用于评估啮齿动物和人类脑组织中行为素聚合状态的基于时间的荧光光谱分析

Actin 是细胞骨骼的主要成分，对细胞形态和生理学的几个方面（包括神经元）进行了批判性调节。Actin 发生在其两种形式之间的平衡中，单体球状 G-actin 或聚合细丝 F-actin。作用素的聚合状态通过作用结合蛋白以及自身的转化后调节在多个层面受到严格监管。

在内在突触中，F-actin 水平的动态变化是一个关键的调节事件，可控制突触前和后终端的信号和可塑性。毫不奇怪，行为功能障碍与几个神经病理状态有关。最近的进步已经导致在神经元生理学和病理生理学方面拥有丰富的行为素知识。

然而，许多仍不得而知，需要关注。在这方面，法洛丁的荧光类比已被证明是在行为研究的主要工具。这种咽毒素特别与丝状活性结合，因此可以直接测量F-actin的数量及其在病理生理状态下的变化。

这项研究提出了一个快速和高效的氟测定测试，用于评估前活体生物样本中的活性聚合状态，如从脑组织批发同质化和生化分离的突触终端。值得注意的是，该检测可以应用于其他细胞和组织类型及其相关的生理现象。有关本研究中使用的缓冲器的配方，请参阅详细文本。

来自大鼠或人类受试者的脑组织样本在波特-埃尔韦杰姆玻璃管中均质化，并在10卷同质化缓冲器中在冰上缠缠。对于突触体准备，同质性首先以慢速旋转，然后以更高的速度旋转，以获得粗突触体线粒体分数。从这个粗分数中获得丰富的突触体是在不连续的蔗糖梯度后获得的。

对于突触生成制备，同质物通过两个100微米和一个5微米过滤器连续传递。使用布拉德福德试剂进行蛋白质估计，在 Krebs 缓冲区稀释样品，最终体积为 50 微升，每毫升蛋白质浓度为 2 到 3 毫克。通过在37度时将细胞外钾短暂增加30秒，对分离的突触终端（突触体或突触体）进行刺激。

为此，在样品中加入一个氯化摩尔钾，最终浓度为15毫升。同源物是未刺激的，去极化突触片段固定在2.5%的谷胱甘肽，通过添加所需的体积25%谷氨酸含量溶液。样品在室温下孵育了两三分钟。

固定性通过离心在20，000G中取出5分钟。然后，这些样品在克雷布斯缓冲区通过悬念进行渗透，该缓冲器含有0.1%的Triton X-100和1毫克每mL氢化钠，在室温下两到三分钟。通过离心再次去除渗透缓冲，颗粒表面上用克雷布斯缓冲器清洗，并重新用含有 1X Alexa Fluor 647 phalloidin 的 Krebs 缓冲器，相当于 500 微单位的法洛丁。

在黑暗的室温下，绑定允许进行10分钟。多余的未绑定法洛丁通过离心在2万G中取出5分钟，颗粒表面上用克雷布斯缓冲器清洗，并再次在含有0.32摩尔蔗糖的克雷布斯缓冲器中再补充，以保持突触体或突触体的浮力。荧光法洛丁绑定样品被分配在一个96井黑色板的荧光读数在板阅读器。

兴奋和发射波长分别设定为645纳米和670纳米。对于每组实验，我们包括不同数量的亚历克萨氟647巴洛丁在克雷布斯缓冲区含有0.32摩尔蔗糖。为了说明洗涤过程中样品的任何损失，样品从黑色转移到透明的 96 井板。

然后在440纳米时对采集样本进行检查。荧光球蛋白的保留与样品中行为素细丝或F-actin水平的含量成正比。在50至200微克蛋白质范围内观察到帕勒多林结合的线性。

作为原则的证明，我们还测试了我们的检测效果在模型的F-actin去聚利用药理破坏作用素细丝由拉特伦库林A，以及刺激F-actin形成由KCl调解刺激孤立的突触终端。绑定法洛丁的荧光发射可以表示为标准线性曲线产生的绑定法洛丁的两个单位，并且相对于控制样本。对于图 4，F-actin 水平表示为绑定法乐蛋白的微单位。

另一方面，对于图5的F-actin水平在去极化突触片段表示相对于控制未极化样本。我们描述了一个坚固、省时和高吞吐量的检测方法，用于分析行为细丝（F-actin）及其生理和病理生理状态的改变，适用于 96 井板格式。检测比现有的替代协议快得多，可以单独或结合现有的免疫造血术和基于西方印迹的检测，作为与行为相关的研究中的重要工具。