中枢神经系统转移患者来源异种移植模型的建立与应用

中枢神经系统转移瘤新疗法的开发一直受到缺乏优良临床前模型的限制。与传统使用的细胞系模型相比，我们建立的患者来源异种移植模型能更好地模拟中枢神经系统转移过程。通过采用不同的肿瘤接种途径，可研究转移级联过程中不同阶段的特征。

每种途径都有其优势，可为您的研究提供支持。本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Ben Yi Tew 演示。对于冷冻保存的PDX肿瘤进行皮下侧腹移植时，需将冷冻保存的肿瘤组织在37摄氏度水浴中快速解冻。

然后，在组织培养皿中用5毫升DPBS冲洗。接着，在确认3至8周龄雌性NOG小鼠已麻醉后，于其左侧或右侧 flank 处做一道0.5至1厘米的切口，并将一块2×2×2毫米的肿瘤组织深置于皮下袋中。缝合切口后，持续监测小鼠，直至其从麻醉中恢复并能够自主活动。

一旦肿瘤开始生长，每周使用游标卡尺测量肿瘤三次。在适当的实验终点，通过解剖识别转移灶，并通过组织学分析确认目标器官内存在肿瘤。将切除的PDX肿瘤置于冰上的DMEM中。

在组织培养皿中用 5 毫升 DPBS 清洗肿瘤组织，并去除坏死区域（如有）。将肿瘤切成 2 至 4 毫米长的小块，转移至含有解离液的离心管中。使用组织解离仪的适当程序对组织进行机械解离，然后将所得的细胞悬液通过 70 微米细胞滤网过滤。

用 20 毫升 DMEM 冲洗滤网中残留的细胞，并离心解离后的细胞悬液。然后将细胞重悬于 DPBS 中进行计数，并将细胞浓度调整为每 1 至 2 微升 DPBS 中含 5 × 10⁴ 至 10 × 10⁴ 个细胞。为准备手术区域，需剃除小鼠头部的毛发以暴露头皮。

然后，将小鼠放入立体定位仪中，使用耳杆牢固固定小鼠头部。确保同时给予适当的镇痛剂。用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭头皮三次进行消毒。

做一个5到7毫米的纵向切口，暴露颅骨并牵开头皮。用镊子刮除骨膜以定位前囟。将立体定位仪的针头置于前囟上方，并将坐标归零。

将臂移动至中线右侧后方1毫米、外侧1毫米处，并用永久性记号笔标记该位置。随后，在标记位置的颅骨上钻一个小型骨孔，注意避免钻入脑组织。用1至2微升细胞悬液装填5微升26号Hamilton注射器，并将注射器连接至立体定位仪臂上。

将针头缓慢插入脑内两毫米，并以所需速率开始注射细胞。待所有细胞注射完毕后，缓慢撤出针头，用骨蜡封闭颅骨钻孔，并缝合切口。将小鼠放回笼中，密切监测直至从麻醉中恢复。

在适当的实验终点处死动物后，通过组织学分析确认脑内是否存在肿瘤。为通过心内注射移植PDX肿瘤，按所示方法制备肿瘤细胞，并将麻醉后的受体小鼠置于仰卧位。剃除动物胸部的毛发，并使用聚维酮碘和70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒。

用配备28号针头的注射器吸取0.5至10乘以10的5次方个肿瘤细胞以及最多100微升的DPBS。注射部位位于胸骨中线略偏左，处于胸骨上切迹与剑突之间的中点处。然后，将针头垂直插入小鼠的注射部位。

一旦观察到回流，表明针头已成功进入左心室，此时在不移动针头的情况下，缓慢将肿瘤悬液注入左心室。当所有细胞注入完毕后，缓慢且垂直地拔出针头，并在注射部位覆盖一块无菌纱布，按压约一分钟，直至出血停止。将小鼠置于加热垫上，在密切监测下使其恢复，直至能够自主活动。

在适当的实验终点，通过解剖识别转移灶，并通过组织学分析确认目标器官内存在肿瘤。尽管肿瘤微环境存在差异，PDX 肿瘤均表现出相似的形态学特征，即细胞具有小核和稀少的细胞质，且不受移植部位的影响。在本项分析中，人黑色素瘤细胞的心内注射导致肿瘤细胞转移至小鼠脑部，而脑转移性人小细胞肺癌细胞的心内注射则导致肿瘤转移至小鼠腹腔和肝脏。

这些方案可用于建立临床前研究，以测试新的治疗方法及治疗组合，并有助于研究生物学过程和肿瘤转移。