冷冻电镜与Scipion单颗粒分析

Scipion 提供了一整套工具，能够以整合的方式为冷冻电镜中的单颗粒分析创建完整的处理流程，从而实现对生物样本的高分辨率三维重构。该框架支持利用多种图像处理软件包来构建处理流程，有利于不同方法之间的互操作性、可追溯性、可重复性，并能够整合不同方法所提供的信息，以生成更精确的结果。Scipion 持续不断发展，不断纳入新的方法和软件包。

此外，该方法已扩展至冷冻电子断层扫描和原子建模，也可用于创建处理此类数据的工作流程。在 Scipion 中创建项目，请点击“创建项目”以建立新项目。如需导入显微镜电影文件，请选择“导入电影”。

将出现一个新窗口。在此窗口中，输入数据的路径，并将显微镜电压设置为 300 千伏，球差设置为 2 毫米，振幅对比度设置为 0.1，放大倍数设置为 50,000，采样率模式设置为“来自图像”，像素尺寸设置为 1.34 埃。当所有参数设置完成后，点击执行。

当方法运行结束后，打开“摘要”选项卡，点击“分析结果”。此时将弹出一个新窗口，显示该方法生成的所有输出结果列表。要运行用于电影对齐的光流法，请打开 xmipp3 光学对齐方法，选择已导入的电影作为输入电影，并将“对齐帧范围”设置为第 2 至第 13 帧。

在“附加参数”中，将“使用先前的电影对齐以 SUM 帧”选项设置为“否”。其余所有选项均保持默认设置，然后执行程序。单击“分析结果”以检查获得的显微图像以及估计位移的轨迹。对于每幅显微图像，均可查看其功率谱密度、用于在直角坐标和极坐标下对齐电影的轨迹，以及所获得显微图像的文件名。

与视频的单帧图像相比，显微照片中样品的颗粒明显更清晰可见。进行颗粒挑选时，打开 xmipp3 手动挑选方法，并选择先前获得的显微照片作为输入显微照片。点击执行。

将出现一个新的交互窗口。在此窗口中，将像素大小更改为 150。所选的显微照片将在更大的窗口中显示。

手动选取一个区域内的所有可见颗粒。当所有颗粒均被手动选取后，点击“激活训练”以开始学习过程。显微照片的其余区域将被自动选取。

检查已选取的颗粒。如需添加额外颗粒，请点击感兴趣的颗粒。如需删除错误的颗粒，可按住 Shift 键并根据需要点击相应颗粒。

当所有颗粒被自动选取后，依次选择接下来的四张显微照片，以创建一个具有代表性的训练集。每张选定的显微照片中的颗粒将被自动选取，需逐张检查并根据需要添加或删除颗粒。获得训练集后，点击“Coordinates”以保存所有已选取颗粒的坐标。

获取训练集后，打开 Xmipp3 自动选颗粒工具，指定之前在 Xmipp 粒子选区运行中完成的手动选区结果，并将“待选显微照片”设置为“与监督一致”。点击执行，生成约 100,000 个坐标。为应用一致性方法，打开 SPHIRE-CryoLO 选颗粒工具，将预处理后的显微照片设为输入显微照片，并将选颗粒模型设为默认值。

将置信度阈值设为 0.3，框大小设为 150，然后点击执行。该方法应生成约 100,000 个坐标。接下来，打开 xmipp3 深度共识挑选，将输入坐标设置为包含 sphire cryolo 和 xmipp3 自动挑选的输出结果，选择模型类型为预训练模型，并将“跳过训练并直接使用预训练模型评分”设为“是”，然后点击执行。

执行结束后，点击“分析结果”。在新窗口中，点击眼睛图标。此时将打开第二个新窗口，其中列出所有颗粒。

该列中的 Z 分数值可反映每个颗粒的质量，低值表示质量较差。要按 Z 分数从高到低排序颗粒，请点击 Xmipp Z 分数深度学习，并选择 Z 分数高于 0.75 的颗粒。然后点击坐标，以创建包含约 50,000 个坐标的新的子集。

要局部计算分辨率，请打开 xmipp3 局部 MonoRes，将输入体积设为上一步精修的输出结果，将“是否使用半体积”设为“是”，分辨率范围设为 1 到 10 埃。参数设置完成后，点击执行。分辨率计算完成后，点击分析结果，然后选择显示分辨率直方图和显示彩色切片。

将展示体积中不同区域的分辨率。结构中心区域的大部分体素分辨率应接近3埃，而最差的分辨率将出现在结构的外周区域。还将显示每个体素分辨率的直方图，其峰值位于3埃或低于3埃处。

要应用锐化，请打开 xmipp3 局部去模糊锐化工具，并选择上一步精修的输出作为输入图谱，将分辨率图谱设置为获得的 MonoRes 图谱。命令执行完毕后，双击“摘要”选项卡中生成的输出体积集合，即可查看每次迭代生成的体积。

建议使用其他工具（如 UCSF Chimera）打开该体积数据，以更清晰地在三维空间中观察其特征。在本图中，可观察到傅里叶壳层相关性达到三埃，已非常接近奈奎斯特极限。如图所示，重建的三维体积切片展现出高度的细节和清晰定义的结构。

经过局部分析，大部分中心体素的分辨率达到三埃以下。然而，局部分辨率切片的外围区域显示出较低的分辨率，这与这些区域内观察到的模糊现象一致。经过后期处理后，三维图谱体积的高频信息得以显现，揭示出更多细节，并改善了结构的呈现效果。

当达到的分辨率足够高时，甚至可以观察到结构中的一些生物化学组分。如果获得的结构分辨率较低，且无法进一步优化至更高分辨率，则可观察到一个模糊的体积图，其傅里叶壳层相关系数较低，分辨率曲线和局部估计的直方图均不理想。完成颗粒挑选后，可通过二维分类来检查以评估颗粒质量。

例如，在此分类中，颗粒存在噪声、未居中或相互耦合，表明颗粒挑选不正确。另一个检查点可在初始体积估计期间进行。在此示例中，由于该方法的设置不正确，导致生成了错误的估计结果。

当获得分辨率足够高的三维图谱后，下一步便是为该图谱构建原子模型。此过程可在 Scipion 中利用建模插件完成。该技术可用于成功重构生物大分子，以评估其分子相互作用及生物复合物功能，从而为药物设计提供基础。