Name: 从绵羊的成人和前卵巢收集的体外成熟卵母细胞的振动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 了解绵羊卵母细胞玻璃化冷冻的标准化方案，涵盖体外成熟、冷冻保存及复苏培养全过程。该方法适用于成年和幼年供体，有助于优化生殖生物技术中的遗传资源保存策略。

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作者未获得本研究的专项资助。谨此感谢Maria Grazia Cappai教授和Valeria Pasciu博士为视频配音以及在视频制作期间协助实验室的搭建工作。

以下所述的动物实验方案及实施步骤均符合萨萨里大学现行的伦理准则，并遵守欧盟指令86/609/EC以及欧洲共同体委员会2007/526/EC建议书的规定。
1. 卵母细胞操作培养基的制备
<ol>
	<li>通过在 Dulbecco's 磷酸盐缓冲盐水（PBS）中添加 0.1 g/L 青霉素和 0.1 g/L 链霉素，制备用于运输采集卵巢的保存液。</li>
	<li>通过将 9.5 g 组织培养基（TCM）199 粉末溶解于 1 L 经 Milli-Q 水配制并添加 0.1% 青霉素和 0.1% 链霉素的溶液中，制备卵母细胞采集与成熟培养基。
	<ol>
		<li>稀释后，过滤 100 mL 培养基，并于 4 °C 保存，作为储备成熟培养基（SMM），可使用一周。</li>
		<li>通过向剩余的 900 mL 培养基中添加 25 mM HEPES、0.36 g/L 碳酸氢盐和 0.1%（w/v）聚乙烯醇（PVA），制备采集培养基（CM）（pH 7.3，渗透压 290 mOsm/kg）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用 SMM 并补充 0.021 g/L 碳酸氢盐、10% 热灭活发情期绵羊血清、1 IU/mL FSH、1 IU/mL LH、100 µL 半胱胺和 8 mg/mL 丙酮酸，制备成熟培养基。 
	注意：成熟培养基需在使用前于标准条件下（39 °C、5% CO2、空气环境中最大湿度）孵育至少 4 小时，体积为 10 mL。</li>
	<li>制备用于体外成熟后卵母细胞操作的基础培养基（BM），成分为不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS，并补充 20% 胎牛血清（FCS）。</li>
</ol>
2. 卵母细胞的采集与成熟
<ol>
	<li>从幼年（30-40日龄，体重6-10 kg）和成年卵巢中回收卵母细胞。</li>
	<li>将从商业屠宰场收集的卵巢置于27 °C的PBS中，在1-2小时内运送至实验室。</li>
	<li>在PBS新鲜培养基中清洗后，使用微型刀片在CM中切开卵巢，释放卵泡内容物。</li>
	<li>在体视显微镜下以60倍放大倍数进行观察，选择具有4-10层颗粒细胞、细胞质均匀、胞质内脂滴分布均一且外径约为90 µm（平均值）的卵丘-卵母细胞复合体（COCs），用于体外成熟。</li>
	<li>将选出的COCs在CM中清洗三次，最后转移至成熟培养基中。 
	注意：对于幼年动物的卵母细胞，为提高玻璃化冷冻后的存活率，可在成熟培养基中添加100 µM海藻糖。</li>
	<li>进行体外成熟时，将30-35个COCs转移至四孔培养皿中的600 µL成熟培养基中，覆盖300 µL矿物油，并在39 °C、5% CO2的空气环境中孵育22小时（成年卵母细胞）或24小时（幼年卵母细胞）。</li>
	<li>体外成熟后，通过轻柔吹打去除COCs的卵丘细胞。在体视显微镜下以60倍放大倍数观察后，仅选择显示第一极体排出、处于第二次减数分裂中期（MII期）的卵母细胞进行玻璃化冷冻。</li>
</ol>
3. 精液采集、冷冻与解冻操作步骤
<ol>
	<li>制备用于精液冷冻保存的基础培养基，其成分为公羊稀释液（200 mM Tris；70 mM 柠檬酸；55 mM 果糖；pH 7.2，渗透压 300 mOsm/kg），并添加 20%（v/v）的蛋黄。</li>
	<li>仅在绵羊繁殖季节（10月至11月）采集精液。</li>
