Name: 患者衍生的中枢神经系统转移异种移植模型的建立与利用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 了解建立患者来源中枢神经系统转移异种移植模型的三种方法：皮下 flank 植入、原位脑注射和心内注射。这些模型比传统细胞系更能准确再现人类肿瘤表型与分子特征，为临床前研究提供可靠平台。

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图3A取自我们之前的发表文献12，由梅奥诊所Jann Sarkaria博士实验室制备。

以下是一系列通过皮下侧腹植入建立PDX模型以及开展临床前研究的逐步操作方案，这些研究可用于测试治疗方法，有助于评估生物学变化及转移级联过程中的各个阶段。所有研究和模型均使用3至8周龄的雌性NOG小鼠。所有组织样本均在受试者知情同意下采集，并遵循经机构审查委员会（IRB）批准的方案进行。所有动物实验均按照经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案执行。
1. 通过腋下移植建立和扩增PDX模型
<ol>
	<li>PDX模型的建立
	<ol>
		<li>手术室中切除患者肿瘤后，将新鲜肿瘤组织置于合适的溶液（如DMEM）中，并立即置于冰上。使用过量的保存溶液（&#62;10 mL）以确保组织完全浸没。</li>
		<li>将组织转移至组织培养皿中，用 5 mL DPBS 冲洗。 
		注意：此步骤应在生物安全柜中使用无菌技术进行。应穿戴适当的个人防护装备（PPE），以防范可能的人类感染性病原体，采取必要的预防措施。</li>
		<li>切除肿瘤中的坏死区域。 
		注意：这可以被识别为组织中心区域的白色软化区。</li>
		<li>将剩余组织切成约 2 x 2 x 2 mm 的小块。</li>
		<li>将组织转移至含有生长因子减少型基底膜基质的微量离心管中，并置于冰上保存。确保有足够的基底膜基质（&#62;使用200 µL溶液以完全浸没每块组织。</li>
		<li>按照步骤1.3中所述方案，对不用于移植的剩余组织进行冷冻保存。</li>
		<li>在诱导室中使用2-5%异氟烷与氧气对动物进行麻醉。麻醉后，将动物转移至鼻罩以维持麻醉状态&#160;1.5-2.5% 异氟烷持续供氧。通过以下方式确认麻醉深度：&#160;缺乏足底反射。使用兽用眼科软膏以防止眼睛干燥&#160;手术过程中。在整个操作期间直至动物恢复前，为其提供保温支持。&#160;</li>
		<li>确定小鼠的植入位点。 
		注意：应位于小鼠的右侧或左侧，通常定位在腹部区域的侧面，肋骨后方。</li>
		<li>剃除手术区域的毛发，并用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭三次进行消毒。</li>
		<li>用镊子提起小鼠皮肤，沿皮肤做0.5–1 cm的切口。</li>
		<li>在切口处将一把手术剪刀缓慢插入皮下，于皮下间隙创建一个0.5–1 cm深的皮下袋。</li>
		<li>将一块肿瘤组织小心放入袋状切口内，并将其推至切口底部，以防止肿瘤滑出。</li>
		<li>使用4-0尼龙外科缝线缝合切口。 
		注意：也可使用其他伤口闭合方法，如不可吸收或可吸收缝线以及伤口夹。</li>
		<li>将小鼠放回笼中，并监测其从麻醉状态的恢复情况，直至能够自主行走。 
		注意：无需使用镇痛药，但如果观察到小鼠出现疼痛，可给予镇痛处理。</li>
		<li>每周监测一次肿瘤生长情况。每只小鼠预期形成一个肿瘤。 
		注意：移植后的肿瘤体积在初期可能会看似减小，但这无需担忧。当肿瘤变得可触及并进入对数生长期时，即视为已成瘤。此第一代传代称为 F0 代。</li>
		<li>肿瘤开始生长后，每周测量三次。使用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度。计算肿瘤体积时，采用公式：长度 × 宽度 × 宽度 / 2。</li>
		<li>当PDX肿瘤移植小鼠的肿瘤直径（以肿瘤最长边为准）超过15 mm时，采用CO₂处死小鼠。2 吸入一氧化碳2 诱导室麻醉后，以颈椎脱位法作为辅助处死方法。</li>
		<li>通过做切口切除动物侧腹部的肿瘤。用钝头剪刀和镊子轻轻解剖切除的肿瘤。操作时，先剪除肿瘤表面的皮肤，再将肿瘤从其下方的肌肉层分离。</li>
		<li>将肿瘤组织转移至 &#62;10 mL 适宜的保存液（如 DMEM），立即置于冰上。该肿瘤可进行冷冻保存或传代至另一批小鼠。将此传代记为 F1。 
