行为小鼠希波坎帕的神经元活动可视化的颅骨切除术
2021年7月24日
本文演示了定制成像窗口的制备，并辅以输液管，并将其植入小鼠海马的CA1区域。
嘿，伙计们，我叫王阳东，我来自西湖大学的基里尔·皮亚特克维奇分子生物工程实验室。今天，我要告诉你在小鼠体内成像海马体神经元活动的程序。打开焊接机，加热到所需的温度。
使用帮助手调整成像管和注射管的位置，如图所示。使用注射器与针头，将少量适当的通量涂在成像和注射管之间的连接点上五秒钟，然后去除液滴。安装焊接锡，并将其应用到随通量处理的连接点。
避免过量焊接锡，因为它将需要不必要的更大的颅骨，使手术期间。等待焊接锡冷却。通常，它需要几秒钟。
确认注射管不会通过从两个方向插入假管来阻止。使用牙签或 26 口径注射器针在成像管底部应用紫外线固化光学胶粘剂。使用细钳小心放置与成像管相当大小的盖玻璃。
通过标准手持式紫外线灯的紫外线照明，将胶粘剂固化至少一小时。根据 IACUC 批准的程序，用异氟素麻醉鼠标。将鼠标置于手术加热垫上的立体氧化框架中。
用耳栏固定头部。稍微将头部向四面八方推，以确保头部牢固固定。应用眼药膏，以防止动物的眼睛在手术过程中干涸。
使用修剪器或脱脂霜将毛皮从颈部后部移到眼睛。在切口之前，用β丁对手术部位进行消毒，然后三次使用70%乙醇消毒。取出头骨顶部的皮肤，从头部底部周围的水平切口开始，然后朝骨皮方向切开两处，几乎到达眼睑。
然后两个斜切，在中线收敛。用两个无菌棉签，收回连接组织，以及颈部后部到头骨边缘的肌肉。将一滴利多卡因溶液涂抹在围产层表面两分钟，以避免过度疼痛。
用手术刀轻轻刮伤头骨的整个暴露区域，形成干燥粗糙的表面。将针尖放在兰姆达上，看看 AP 坐标是否为零，以确认头部位置是垂直的，以及 ML 坐标是否为零，以确认头部水平定位。如果没有，调整立体塔的传动旋钮，直到AP和ML坐标都在0.1毫米以内。
移动针尖，找到颅骨切除术的相应点，并用精细的标记标记它们在头骨上的位置。根据四个标记点绘制一个圆，以及圆的管面注射管区域的轮廓。以每分钟 10，000 发子弹的速度使用气动钻头，沿着头骨上标记的轮廓轻轻钻取。
钻头骨，直到留下一层非常薄的骨头，通常开始在中心温柔的触摸下摆动。将一滴无菌 PBS 涂抹到颅骨切除术中心。用非常薄的倾斜钳子或两根26口径的针头从对面接近头骨，将骨瓣抬起来。
应用PBS后，通过26米钝针几次清洁杜拉表面。应用温和的吸力来消融皮层以及海马上方的科珀斯卡洛苏姆。皮层通常比科珀斯卡洛苏姆更黄。
科珀斯卡洛苏姆通常比海马宽。此外，当从顶部观察到科珀斯卡洛苏姆时，神经元纤维在垂直和水平方向上很容易区分。此时出血会影响颅骨切除术中脑组织的可见性。
应用 PBS，然后轻轻吸气，而你渴望皮层去除血液，科珀斯卡洛苏姆可以识别的白色纤维的方向，如示意图显示在图表中。通过在圆形运动中轻轻吸吸，将科珀斯卡洛苏姆纤维逐层去除。PBS 不断被应用，以摆脱在暴露的脑组织上方积累的血液。
轻轻地将植入物插入颅骨切除术。用 L 形针牢牢地按压植入物顶部，以尽可能靠近海马体的外露表面，使植入物的光学窗口位置尽可能接近。反复在植入物周围的疤痕上涂抹 PBS，然后在植入过程中尽可能吸去血液。
在植入物和头骨之间涂抹一层薄薄的快速密封，以防止牙齿水泥穿透头骨下。一旦快速密封固化，在头骨表面、快速密封表面和植入物表面均匀地应用超级键。一旦超级键被治愈，应用假牙基础树脂以上超级键，以及皮肤周围的切口在手术开始。
假牙碱脂固化后，将头板放在植入物周围的树脂上，使其与成像管一起集中。在头板周围和上方涂抹更多的假牙基树脂，以固定其位置。让它治愈几分钟。
避免在管子周围积筑一层厚厚的水泥，以确保更好地进入成像窗口是客观的镜头。稀释假牙基树脂以降低其粘度，从而使其能够填充与施用器难以触及的腔。轻轻地将绝缘橡胶胶带放在窗户上方，以保护窗户免受动物绑带可能造成的污染。
在病毒溶液中加入快速绿色染料库存溶液，在 PCR 管中以 1 比 9 的比例稀释到所需的滴定器。提取 600 纳米升的病毒溶液，取出假管，并将内部管连接到注射注射器中，放入导管中。以每分钟 15 纳米升的速度注入病毒，总共 10 分钟。
保持内部管连接10分钟，使病毒在窗口下传播。轻轻地从导管中取出内部管子，用假管重新回顾它。用4%异氟兰诱导鼠标几分钟。
将其头板固定在头部叉上，然后将头叉固定在跑步机上。使用低放大目标透镜来查找功能成像的最佳滤视图。然后，切换到更高的客观镜头，以单细胞分辨率记录神经元活动。
对于钙成像，绿色荧光灯是兴奋的市售470纳米LED使用标准的GFP过滤感。为了获得荧光痕迹，通过 ImageJ 软件手动分割和分析与神经元细胞质量相对应的兴趣区域。在近红外信道上使用 40 X 镜头光学电压记录进行电压成像，获取率为 830 赫兹。
自发神经活动记录持续长达25，000帧。在这里，我们描述了一种将海马体长期成像为行为小鼠A1区域的方法。该方法基于慢性植入。
现在定制的成像窗口，这也使病毒或药物的靶向管理直接对感兴趣的神经元。我们相信，上述协议将促进旨在利用简单且经济实惠的1光子成像设置，调查行为小鼠海马中空间时间分辨率高的神经元活动的研究。
概述
本文演示了在小鼠海马CA1区域准备和植入定制成像窗口与输液导管的方法，用于体内成像神经元活动。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经工程学
- 体内成像
背景
- 海马的CA1区域在记忆和学习中起着至关重要的作用。
- 该区域的神经元活动对于研究各种神经系统疾病至关重要。
- 现有方法可能无法精确成像和操作神经元电路。
- 定制成像系统可以促进对海马功能的实时研究。
研究目的
- 演示在小鼠大脑中创建成像设置的详细手术程序。
- 改进现有的神经元活动体内成像方法。
- 使研究人员能够更有效地探索海马中的神经元动力学。
使用的方法
- 该研究利用定制成像窗口设计和小鼠手术植入。
- 使用小鼠模型研究海马中的神经元活动。
- 植入程序包括麻醉管理、开颅术和小心翼翼地放置导管和窗口。
- 追踪细致的手术步骤以确保精确性并防止并发症。
- 关键方法包括使用紫外光固化粘合剂和多种手术工具以实现精确定位。
主要结果
- 本文概述了一种成功的成像设置谨慎植入方法。
- 关键步骤详细说明如何避免并发症并确保导管的最佳放置。
- 该过程展示了在植入过程中维持大脑活力的重要机械洞察。
- 研究结果突出了改进海马神经元动力学体内研究的潜力。
结论
- 本研究展示了一种可重复的方法来成像小鼠神经元活动。
- 该程序增强了对海马功能的理解，对神经系统研究可能有影响。
