸盐缓冲盐水溶液</td></tr><tr><td>LUMPLFLN60XW</td><td>Olympus</td><td></td><td>水浸物镜（放大倍数 60x，工作距离 2 mm）</td></tr><tr><td>MaiTai DeepSee</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>脉冲激光器</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>编程环境</td></tr><tr><td>美托咪定</td><td>Orion Pharma</td><td></td><td>小鼠麻醉剂</td></tr><tr><td>咪达唑仑</td><td>Accord Healthcare Limited</td><td></td><td>小鼠麻醉剂</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Merck</td><td></td><td>超纯水</td></tr><tr><td>MVS 7010 高强度氙气频闪灯</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>频闪灯</td></tr><tr><td>Panametrics-NDT C305</td><td>Olympus</td><td></td><td>单元件聚焦浸入式换能器（中心频率 2.25 MHz，焦距 1&quot;，直径 1&quot;）</td></tr><tr><td>Panametrics-NDT V304</td><td>Olympus</td><td></td><td>单元件聚焦浸入式换能器（中心频率 2.25 MHz，焦距 1.88&quot;，直径 1.25&quot;）</td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>在将肿瘤植入动物前添加至细胞培养基中</td></tr><tr><td>全氟丙烷气体</td><td>F2 Chemicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td><td>Gibco Thermo-Fisher</td><td></td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>Safe-Lock 管</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>在将肿瘤植入动物前添加至细胞培养基中</td></tr><tr><td>T 25 basic ULTRA-TURRAX</td><td>IKA 实验室技术</td><td></td><td>分散工具</td></tr><tr><td>TDS 210</td><td>Tektronix</td><td></td><td>示波器，用于窗式腔体装置</td></tr><tr><td>换能器</td><td>Precision Acoustics Ltd</td><td></td><td>用于窗式腔体装置</td></tr><tr><td>U-TLU</td><td>Olympus</td><td></td><td>管镜</td></tr><tr><td>VBA100-200</td><td>Vectawave</td><td></td><td>放大器</td></tr><tr><td>窗式腔体</td><td>定制制作</td><td></td><td>用于窗式腔体装置</td></tr><tr><td>XLUMPLFLN20 XW</td><td>Olympus</td><td></td><td>20x 水浸物镜</td></tr><tr><td>XY(Z) 平移台</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于表征荧光标记微泡在超声触发药物释放中应用的多时间尺度显微方法

Multi-timescale Microscopy Methods for the Characterization of Fluorescently-labeled Microbubbles for Ultrasound-Triggered Drug Release

微泡造影剂在超声介导的药物递送应用中具有广阔前景。将药物包载于纳米颗粒中可降低其全身毒性并延长药物在体内的循环时间。在一种新型的微泡辅助药物递送策略中，纳米颗粒被整合至微泡壳层内部或表面，从而实现通过超声触发并局部释放纳米颗粒所携带的药物。为了实现高效且可控的释放，必须深入理解在广泛超声参数空间内的释放机制。本系列实验方案适用于壳层含有荧光标记的微泡。本文重点介绍负载聚(2-乙基丁基氰基丙烯酸酯)聚合物纳米颗粒并掺杂改性尼罗红染料的微泡，这些纳米颗粒被固定于变性的酪蛋白壳层中。微泡通过剧烈搅拌制备，使全氟丙烷气体在含有酪蛋白和纳米颗粒的液相中形成分散体系，随后微泡壳层自发组装而成。为在纳米颗粒释放过程的所有相关时间尺度上对纳米颗粒稳定的微泡进行表征，需要采用多种显微镜技术。纳米颗粒的荧光特性使得能够利用共聚焦显微成像单个微泡，从而揭示纳米颗粒在壳层内的分布情况。 体外 以每秒1000万帧的超高速明场显微成像可揭示气泡在超声辐照下的动力学行为。最后，通过每秒50万帧的荧光显微镜成像可最佳地观察气泡壳中纳米颗粒的释放。为表征药物递送 体内，通过在背侧皮肤折叠窗室中植入的肿瘤模型，利用活体显微镜研究纳米颗粒在血管内的触发释放及其跨过内皮层的外渗过程，观察时间尺度为数分钟。这些互补表征技术的结合，可在多个时间和空间尺度上深入揭示微泡及其携带载荷释放行为的独特信息， 体外 和 体内.

