准备辐照和标记的雄性 埃及伊蚊 ，以便在操作性昆虫技术计划中释放

该协议的独特价值在于，两名人员在小型实验室空间中使用现成的设备可以产生足够的无菌蚊子来支持50英亩的运行SIT计划。这种技术的效率和低成本使得即使是小型蚊虫控制区也能获得，难以增强其综合病媒控制计划。演示该程序的将是我和研究部门的生物科学实验室技术人员芭芭拉·拜耳。

要从蛹中饲养成年埃及伊蚊，请准备 60 x 60 x 60 厘米的可折叠铝制养殖笼，带有 0.84 x 0.84 毫米孔大小的玻璃纤维网筛，并在每个笼子的一个垂直壁上放置一个伸手可及的丝袜套筒。在每个饲养笼中以一比一的性别比例放置一个装有埃及伊蚊的 1， 900 毫升塑料杯，并将袖子系好，将杯子放在笼子中，在 28 至 30 摄氏度高于 50% 相对湿度的 12:12 或 14:10 的明暗循环中封闭约 4 天，直到没有更多的成虫出现。将蛹放入饲养笼中24小时后，将装有海绵芯的10%蔗糖溶液容器放入每个笼子中，并从铁丝钩上悬挂浸泡在蜂蜜中的10×2厘米海绵，以分别为成年蚊子提供水分和营养。

在大多数成虫每两到三天出现48至72小时后，在接下来的三到四周内，每个笼子在一个小羊皮避孕套中填充50至100毫升去纤维化的牛血，并在热水浴中将避孕套加热至约37摄氏度。用毛巾小心地拍下避孕套后，将部分干燥的避孕套放在笼子内的单个纸衬里的培养皿中 30 到 60 分钟。每次喂血后 48 至 72 小时，将一个 1， 900 毫升的产卵杯，内装有 800 毫升过滤的蛹水，并配有一张 8 至 10 x 30 厘米的种子发芽纸，沿杯子的内周齐平安装到每个笼子中。

要从卵中饲养埃及伊蚊幼虫，请使用含有 5， 000 至 10， 000 个卵的产卵纸，并垂直于产卵线切割 3 到 7 厘米的部分。将一块放入一个新的 460 毫升容器中，一半装满自来水和一小撮粉碎的鱼食片。盖上盖子并剧烈搅拌容器至少一分钟，然后将所有内容物倒入装有三升自来水和 50 毫升棕色浆液的幼虫饲养盘中。

用开始日期、菌株信息和喂料时间表标记平底锅。一旦达到幼虫盘中幼虫的近似阈值比例，将每个锅的内容物倒入 20 至 40 号筛子中，并使用挤压瓶自来水将蛹和幼虫从筛子中洗出到三升刻度塑料烧杯中。为了将雄蛹与幼虫和雌蛹分开，将每个烧杯的内容物分成多个 1.9 升塑料容器，并在蛹分离器底部的水闸下方放置一个刚性的浅四升收集容器。

将两个三升刻度塑料烧杯装满约四分之三的自来水，并将水倒入分离器玻璃板之间的空间，同时调整顶部和底部旋钮，让水连续流过分离器。一旦积水均匀地聚集在距离板底部约 1.25 厘米的高度，用胶带标记分离器底部旋钮的起始位置，并开始将蛹和幼虫的容器倒入分离器中，同时以逆时针方式连续旋转底部旋钮从起始位置一到两厘米。当大部分或全部幼虫通过水闸冲入收集容器时，暂停水流并使用30号筛清除幼虫的收集容器。

当所有的幼虫都被移除后，倒入水并再次调整旋钮，让雄蛹被冲入收集容器中。然后将容器中的雄蛹倒入 20 号筛子中，并使用一升挤压瓶自来水将筛子中的蛹洗入单独的 1.9 升容器中。收集完所有雄蛹后，倒入水并调整旋钮以收集雌蛹。

使用数字 20 筛将雌蛹转移到新的 1.9 升容器中，如刚才所示。然后倒入水并再次调整旋钮，直到所有未成熟的蚊子都从分离器中冲洗出来。用筛子过滤收集的雄蛹，并将便便清洗到一升刻度烧杯中，用尽可能少的水。

小心地将蛹倒入衬有湿滤纸的培养皿中。使用新鲜的三毫升牧场移液管从培养皿底部清除积水，以防止工作期间蛹移动。捆扎培养皿和堆叠，然后密封在贴有标签的 3.8 升可重复密封袋中以适合辐照室。

为了标记定量批次的成年辐照雄性蚊子，从饲养笼中取出任何营养来源，并将一个笼子放入一个大的二氧化碳室中五到七分钟，敲击容器的侧面以驱逐任何附着在墙壁上的蚊子。在暴露期结束时，将蚊子转移到吸气器小瓶中并再次麻醉蚊子，然后将蚊子摇到白纸覆盖的工作台面上。小心地将所有雄性从工作台面吸入一个新的小瓶中，并重复曝光和收集，直到从所有饲养笼中收集所有成年雄性。

在性别分类过程中的某个时刻，生成一个仅包含 25 只成年雄性蚊子的小瓶。收集完所有雄蚊后，在天平上的去皮称重船上称量每只邪恶的蚊子，然后迅速将称重的蚊子倒入装有 50 毫克标记染料的 240 毫升卡片纸容器中。顺时针和逆时针倾斜并旋转容器一整圈，直到所有蚊子都被轻轻涂上一层，然后将蚊子倒入新的称重船中，然后将称重船对折，让蚊子通过 stockinette 套筒引导到释放容器中。

当大约两克雄性蚊子被添加到释放容器中时，将袜子套筒绑好，并在释放容器的边框上标记标签胶带，上面写上蚊子的染料颜色、容器编号和总重量。在这个具有代表性的雄性成年埃及伊蚊饲养、辐照和营销实验中，能够从三个饲养笼中收集两克雄性成年蚊子，并从两个笼子中收集两瓶25只雄蚊，以计算每只蚊子的平均重量。其中两批共丢弃了25只雌性。

在幼虫饲养周内及时观察性喂养对于产生发育良好的蛹进行分离至关重要。这在男性和女性之间产生了明显的区别，导致标记步骤中女性的出现率较低。除了将它们用于操作的SIT计划外，这些不育雄性还可以广泛用于研究与野生非辐照雄性相比的交配竞争，存活和辐照雄性的传播的实验。

修改技术以包括雌性蚊子使我们能够研究意外释放受辐射的雌性蚊子对繁殖力和媒介能力的影响。