- 从这种方法获得的见解可以为学习和记忆机制的研究做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Chronic in vivo imaging of hippocampal neuronal activity in behaving mice addresses a critical gap in deep-brain circuit interrogation for CNS drug discovery. This method enables high-resolution, longitudinal monitoring of neuronal dynamics, supporting mechanistic de-risking and target validation in translational neuroscience pipelines. The integrated infusion cannula further allows for precise delivery of viral vectors or compounds, enhancing experimental flexibility and predictive confidence in early-stage neuropharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of neuronal circuit function in disease-relevant hippocampal regions.
- Supports mechanistic de-risking by linking molecular interventions to functional neural outcomes.
- Facilitates functional target validation through chronic, single-cell resolution imaging in behaving animals.
- Improves predictive confidence for CNS target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Provides a validated platform for quantitative, reproducible measurement of neuronal activity in vivo.
- Supports assay standardization for compound or genetic intervention studies in deep-brain regions.
- Enables scalable, longitudinal screening of neural responses to candidate therapeutics or gene delivery.
- Allows for reliable evaluation of intervention effects at both population and single-cell levels.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with human disease-relevant hippocampal circuitry for translational biomarker development.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting repeated, longitudinal measurements.
- Reduces translational risk by providing high-content, functional readouts in behaving animals.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on robust neural activity data.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, lead identification, and preclinical validation by enabling chronic, high-resolution imaging and targeted intervention in the hippocampus of behaving mice.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct neural activity measurement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for compound or genetic screening in deep-brain circuits.
- Analytics: Provides high-content calcium and voltage imaging data for comparative analysis across interventions.
- Translational Research: Aligns animal models with human CNS disease mechanisms for biomarker and efficacy studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse CNS research and intervention testing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes chronic imaging and intervention workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management in neuropharma pipelines.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS programs based on robust functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stereotaxic surgery and chronic cranial window implantation.
- Demands access to wide-field fluorescence microscopy and high-speed imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of surgical, imaging, and analytical protocols.
- Adaptation may be needed for different brain regions or animal models.
- Potential limitations include surgical complexity, risk of tissue damage, and long-term window maintenance.