按照本实验方案所述方法制备的微泡，采用多种显微镜技术在不同时间尺度下进行了分析。
共聚焦显微镜下纳米颗粒的荧光（图6A）表明，外壳的颗粒分布不均匀。其他显微技术也可用于气泡表征。例如，图6B展示了采用扫描电子显微镜观察微气泡的整体结构，如先前研究34中所示。
径向动力学和现象学气泡行为可通过所述方法进行研究 体外 一种明场显微成像方法，其中以每秒一千万帧的速度对微泡进行成像。通过自行编写的脚本提取单个微泡随时间变化的半径。此类径向响应的示例如下所示 图7.
如 2.3.6 节所述，典型的成功纳米颗粒递送过程的图像序列如图 8A所示。当激光照射到微泡时，由于荧光效应，可见嵌入微泡壳中的纳米颗粒发光。在超声辐照驱动下，荧光纳米颗粒从微泡的气体核心脱离，并沉积在样品 holder 的膜上。最后，激光关闭，荧光纳米颗粒不再被激发。荧光标记载荷递送失败的情况通常如图 8B所示的图像序列，其中荧光纳米颗粒在超声暴露期间仍停留在完整微泡的壳上并发光。
在超声过程中利用实时活体多光子显微镜，研究了超声联合微泡对血液中纳米颗粒行为的影响、肿瘤血管通透性的增强以及纳米颗粒递送效率的提升。可根据声学压力、频率和脉冲持续时间，表征纳米颗粒向细胞外基质渗透的程度和动力学特征。超声处理的效果可能因血管的大小和形态以及微泡所受空间限制的不同而有所差异。还可确定超声处理对血流状态和方向的影响。图 9 展示了一个随时间推移纳米颗粒外渗的实验示例，该实验在机械指数（MI）为 0.8 的条件下进行26。活体多光子显微镜的结果揭示了超声辐照期间纳米颗粒外渗的空间和时间分布特征，这对于全面理解超声介导纳米颗粒递送的机制以及优化相关技术具有重要意义26。
<img alt="荧光纳米颗粒示意图，聚合物层，变性蛋白质；尺寸约1-10 μm。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：包裹荧光标记的聚合物纳米颗粒的微泡示意图，纳米颗粒位于变性酪蛋白壳层中。 微泡的直径通常介于1 µm至10 µm之间。纳米颗粒的直径主要分布在100 nm至200 nm范围内38。缩写：C3F8 = 八氟丙烷气体。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示显微镜方法的长度与时间尺度图：明场、荧光、共聚焦和活体显微。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：明场、荧光、共聚焦和活体显微镜相关时间与长度尺度的示意图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="超声显微镜装置配备高速相机；含微泡的细胞培养；结果分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：明场显微镜实验的示意图。（A）实验装置，（B）时序图，以及（C）典型的记录帧。图（C）中的比例尺 = 10 µm。缩写：fps = 帧/秒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="超声气泡动力学实验装置；激光、显微镜、相机；时序图；气泡成像结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：荧光显微镜实验的示意图。（A）实验装置，（B）时序图，以及（C）一个典型的记录帧。图（C）中的比例尺 = 10 µm。缩写：fps = 帧每秒。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微泡注射的超声光学装置，含数据时间线和荧光结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：活体显微镜实验的示意图。 （A）实验装置，（B）时序图，以及（C）典型的记录图像。 （C）中的比例尺 = 50 µm。绿色代表葡聚糖-FITC，红色代表纳米颗粒。缩写：GaAsP = 磷化砷化镓。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于形貌与结构分析的纳米颗粒荧光及扫描电镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 6"> 
图6：单个纳米颗粒-蛋白稳定化微泡的三维结构。 （A）采用共聚焦显微镜显示纳米颗粒，（B）采用扫描电子显微镜显示三维结构。（B）经34许可复制。图（A）比例尺 = 5 µm；图（B）比例尺 = 2 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="超声中的气泡动力学；显示振荡的时间与半径关系图的实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图7"> 
图7：在1 MHz超声频率和142 kPa声压振幅作用下，一个半径为2.89 µm的纳米颗粒-蛋白稳定微泡的典型球形振荡。 （A-D）来自高速记录的图像及其对应的气泡半径随时间变化曲线（底部）。比例尺 = 5 µm，红线表示初始半径。照明轮廓（任意单位）以黄色表示。放大倍数为120倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞融合过程；时间延时显微镜，A-B 比较；荧光发射；0-180 µs 时间间隔。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图8"> 
图8：高速荧光显微镜拍摄的图像序列。（A）在2 MHz超声频率和600 kPa声压振幅下，对由纳米颗粒和蛋白稳定的微泡进行超声辐照，成功递送荧光标记的纳米颗粒。（B）在2 MHz超声频率和210 kPa声压振幅下，对由纳米颗粒和蛋白稳定的微泡进行超声辐照，纳米颗粒递送失败。比例尺 = 10 µm。放大倍数为120倍。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="神经元活动的荧光显微镜延时成像，示意图显示60秒内的动态成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62251/62251fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图9"> 
图9在1 MHz超声频率和800 kPa声压振幅条件下，对纳米颗粒-蛋白稳定的微泡进行超声辐照后的活体显微成像。 (A) 血管内的纳米颗粒，以及 (B) 白色虚线框所示区域的图像序列A）显示葡聚糖（绿色）和纳米颗粒（红色）的外渗。比例尺 = 50 µm放大倍数为20倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62251/62251fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文所述方案可用于表征用于超声触发药物递送应用的荧光标记微泡的响应特性，包括其激活机制及其生物效应。本文涵盖了一系列 体外 和 体内 用于捕捉相关空间和时间尺度的显微技术。

微泡造影剂在超声介导的药物递送应用中具有广阔前景。将药物包封于纳米颗粒中可减少全身性...