	<li>通过人工阴道法采集成年公羊（年龄 2–5 岁）的射精样本，公羊饲养于户外环境，并饲喂维持体重所需的日粮。将公羊隔离饲养于单独的圈舍中，但保持彼此间的视觉接触。</li>
	<li>在整个繁殖季节内，每周采集一次精液，以从每只公羊获得至少 8 次射精样本。</li>
	<li>采集后 5 分钟内将精液样品于环境温度下运送至实验室，并立即进行处理。将 2–3 只公羊的射精样本混合，并通过分光光度法评估精子浓度。</li>
	<li>混合后，用添加了 4% 甘油的基础冷冻保存培养基将射精样本稀释至 400 × 106 个精子/mL。随后将稀释后的精液在 2 小时内冷却至 4 °C，并在冷冻前平衡 20 分钟。</li>
	<li>将精液样品以颗粒形式（0.25 mL）在干冰上冷冻，然后投入液氮中保存。</li>
	<li>解冻时，将冻存颗粒放入灭菌的玻璃离心管中，置于 39 °C 水浴中 20 秒。</li>
</ol>
4. 体外受精与胚胎培养
<ol>
	<li>准备合成输卵管液（SOF）的储备液。
	<ol>
		<li>制备储备液A：99.4 mL 去离子水；6.29 g NaCl；0.534 g KCl；0.161 g KH2PO4；0.182 g MgSO4·7H2O；以及 0.6 mL 乳酸钠。4 °C 保存，最长可保存3个月。</li>
		<li>制备储备液B：10 mL 去离子水；0.210 g NaHCO3；以及 2–3 g 酚红。4 °C 保存1个月。</li>
		<li>制备储备液C：10 mL 去离子水；以及 0.051 g 丙酮酸钠。4 °C 保存1个月。</li>
		<li>制备储备液D：10 mL 去离子水；以及 0.262 g CaCl2·2H2O。4 °C 保存1个月。</li>
		<li>制备10 mL SOF：包含7.630 mL 去离子水、1 mL 储备液A、1 mL 储备液B、0.07 mL 储备液C 和 0.7 mL 储备液D。</li>
		<li>制备体外受精（IVF）培养基：在SOF中添加2%热灭活发情期绵羊血清、10 µg/mL 肝素和1 µg/mL 低聚鸟氨酸（渗透压为280–290 mOsm/kg）。 
		注意：IVF培养基需在使用前至少孵育4小时，孵育条件为标准条件（39 °C、5% CO2、5% O2 和90% N2 的最大湿度环境）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将冻融后的精液样品转移至无菌玻璃锥形管中，置于1.5 mL预热的IVF培养基下方，并在39 °C、5% CO2 的湿润空气中孵育15分钟。</li>
	<li>孵育后，活动精子会游向液体柱的上层。收集上层液体并进行精子活力评估。 
	注意：应使用计算机辅助精子分析（CASA）系统评估精子活力参数，设置如下：采集25帧以避免精子轨迹重叠，最小对比度为10，平均路径速度最小为30 µm/s，前向运动精子的直线性&#62; 80%。该系统具有专用于公羊精子评估的特定设置。每个样品取5 µL精子悬液，加入预热的分析室（深度为10 µm），在37 °C、40倍相差显微镜下进行分析，每个样品至少分析四个不同视野，总计不少于500个精子。评估总活动精子百分比和前向运动精子百分比。用于体外受精的精子样品中，前向运动精子百分比应≥ 30%。</li>
	<li>将经上浮法获得的活动精子稀释至终浓度为1 × 106 个精子/mL，并与MII期卵母细胞共同孵育于四孔培养皿中，每孔含300 µL IVF培养基，并覆盖矿物油。</li>
	<li>受精22小时后，将假定的受精卵转移至含有SOF培养基的四孔培养皿中，培养基中添加0.4%牛血清白蛋白以及按文献16报道的输卵管浓度的必需和非必需氨基酸，表面覆盖矿物油，并在标准条件下培养至囊胚阶段。</li>
	<li>在受精后22小时、26小时和32小时，使用60倍体视显微镜观察并记录卵裂卵母细胞数量（表现为两个明显分裂球）。</li>
	<li>从培养第5天至第9天每天观察胚胎发育情况，并使用60倍体视显微镜记录新形成的囊胚。</li>
</ol>
5. 卵母细胞玻璃化冷冻与复温
注意：采用最小必需体积（MEV）法，使用Cryotop装置进行玻璃化冷冻17.