		注意：再次传代将使肿瘤传代次数记为F2，依此类推。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDX模型的传代培养
	<ol>
		<li>从步骤1.1.19中保存在储存溶液中的切除肿瘤开始。</li>
		<li>将组织转移至组织培养皿中，并用 5 mL DPBS 冲洗。</li>
		<li>切除肿瘤中的坏死区域。</li>
		<li>将组织切成约 2 x 2 x 2 mm 的小块。</li>
		<li>将组织转移至含有生长因子减少型基底膜基质的微量离心管中（&#62;200 µL，并置于冰上保存。</li>
		<li>将未用于扩增的剩余组织按照步骤1.3中所述方案进行冷冻保存。</li>
		<li>在诱导室中使用2-5%异氟烷对动物进行麻醉&#160;氧气。麻醉后，&#160;将动物转移至鼻罩以维持麻醉状态&#160;1.5-2.5% 异氟烷持续供氧。通过以下方式确认麻醉深度：&#160;缺乏足底反射。&#160;使用兽用眼科软膏以防止眼睛干燥&#160;手术过程中，需在整个操作期间直至动物恢复前，为其提供保温支持。</li>
		<li>确定小鼠的植入位点。 
		注意：应位于小鼠的右侧或左侧腹部区域，通常在肋骨后方。</li>
		<li>剃除手术区域的毛发，并用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭三次进行消毒。</li>
		<li>在小鼠的一侧 flank 处做一个 0.5–1 cm 的切口。</li>
		<li>在切口处将一把手术剪刀缓慢插入皮下，于皮下间隙创建一个0.5–1 cm深的皮下袋。</li>
		<li>将一块肿瘤组织小心放入袋状切口内，并推至底部，以防止肿瘤滑出。</li>
		<li>使用4-0尼龙手术缝线或其他伤口闭合方法关闭切口。</li>
		<li>将小鼠放回笼中，并监测其从麻醉状态中恢复，直至能够自主行走。 
		注意：无需使用镇痛药，但如果观察到小鼠出现疼痛，可给予镇痛处理。</li>
		<li>在潜伏期（非生长期），每周监测一次肿瘤生长情况。每只小鼠预期形成一个肿瘤。 
		注意：移植后的肿瘤体积在初期可能会看似减小，但这无需担忧。一旦肿瘤变得可触及并开始持续生长，即视为已成瘤。</li>
		<li>肿瘤开始生长后，每周测量三次。使用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度。采用以下公式计算肿瘤体积：长度 × 宽度 × 宽度 / 2。</li>
		<li>当PDX肿瘤移植小鼠的肿瘤直径（以肿瘤最长边为准）超过15 mm时，使用CO2吸入法在CO2诱导室中实施安乐死，随后以颈椎脱位作为辅助方法。</li>
		<li>用剪刀在动物 flank 部位做切口，使用钝头剪刀和镊子轻柔地分离并切除肿瘤。</li>
		<li>将肿瘤组织转移至 &#62;10 mL 适宜的保存液（如 DMEM），然后立即置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDX肿瘤的冷冻保存
	<ol>
		<li>当PDX肿瘤移植小鼠的肿瘤直径（以肿瘤最长边为准）超过15 mm时，实施安乐死。采用CO₂处死法进行安乐死。2 吸入一氧化碳2 诱导室麻醉，随后以颈椎脱位作为辅助方法。</li>
		<li>通过做切口，用钝头剪刀和镊子轻柔地从动物的 flank 部位切除肿瘤。</li>
		<li>将肿瘤组织转移至 &#62;10 mL 适宜的保存液（如 DMEM），然后立即置于冰上。</li>
		<li>将组织转移至组织培养皿中，并用 5 mL DPBS 冲洗。</li>
		<li>切除肿瘤中的坏死区域。</li>
		<li>将组织切成约 2 x 2 x 2 mm 的小块。</li>
		<li>将组织转移至含有20% DMEM、70% FBS和10% DMSO的冻存管中。</li>
		<li>将冻存管转移至冻存容器中，并置于 -80 °C 冰箱中。</li>
		<li>当冻存管冷却至 -80 °C 时，将其转移至液氮中保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 前临床研究中的接种途径
<ol>
	<li>皮下 flank 植入。 
	注意：皮下 flank 植入操作简便，可用于研究转移级联过程的所有步骤。
	<ol>
		<li>使用生长中的 PDX 肿瘤或冻存的 PDX 肿瘤进行初次 flank 植入。</li>