本方案可用于表征专为超声触发药物递送应用而设计的荧光标记微泡的响应特性，包括其激活机制和生物效应。关键在于结合多种成像技术，使我们能够在不同空间尺度和时间尺度上揭示微泡介导的超声触发药物递送这一多尺度问题。进行明场显微镜单个微泡成像时，使用19号排气针，并用配备19号针头的1毫升注射器从玻璃小瓶中取出少量微泡悬液，转移至小管中，以便下一步更方便地进行移液操作。使用移液器将微泡溶液用过滤后的磷酸盐缓冲液稀释。用10毫升注射器将样品注入样品池的一个出口，直至样品池充满且无气泡产生，必要时可继续注入更多样品。关闭样品池的两个阀门，并将样品池垂直放置于显微镜的光轴方向。在样品分析前，先在任意波形发生器上设定所需的超声驱动频率和声压。从样品池的一个角落开始观察视野，使用XYZ载物台移动样品池，使单个微泡位于显微镜的视野范围内，然后将连接至水浴的光纤连接到频闪灯，并开始记录。每种超声参数设置下可重复成像任意所需次数，每次分析时需将样品池移动至少两毫米，以确保新视野中包含未经超声辐照的微泡。对于微泡的荧光显微成像，在磷酸盐缓冲盐水中稀释微泡溶液（方法如前所述）后，于任意波形发生器上设定所需的超声驱动频率和声压，并在脉冲延迟发生器上设定激光触发延迟时间，以实现对微泡中纳米颗粒的荧光激发。随后使用XYZ载物台移动样品池，定位单个微泡并将其调整至物镜的焦平面上，然后触发记录。根据需要，通过调整超声设置并移动样本架至新的视野范围来重复成像操作，操作方法如前所述。进行活体显微成像时，首先将加热的动物固定装置放置在波导与物镜之间的XY定位平台上，并在波导表面添加耦合凝胶。将尾静脉导管插入麻醉后的荷瘤小鼠尾静脉中，并将安装有观察窗室的小鼠放入加热的固定装置内。在盖玻片上添加一滴水。为了观察肿瘤组织的血管结构，通过尾静脉导管静脉注射 30 微升浓度为 4 毫克/毫升的荧光标记 2 兆道尔顿葡聚糖，然后使用 XY 平移载物台移动小鼠，直至找到具有合适血管的视野。根据实验参数调整帧率、视野范围和录像时长，并记录血管的基线图像。在获取基线图像后，于任意波形发生器上设定超声驱动频率、脉冲长度和声压幅度，并通过静脉注射将 50 µL 微泡样品注入尾静脉。随后按照演示方法对血管系统进行成像。通过共聚焦荧光显微镜对微泡进行分析，结果显示微泡壳层的颗粒分布不均匀。微泡的整体结构可通过扫描电子显微镜进一步观察。利用明场显微镜分析超声辐照下微泡的径向动力学行为及其现象学特征，可评估微泡半径随时间的相对变化。此处展示了一个典型成功递送荧光标记纳米颗粒的图像序列。当激光照射到微泡时，可观察到嵌入微泡壳中的纳米颗粒发生荧光。然而，如本例失败的递送所示，荧光纳米颗粒仅在微泡壳表面发光，而微泡在超声暴露期间保持完整。活体多光子成像可用于确定纳米颗粒在超声暴露过程中时空外渗情况，这有助于理解并优化超声介导纳米颗粒递送的潜在机制。在所有空间和时间尺度上实现光学与声学通路的完美对齐，为超声触发的药物递送提供了全面深入的理解。我们通过多尺度实验所获得的结果，现将被转化为临床实践。这些结果将为包括癌症治疗在内的多种治疗应用提供宝贵的见解。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用于表征用于超声触发药物释放的荧光标记微气泡的多时间尺度显微镜方法

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制备并使用荧光和放射性示踪剂标记微泡

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单层保护金纳米颗粒薄膜的合成、组装及表征用于蛋白质单层电化学研究

学习多时间尺度显微镜技术，用于表征荧光标记微气泡在超声触发药物释放中的激活机制与生物效应。该方法结合明场、荧光和活体显微镜技术，为癌症治疗等临床应用提供重要见解。

用于表征荧光标记微泡在超声触发药物释放中应用的多时间尺度显微方法

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