利用经颅功能超声成像在小鼠中进行全脑三维激活与功能连接图谱绘制

功能超声是一种新型神经成像技术，可实现对活体啮齿类动物大脑脑血容量的图谱绘制。通过超快平面波成像，我们能够以前所未有的空间-时间分辨率和灵敏度测量全脑血流动力学响应。本方案详细说明了如何在小鼠中开展经颅功能超声成像，适用于麻醉状态和清醒状态动物的实验。

与其他全脑功能成像技术（如功能性磁共振成像，fMRI）相比，功能超声成像具有高便携性、操作简便，并支持在清醒且自由活动的受试者中开展实验，从而避免了麻醉带来的偏差，实现了行为学研究。过去，功能超声（FUS）成像仅能在与超声专家合作的情况下使用。如今，得益于 commercially available 扫描仪及专用于临床前脑成像的配套软件，该技术已广泛应用于神经科学领域，即使不具备超声背景的研究人员也能轻松使用 FUS。

进行麻醉状态下的成像实验时，需在小鼠眼睛上涂抹眼膏以防止角膜损伤，并使用剃须刀剃除小鼠头部毛发。涂抹脱毛膏，数分钟后用水冲洗。重复此步骤直至毛发完全去除。

将皮下针插入四肢以记录心电图，并在头部放置离心后的超声耦合剂。对于清醒小鼠实验，需要进行初步手术以固定头部。将麻醉后的小鼠和立体定位仪置于37摄氏度的加热垫上。

在眼部涂抹保护性凝胶，并使用26号针头在头皮下注射利多卡因，然后等待数分钟。沿矢状缝从枕骨后方至鼻骨前端做一切口，随后使用手术剪剪除覆盖两侧大脑半球的皮肤。用1%碘溶液清洁颅骨，并去除残留的骨膜。

以头板为模板，在颅骨上标记两个孔位用于定位固定螺钉。将头板与螺钉定位后，使用牙科水泥在框架的前部和后部固定螺钉及头板，以确保植入物具有良好的抓附力。待水泥干燥后，将动物从立体定位仪框架中取出，并通过皮下注射每公斤体重1毫克的阿替美唑来逆转麻醉状态。

术后给予美洛昔康以预防疼痛。在头固定板上放置一个磁性3D打印保护帽，并让小鼠恢复4至6天，然后开始对移动式家庭笼进行适应。将动物置于带有加热垫的恢复笼中数小时，随后将其与同笼伙伴一起放回家庭笼中。

在恢复后的第四天和第五天，反复将小鼠固定于移动式家庭笼中，并逐渐增加头部固定时间，从5分钟逐步延长至30分钟。在成像窗口处滴加少量生理盐水和超声耦合剂，以使小鼠适应该操作。在恢复后的第六天重复此过程。

启动软件并创建实验会话。进入移动探头菜单，使用导航键盘调整超声探头的位置。开始实时成像采集，并根据动物脑血容量（CBV）的实时图像，必要时调整探头位置。

将脑组织置于图像中心，然后优化成像参数以获得最高的信噪比。打开采集软件中的 Angio 3D 选项。在预设面板中，调整第一层、最后一层和步进尺寸的扫描参数，以实现对全脑的扫描，并启动数据采集。

保持采集软件处于打开状态，启动数据分析与可视化软件，然后加载Angio 3D扫描数据。通过三视图面板浏览采集体积，选择冠状面扫描方向，即前-后方向或后-前方向。进入脑部配准面板，加载小鼠参考模板以进行配准处理。

使用全自动或手动配准模式，将扫描图像在艾伦小鼠通用坐标框架（Allen Mouse Common Coordinates Framework）中进行配准。通过观察血管造影3D扫描图像与参考模板的叠加效果，或通过图谱管理面板查看扫描图像与艾伦参考图谱的叠加情况，来检查配准结果。将配准结果保存为BPS文件。

在 ICO 工作室软件中，确保血管造影扫描及其 BPS 文件已加载。进入脑导航面板。在图谱管理器面板中，使用父子树导航器浏览小鼠 Allen 脑图谱。

找到解剖学目标区域，并在三个视图中选择它们以叠加到扫描图像上。在三视图面板中观察目标区域，并通过在包含感兴趣区域的冠状面位置手动设置两个标记，选择与目标区域重合的成像平面用于实验。点击脑部定位系统（Brain Positioning System，简称 BPS），以提取对应的电机坐标，这些坐标即为探针成像目标平面时的位置。

查看由血管扫描计算生成的图像预览。在ICO扫描软件中，进入探头定位面板，点击输入BPS坐标，然后应用提取的坐标，使探头移动并调整至目标成像平面。执行实时成像采集，并确认当前成像平面与预测结果一致。

预先定义刺激序列，包括刺激时间、感兴趣刺激时间以及重复次数。通过定义总采集时间、采集位置数量以及各位置间的死区时间，运行三维聚焦超声（FUS）序列。若需通过TTL输入将自动刺激与采集系统同步，请在开始采集前选择“trig in”选项。

在ICO studio软件中打开采集数据，进入激活图菜单，然后在激活模式字段中填写起始和结束时间，并计算激活图。调整显示参数以进行可视化，将激活图导出为H5文件用于离线分析。通过定义总采集时间、成像平面位置数量以及各位置间的死区时间，运行3D FUS序列。

保存采集数据并将其加载到 ICO studio 软件中。如有需要，加载 BPS 文件和 Allen 小鼠脑图谱框架。在图谱管理器中，选择图谱中的区域作为感兴趣区域。

进入功能传导性菜单，选择目标区域和感兴趣区域（ROI）管理器。将结果以连接矩阵或基于种子点的相关图形式可视化，然后根据需要选择并调整带宽滤波器，并导出相关性结果用于统计分析。该方案已用于小鼠脑部经颅脑血流动力学变化的三维定量分析。

选择胡须刺激作为感觉刺激诱发反应的示例。采用默认的小鼠血流动力学响应函数，通过一般线性模型（GLM）以特定分辨率确定显著激活。总试验时间为760秒，包括60秒基线期、80秒刺激期和60秒恢复期，重复五次。

通过分析对侧初级体感皮层的桶状区（S1BF）的体素时间进程，发现与基线相比，脑血容量（CBV）增加了15%至20%。相同的实验范式应用于固定头部并在可移动家居笼中行为清醒的小鼠，使用ICO扫描的清醒预设模式。此处展示了多根胡须刺激实验后的激活图谱。

通过使用默认的小鼠血流动力学响应函数进行广义线性模型（GLM）分析，确定了显著的激活区域。此处展示了在氯胺酮-赛拉嗪麻醉小鼠中，三维脑区之间经标准化处理的低频自发性脑血容量（CBV）波动的时间相关性。基于种子点的分析以背侧海马为感兴趣区，揭示了左右海马之间显著的半球间传导性，以及更深层的海马后区和梨状皮层区域的连接。

在S1BF中选择的种子区域也产生了对称的相关模式。成功实验的关键在于动物准备，特别是涉及麻醉动物实验时的麻醉水平，以及清醒动物实验中对颅骨的保护。如果超声能够使我们研究清醒动物的重要脑功能，探讨关于睡眠、学习或行为的基本问题，同时也可用于药物发现中功能连接的药理学调节。