		<li>对于生长中的 PDX 肿瘤，当肿瘤长度超过 15 mm 时，采用 IACUC 批准的方法处死小鼠；切除肿瘤并将肿瘤组织转移至合适的保存液（如 DMEM）中，并立即置于冰上。</li>
		<li>对于冻存的 PDX 肿瘤，将冻存的 PDX 组织迅速浸入 37 °C 水浴中解冻。</li>
		<li>执行步骤 1.2.2–1.2.19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过颅内注射将肿瘤植入脑部（正位植入）。 
	注意：该模型可用于测试药物穿透血脑屏障（BBB）的能力以及研究肿瘤定植过程。本节主要参考肿瘤解离试剂盒的使用（见材料表）。不同类型的组织需要不同的解离方案。建议使用者测试并优化方案以最大化解离效率。
	<ol>
		<li>当 PDX 肿瘤长度超过 15 mm 时，采用 &#160;IACUC 批准的方法处死荷瘤小鼠。</li>
		<li>在生物安全柜内的无菌条件下，手术切除 PDX 肿瘤，并将其保存于冰上的 DMEM 中。</li>
		<li>根据制造商说明书，在适当离心管中将酶混合物加入 DMEM 配制解离液。</li>
		<li>在细胞培养皿中用 5 mL DPBS 清洗肿瘤组织。</li>
		<li>去除肿瘤中的坏死区域。</li>
		<li>将肿瘤切成 2–4 mm 长的小块。</li>
		<li>将肿瘤组织块转移至含有酶混合物的离心管中。</li>
		<li>将离心管固定在组织解离仪上，运行适合该组织类型的程序。请参考制造商说明书选择合适的程序及所需解离时间。</li>
		<li>程序完成后，用 70 µm 细胞筛过滤细胞悬液。</li>
		<li>用 20 mL DMEM 冲洗细胞筛。</li>
		<li>将解离后的细胞以 300 × g 离心 7 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，并将细胞重悬于 DPBS 中。</li>
		<li>计数细胞，并稀释至所需浓度。</li>
		<li>根据制造商说明安装立体定位仪，并为小鼠准备加热垫。所有操作区域使用 70% 乙醇消毒。</li>
		<li>在诱导室中使用 2–5% 异氟烷和&#160;氧气对动物进行麻醉。一旦动物失去意识，&#160;将其转移至鼻罩以维持麻醉，异氟烷浓度为&#160;1.5–2.5%，并持续供氧。通过&#160;足底反射缺失确认麻醉深度。&#160;涂抹兽用眼膏以防止手术期间眼睛干燥&#160;。在整个操作过程中直至动物恢复前，提供保温支持。</li>
		<li>剃除小鼠头部毛发以暴露头皮，准备手术区域。</li>
		<li>给予小鼠适当的镇痛药，例如通过皮下注射给予 1 mg/kg 的缓释型布托啡诺（Buprenorphine SR）一次剂量。</li>
		<li>将小鼠固定于立体定位仪上。确保小鼠咬住咬合块，并使用耳杆牢固固定其头部。 
		注意：若用镊子轻推头部时无移动，则表明小鼠已正确固定。</li>
		<li>使用聚维酮碘和 70% 乙醇交替擦拭三次，对剃毛区域进行消毒。</li>
		<li>在头皮上做一条 5–7 mm 的纵向切口，暴露颅骨并牵开头皮。</li>
		<li>使用钝性外科器械（如镊子）刮除骨膜。</li>
		<li>定位颅骨上的前囟（bregma）。</li>
		<li>将立体定位仪的针头置于前囟上方，并将坐标归零或记录臂上的坐标值。</li>
		<li>将定位臂向后（尾侧）&#160;移动 1 mm，再向右（远离中线）移动 1 mm。</li>
		<li>用永久性记号笔标记该位置。如果定位臂上有用于固定注射器的槽，则可将记号笔固定在槽中以标记位置。</li>
		<li>在该位置钻一个微小的颅骨钻孔。注意不要施加过大压力，以免钻入脑组织。</li>
		<li>用 5 µL、26 G 的 Hamilton 注射器吸取 5–10 × 104 个细胞（体积为 1–2 µL），并将其安装至立体定位臂上。</li>
		<li>缓慢将 Hamilton 注射器针头插入脑组织 2 mm 深度。</li>
		<li>以设定速率开始注射细胞，通常为 0.2–0.5 µL/min。</li>
		<li>注射完成后，缓慢将针头从脑组织中撤出。</li>
		<li>用骨蜡填充钻孔。</li>
		<li>使用手术缝线或手术胶水关闭切口。</li>
		<li>将小鼠放回笼中，并监测其从麻醉中恢复的情况。</li>
		<li>定期监测动物状态，当达到批准方案中规定的安乐死 humane endpoint 标准时，实施安乐死。 
		注意：脑内成功成瘤会导致动物状况恶化，常表现为头部倾斜、毛发粗糙、弓背、眯眼、活动减少以及低体况评分（BCS &#60; 2）。</li>
		<li>对安乐死动物进行尸检，随后进行组织学分析以确认脑内是否存在肿瘤。记录从植入到安乐死所需的时间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过心内注射植入 PDX 模型 
	注意：该模型可用于研究肿瘤细胞进入循环后对特定器官的趋向性（organ tropism）。本节同样使用肿瘤解离试剂盒，并需根据不同组织类型进行方案优化。
	<ol>
		<li>执行步骤 2.2.1–2.2.13。</li>
		<li>在诱导室中使用 2–5% 异氟烷和&#160;氧气对动物进行麻醉。一旦动物失去意识，&#160;将其转移至鼻罩以维持麻醉，异氟烷浓度为&#160;1.5–2.5%，并持续供氧。通过&#160;足底反射缺失确认麻醉深度。&#160;涂抹兽用眼膏以防止手术期间眼睛干燥&#160;。在整个操作过程中直至动物恢复前，提供保温支持。</li>
		<li>将小鼠置于仰卧位。</li>
		<li>剃除胸部毛发，并使用聚维酮碘和 70% 乙醇交替擦拭三次进行消毒，准备手术区域。</li>
		<li>用带 28 G 针头的注射器吸取 0.5–10 × 105 个细胞，总体积不超过 100 µL。 
		注意：所需细胞数量因模型侵袭性强弱而异，每种模型的最佳细胞数应通过实验确定。</li>
		<li>确定注射部位（位于小鼠胸骨略偏左侧，胸骨切迹与剑突之间的中点）。</li>
		<li>在注射部位将针头垂直刺入小鼠体内。</li>
		<li>观察针筒内是否有回流血液，以确认针头成功进入左心室。在不移动针头的情况下，缓慢将细胞注入左心室。</li>
		<li>垂直缓慢拔出针头。</li>
		<li>在注射部位覆盖一块无菌纱布，并施加压力约 1 分钟直至出血停止，同时允许胸部正常起伏以维持呼吸。</li>
		<li>将小鼠脱离麻醉，并让其在加热垫上恢复。 
		注意：成功成瘤会导致动物状况恶化，常表现为毛发蓬乱、弓背、眯眼、活动减少以及低体况评分（BCS &#60; 2）。</li>
		<li>定期监测动物状态，当达到批准方案中规定的安乐死 humane endpoint 标准时，实施安乐死。</li>
		<li>对安乐死动物进行尸检以识别转移灶，随后进行组织学分析以确认靶器官中是否存在肿瘤。记录从心内注射到安乐死所需的时间。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无披露信息。

本文详细介绍了PDX模型的建立与传代方法。同时展示了三种可用于评估中枢神经系统转移瘤的临床前研究的接种方法。具体方法的选择应根据实验目的而定。在某些情况下，采用多种接种途径将更有优势。例如，皮下侧 flank 植入法可简便地用于研究药物对肿瘤生长的抑制效果，并评估药物对其靶点的作用，同时可直观观察肿瘤大小，便于监测和测量。然而，在确定了靶点可行性和抗肿瘤生长特性后，可进一步开展原位移植研究，以评估生物制剂穿透血脑屏障（BBB）的能力，并研究其在脑肿瘤微环境中的作用效果。此外，生存期的评估在原位移植和心脏内注射模型中更为准确。
由于存在脑微环境和血脑屏障（BBB），脑转移瘤PDX模型的颅内注射通常是首选的临床前模型。然而，研究表明，脑转移瘤具有改变血脑屏障的能力，从而影响分子向肿瘤的通透性16。这些血脑屏障的变化在颅内植入的肿瘤模型中无法体现，因此临床前药物研究可能无法完全反映患者肿瘤的真实反应。尽管存在这一局限性，颅内注射仍然是在临床前模型中评估药物穿越血脑屏障的通透性和疗效的最佳方法。颅内模型的另一个挑战在于难以监测肿瘤生长，需要依赖影像学技术。传统上采用荧光或生物发光标记对PDX进行病毒转导，但该方法操作较为困难。目前，一些无需引入标记物的小鼠成像技术正在发展，有望提高对这类原位脑肿瘤在临床前研究中监测的便利性。这些技术包括磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）成像以及微型计算机断层扫描（micro-CT）。最后，颅内注射可能无法准确模拟脑外中枢神经系统转移的微环境，例如软脑膜转移。在此情况下，可通过向小脑延髓池注射，以更准确地模拟软脑膜转移17。
对PDX模型的表型和分子特征进行表征，对于选择最适合的临床前研究模型至关重要。肿瘤的潜伏期可从7至140天不等，移植成功率也可能存在高度差异12。每种PDX模型所需的最佳接种动物数量以及开始治疗的最佳时机，必须依据该模型的具体特征并通过实验经验来确定。此外，PDX肿瘤的分子谱型对于筛选最具代表性的临床前研究模型也具有重要意义。模型在分子水平上越接近供体组织，其预测临床反应的能力就越强。同时，必须确保从人类数据中选定的靶点在所选PDX模型中存在，并且能够持续传代数代，因为已有研究表明，克隆更替会导致优势克隆具有不同的基因组特征。鉴于此，中枢神经系统转移性PDX肿瘤的表型和分子特征已在多个传代过程中得到了系统而深入的表征12。
尽管使用中枢神经系统转移瘤PDX模型具有诸多优势，但其应用仍存在若干局限性。首先，PDX模型的肿瘤微环境发生改变，尤其是缺乏完整的免疫系统，这是已被广泛记录的局限性18。将人源肿瘤异种移植至小鼠体内后，随着传代次数的增加，人源间质会逐渐被小鼠间质所取代，通常在数次传代后人源间质基本完全被替换19。然而，尽管肿瘤微环境存在差异，皮下移植的PDX肿瘤与原始患者肿瘤相比，在分子特征上并未出现显著差异12，这表明皮下模型仍然是研究中枢神经系统转移的良好实验模型。其次，使用免疫缺陷动物导致肿瘤内缺乏免疫细胞浸润，且宿主无法产生整体免疫应答，从而限制了宿主对抗癌症生长的一种基本机制12。尽管目前已可使用移植了人源免疫细胞的人源化小鼠来研究特定免疫细胞与肿瘤之间的相互作用，但相关研究在方法学、实验策略及结果解读方面仍存在诸多问题和争议20。
尽管大多数PDX模型已被证明具有遗传稳定性，但我们及其他研究者发现，在极少数情况下，即使在没有治疗或其他外部选择压力的情况下，肿瘤的克隆也可能发生改变，例如次要克隆的取代现象12,14,15。这可能导致分子特征发生显著变化，最终使肿瘤不再反映患者原发肿瘤中主导克隆的特征12。尽管表现出克隆演替的PDX模型在临床前研究中仍具有一定应用价值，但许多原本作为靶向目标的基因（如Her2）可能在克隆演替过程中丢失。因此，建议对PDX模型进行定期筛查，以确认其是否仍保留目标克隆的分子特征。
总之，PDX 模型不仅是研究中枢神经系统转移瘤的优良模型系统，也适用于其他肿瘤类型的研究。这些模型的建立表明，它们在很大程度上反映了人类中枢神经系统转移瘤的表型、分子特征及异质性8,9,10,12。PDX 模型不仅可有效用于研究中枢神经系统转移瘤的生物学特性，还可作为具有生理相关性的临床前模型，替代过去长期过度使用的细胞系模型，用于中枢神经系统转移瘤的 in vivo 研究。不可否认，PDX 模型与供体患者肿瘤之间仍存在差异12,18。明确这些差异对于合理设计和实施临床前研究至关重要。最后，通过选择多种接种途径，PDX 模型在应用上具有高度灵活性，可用于研究该疾病的多个方面。PDX 模型无疑将在深化我们对中枢神经系统转移瘤的理解以及推动新型疗法的开发中发挥重要作用。

近年来，中枢神经系统（CNS）转移的发生率有所上升1,2,3。针对CNS转移的传统治疗方法，如肿瘤切除术、全脑放疗和立体定向放射外科手术，大多仅具有姑息作用，极少能够根治，且可能引发严重的副作用，例如认知功能下降1。近期，许多新型靶向治疗和免疫疗法正在被开发用于CNS转移的治疗，这些疗法在提高疗效的同时副作用更少，展现出良好的应用前景4。
将临床前研究结果转化为有意义的临床终点，通常需要高效且具有预测性的建模策略。在中枢神经系统转移研究领域，传统上依赖的是细胞系异种移植模型。然而，这些细胞系模型无法真实反映宿主肿瘤的实际肿瘤行为，也不能代表疾病的组织学或分子异质性。此外，细胞系模型能够适应体外（in vitro）生长条件，因而会丧失宿主肿瘤的原始特性。近年来，在转化癌症研究中，患者来源的异种移植模型（PDXs）应用日益广泛，该模型将患者的肿瘤组织移植到免疫缺陷或人源化小鼠体内。研究表明，PDX模型通常能够忠实地重现肿瘤生长、组织学特征，维持肿瘤异质性、转移潜能以及分子遗传特征。此外，PDX模型具有预后价值，其肿瘤潜伏期与患者的总生存期相关，并且已被证实可准确预测患者临床试验中的治疗反应5,6。
中枢神经系统转移瘤的患者来源异种移植模型（PDX）近年来不断涌现。这些模型大多代表起源于单一原发部位的肿瘤，例如非小细胞肺癌（NSCLC）7、乳腺癌8,9和黑色素瘤10,11。最近，研究人员建立并表征了一组数量较大且类型多样的PDX模型，涵盖八种不同的组织学亚型12。研究表明，用于中枢神经系统转移瘤的PDX模型在组织学和分子水平上均与其原始患者肿瘤高度相似，同时也展现出特有的组织学差异与共性10,12。此外，尽管大多数中枢神经系统转移瘤PDX模型保留了人类肿瘤的克隆异质性，但部分模型显示出克隆演替的证据12，因此也适用于通过监测治疗后克隆变化来研究治疗耐药性。
本文所述方案概述了PDX模型的建立方法以及在中枢神经系统转移瘤临床前研究中使用的多种接种途径（图1）。这些移植方法在模拟肿瘤生长和转移能力方面各有差异。本方案重点介绍了每种接种途径的应用，并展示了其在中枢神经系统转移瘤研究中的使用方式。

<table><tbody><tr><td>25G 针头</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m 细胞滤筛</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇擦拭巾</td><td>VWR</td><td>470106-486</td><td></td></tr><tr><td>骨蜡</td><td>MedVet</td><td>W31G-RL</td><td></td></tr><tr><td>CIEA NOG 小鼠</td><td>Taconic</td><td>NOG-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR（缓释布托啡诺）</td><td>MWI</td><td>072117</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 管</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo 组织解离仪</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 注射器</td><td>Sigma</td><td>20919</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel 生长因子减少型（GFR）</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>MedVet</td><td>PH-PURALUBE-VET</td><td></td></tr><tr><td>PBS/DPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘棉签</td><td>VWR</td><td>15648-906</td><td></td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>手术钻</td><td>Stoelting</td><td>58610</td><td></td></tr><tr><td>手术粘合剂</td><td>MedVet</td><td>VG3</td><td></td></tr><tr><td>手术缝合线</td><td>MedVet</td><td>MMV-661-V</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>VWR</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>肿瘤解离试剂盒</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-929</td><td></td></tr></tbody></table>

中枢神经系统转移患者来源异种移植模型的建立与应用

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

中枢神经系统（CNS）转移瘤新疗法的开发一直受到缺乏能够准确模拟该疾病的临床前模型的限制。与传统的细胞系模型相比，源自患者的异种移植（PDX）CNS转移瘤模型已被证明能更真实地反映人类疾病的表型和分子特征，同时也能更好地再现患者肿瘤的异质性和克隆动态。在建立临床前试验时，可用于移植患者来源组织的接种位点有多个，每个位点各有优缺点，并适用于研究转移级联过程中的不同阶段。本文所述方案介绍了如何建立PDX模型，并展示了在临床前研究中使用CNS转移瘤PDX模型的三种不同方法，同时讨论了每种方法的应用范围及其局限性。这些方法包括皮下侧腹移植、脑内原位注射和心内注射。皮下侧腹移植最易于监测，因此在临床前研究中最为便捷。此外，已观察到从侧腹移植后肿瘤向脑部及其他组织发生转移的现象，表明肿瘤经历了包括内渗、外渗和定植在内的多个转移步骤。脑内原位注射是重建脑肿瘤微环境的最佳选择，适用于评估生物制剂穿透血脑屏障（BBB）的能力，但该方法绕过了转移级联过程中的大部分步骤。心内注射可有效促进肿瘤向脑部转移，也适用于研究器官趋向性。尽管该方法跳过了转移级联的早期步骤，但肿瘤细胞仍需经历循环存活、外渗和定植过程。因此，PDX模型的应用价值受到肿瘤接种途径的影响，具体方法的选择应由科学问题及实验的整体目标决定。

在 flank 部位传代的 PDX 肿瘤最容易进行移植、监测和切除，通常建议用于 PDX 肿瘤的初次建立和传代（图 1）。在建立或传代 PDX 肿瘤时，应将肿瘤组织移植到多只动物体内，因为肿瘤成瘤率可能存在差异，并非每一块肿瘤组织都能在小鼠体内成功成瘤。已有方法可用于将中枢神经系统转移性 PDX 肿瘤直接建立于脑内13。然而，这些方法仍更具挑战性，成瘤率较低，且肿瘤的传代与监测远比 flank 移植困难得多。
如果患者肿瘤不易获得，也可从多种来源获取中枢神经系统转移瘤的PDX模型，包括学术实验室或商业公司的资源库。获得肿瘤后，首要任务是尽可能扩增并冻存大量组织，确保保存足够数量的低代次肿瘤。这将保证后续使用PDX模型开展无限次数的研究时有充足的材料可用。与永生化细胞系类似，PDX肿瘤应进行冻存并在低代次使用，因为随着时间推移，遗传漂变会导致PDX的表型和基因型发生变化12,14,15。无论PDX肿瘤来源如何，都必须定期对PDX模型及小鼠种群进行人源和鼠源病原体的筛查，例如针对人类的HIV和肝炎病毒，以及针对小鼠的Corynebacterium bovis。这有助于防止病原体从PDX模型传播给操作人员以及实验和动物房中的其他小鼠。
本文所述的移植方法可用于研究肿瘤生物学、评估转移级联过程的多个方面，并用于临床前研究。皮下移植的主要优势在于能够方便地随时间监测肿瘤，因为肿瘤可见，且其生长情况可使用游标卡尺轻松测量。该方法可作为验证药物靶点可行性的良好起点。如果需要考虑脑内微环境的影响，且该微环境可能改变肿瘤的生长或分子特征，则优先选择颅内移植。此外，颅内移植使肿瘤位于血脑屏障（BBB）之后，因此对于评估需穿越血脑屏障的药物疗效的临床前研究至关重要。然而，监测PDX肿瘤的生长较为困难，若细胞已被标记，则需依赖放射学成像或生物发光成像。在临床前研究中确定何时开始药物治疗，需要依赖成像数据来监测肿瘤生长，或掌握携带特定PDX肿瘤小鼠的平均生存期。此外，颅内移植绕过了转移级联过程中的所有关键步骤，因此仅适用于研究脑内药物疗效及肿瘤微环境。尽管不同移植部位的肿瘤微环境存在差异，但PDX肿瘤的形态学特征相似，这一点可通过来源于小细胞肺癌原发灶的脑转移瘤（CM04）得到证实（图2）。在皮下肿瘤、颅内肿瘤以及经心内注射引发的腹腔转移灶中，均可观察到小细胞肺癌的典型形态特征：细胞核小、胞质稀少。此外，既往已有研究观察到皮下移植肿瘤可发生自发性转移12，表明诸如肿瘤细胞入血、外渗及定植等转移过程可在皮下肿瘤中重现并加以研究，而这些过程在脑内原位移植模型中则无法实现。总体而言，皮下移植被证实是研究中枢神经系统转移生物学机制和开展临床前研究的适宜方法。
心内注射通常用于研究肿瘤的器官趋向性和转移潜能。注射的肿瘤细胞需经历转移级联的多个步骤，包括在循环中存活、血管外渗以及在转移部位定植。与脑部原位注射类似，若无影像学检查或细胞标记，可能难以追踪肿瘤转移的进展。然而，与原位移植相同，成功接种后随着肿瘤扩散，动物的健康状况会随时间推移逐渐恶化。 图3A 在源自黑色素瘤的中枢神经系统转移PDX模型M2中，经心内注射后表现出脑转移。PDX肿瘤（CM04）心内注射后导致腹腔和肝脏转移。图3B）。其他评估的器官，如肺、肾和卵巢，均未见明显转移灶。
<img alt="PDX模型示意图：肿瘤组织处理、建立、传代及用于研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：建立、传代和使用PDX模型进行临床前研究的一般工作流程示意图。 针对每种接种方法，其涉及的转移级联步骤列于各方法下方。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="不同注射方法在组织切片中的组织学比较： flank、颅内、心脏内。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：不同接种方法下PDX肿瘤的组织学特征。 对来源于小细胞肺癌（CM04）的中枢神经系统转移性PDX肿瘤，在免疫缺陷小鼠中通过三种不同方法接种后进行苏木精和伊红（H&amp;E）染色，结果显示其肿瘤的病理组织学和形态学特征与小细胞肺癌相似，表现为小核和稀少的细胞质。心脏内注射组的图像显示腹腔转移灶。三幅图像均可见小细胞巢状排列及高核质比。图像由切片扫描仪拍摄，放大倍数为10倍。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="脑、腹部、肝脏转移瘤的组织学；显微镜检查、组织分析、肿瘤扩散。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：心内注射后观察到的转移灶。 心内注射（A）M2 和（B）CM04 细胞后，通过尸检发现可见转移灶，并对其进行 H&amp;E 染色。图像分别在（A）切片扫描仪上以 1x（左）或 20x（右）放大倍数拍摄，或（B）普通显微镜下以 10x 放大倍数拍摄。本图已根据我们先前的出版物12 进行修改。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

中枢神经系统转移瘤PDX模型能够代表人类转移瘤的表型和分子特征，是进行临床前研究的优秀模型。本文介绍了如何建立PDX模型以及适用于临床前研究的最佳接种途径。

中枢神经系统（CNS）转移瘤新疗法的开发一直受到缺乏能够准确模拟病情的临床前模型的限制……

中枢神经系统转移瘤新疗法的开发一直受到缺乏优良临床前模型的限制。与传统使用的细胞系模型相比，我们建立的患者来源异种移植模型能更好地模拟中枢神经系统转移过程。通过采用不同的肿瘤接种途径，可研究转移级联过程中不同阶段的特征。每种途径都有其优势，可为您的研究提供支持。本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Ben Yi Tew 演示。对于冷冻保存的PDX肿瘤进行皮下侧腹移植时，需将冷冻保存的肿瘤组织在37摄氏度水浴中快速解冻。然后，在组织培养皿中用5毫升DPBS冲洗。接着，在确认3至8周龄雌性NOG小鼠已麻醉后，于其左侧或右侧 flank 处做一道0.5至1厘米的切口，并将一块2×2×2毫米的肿瘤组织深置于皮下袋中。缝合切口后，持续监测小鼠，直至其从麻醉中恢复并能够自主活动。一旦肿瘤开始生长，每周使用游标卡尺测量肿瘤三次。在适当的实验终点，通过解剖识别转移灶，并通过组织学分析确认目标器官内存在肿瘤。将切除的PDX肿瘤置于冰上的DMEM中。在组织培养皿中用 5 毫升 DPBS 清洗肿瘤组织，并去除坏死区域（如有）。将肿瘤切成 2 至 4 毫米长的小块，转移至含有解离液的离心管中。使用组织解离仪的适当程序对组织进行机械解离，然后将所得的细胞悬液通过 70 微米细胞滤网过滤。用 20 毫升 DMEM 冲洗滤网中残留的细胞，并离心解离后的细胞悬液。然后将细胞重悬于 DPBS 中进行计数，并将细胞浓度调整为每 1 至 2 微升 DPBS 中含 5 × 10⁴ 至 10 × 10⁴ 个细胞。为准备手术区域，需剃除小鼠头部的毛发以暴露头皮。然后，将小鼠放入立体定位仪中，使用耳杆牢固固定小鼠头部。确保同时给予适当的镇痛剂。用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭头皮三次进行消毒。做一个5到7毫米的纵向切口，暴露颅骨并牵开头皮。用镊子刮除骨膜以定位前囟。将立体定位仪的针头置于前囟上方，并将坐标归零。将臂移动至中线右侧后方1毫米、外侧1毫米处，并用永久性记号笔标记该位置。随后，在标记位置的颅骨上钻一个小型骨孔，注意避免钻入脑组织。用1至2微升细胞悬液装填5微升26号Hamilton注射器，并将注射器连接至立体定位仪臂上。将针头缓慢插入脑内两毫米，并以所需速率开始注射细胞。待所有细胞注射完毕后，缓慢撤出针头，用骨蜡封闭颅骨钻孔，并缝合切口。将小鼠放回笼中，密切监测直至从麻醉中恢复。在适当的实验终点处死动物后，通过组织学分析确认脑内是否存在肿瘤。为通过心内注射移植PDX肿瘤，按所示方法制备肿瘤细胞，并将麻醉后的受体小鼠置于仰卧位。剃除动物胸部的毛发，并使用聚维酮碘和70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。用配备28号针头的注射器吸取0.5至10乘以10的5次方个肿瘤细胞以及最多100微升的DPBS。注射部位位于胸骨中线略偏左，处于胸骨上切迹与剑突之间的中点处。然后，将针头垂直插入小鼠的注射部位。一旦观察到回流，表明针头已成功进入左心室，此时在不移动针头的情况下，缓慢将肿瘤悬液注入左心室。当所有细胞注入完毕后，缓慢且垂直地拔出针头，并在注射部位覆盖一块无菌纱布，按压约一分钟，直至出血停止。将小鼠置于加热垫上，在密切监测下使其恢复，直至能够自主活动。在适当的实验终点，通过解剖识别转移灶，并通过组织学分析确认目标器官内存在肿瘤。尽管肿瘤微环境存在差异，PDX 肿瘤均表现出相似的形态学特征，即细胞具有小核和稀少的细胞质，且不受移植部位的影响。在本项分析中，人黑色素瘤细胞的心内注射导致肿瘤细胞转移至小鼠脑部，而脑转移性人小细胞肺癌细胞的心内注射则导致肿瘤转移至小鼠腹腔和肝脏。这些方案可用于建立临床前研究，以测试新的治疗方法及治疗组合，并有助于研究生物学过程和肿瘤转移。

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中枢神经系统转移患者来源异种移植模型的建立与应用

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