<ol>
	<li>将一组五个卵母细胞在 BM 中于 38.5 °C 平衡 2 分钟。使用 BM 可确保较低的钙离子浓度（[Ca2+] 2.2 mg/dL）10。</li>
	<li>将卵母细胞置于含 7.5% (v/v) 二甲基亚砜 (DMSO) 和 7.5% (v/v) 乙二醇 (EG) 的平衡液中，暴露 3 分钟，以进行脱水处理。</li>
	<li>将卵母细胞转移至玻璃化冷冻液中，该溶液含有 16.5% (v/v) DMSO、16.5% (v/v) EG 和 0.5 M 海藻糖，溶于 BM 中；随后在 30 秒内将其加载至冷冻载体（cryotop）装置中，并立即浸入液氮中。</li>
	<li>为恢复至生理温度，将每个玻璃化冷冻装置的内容物从液氮中转移至 200 µL 含 1.25 M 海藻糖的 BM 液滴中，于 38.5 °C 孵育 1 分钟，并轻轻搅拌以促进混合。</li>
	<li>为促进去除卵母细胞内的冷冻保护剂，将卵母细胞逐步转移至含递减浓度海藻糖的 200 µL 液滴中（BM 中分别含 0.5 M、0.25 M、0.125 M 海藻糖），每次在 38.5 °C 下孵育 30 秒，最后在 BM 中于 38.5 °C 平衡 10 分钟。</li>
</ol>
6. 卵母细胞复温后质量评估
<ol>
	<li>复温后，将卵母细胞在不含 Ca++ 和 Mg++ 的 PBS 中，加入 20% 胎牛血清（FCS）（BM），于 38.5 °C、5% CO2 的空气环境中孵育 6 小时。 
	注意：卵母细胞在玻璃化冷冻后恢复其生物学和结构特征的能力与物种及所用卵母细胞的类型有关。</li>
	<li>由于卵母细胞修复冷冻损伤的能力具有时间依赖性，因此应在复温后体外培养的不同时间点（0 小时、2 小时、4 小时、6 小时）评估卵母细胞质量，以确定卵母细胞受精的最佳时间窗口。 
	&#8203;注意：在成年绵羊卵母细胞中，最佳时间为复温后 4 小时；在未成年（青春期前）绵羊卵母细胞中，最佳时间为复温后 2 小时。</li>
</ol>
7. 卵母细胞存活率评估
<ol>
	<li>复苏后立即进行操作，并在复苏后培养的每个时间点，使用倒置显微镜在100倍放大倍数下对卵母细胞进行形态学评估。 
	注意：若卵母细胞出现细胞质模糊、透明带和/或细胞膜损伤等结构改变，应将其归类为退化卵母细胞。</li>
	<li>采用双荧光染色法验证细胞膜完整性。</li>
	<li>将卵母细胞在含有碘化丙啶（PI；10 µg/mL）和Hoechst 33342（10 µg/mL）的2 mL BM培养基中孵育5分钟，气体环境为5% CO2，温度为38.5 °C。</li>
	<li>用新鲜BM培养基洗涤三次后，在荧光显微镜下观察卵母细胞，Hoechst 33342使用350 nm激发滤光片和460 nm发射滤光片，PI使用535 nm激发滤光片和617 nm发射滤光片。 
	&#8203;注意：细胞膜完整的卵母细胞可显示出Hoechst 33342染色DNA产生的蓝色荧光；细胞膜受损的卵母细胞则因PI对DNA的染色而呈现红色荧光。</li>
</ol>
8. 通过共聚焦激光扫描显微镜评估线粒体活性和细胞内活性氧水平
<ol>
	<li>准备MitoTracker Red CM-H2XRos（MT-Red）探针。
	<ol>
		<li>将1个小瓶（50 µg）内容物用1 mL DMSO溶解，配制成1 mM溶液。将稀释后的溶液保存于液氮中。</li>
		<li>用DMSO将1 mM溶液进一步稀释，获得100 µM的储存液，并于-80 °C避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（H2DCF-DA）探针。
	<ol>
		<li>将H2DCF-DA溶于0.1%聚乙烯吡咯烷酮（PVA）/PBS中，配制成初始100 mM溶液。将该溶液于-80 °C避光保存。</li>
		<li>用0.1% PVA/PBS将初始溶液稀释，获得100 µM的储存液，于-20 °C避光保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制封片介质（MM）：每10 mL MM中加入5 mL甘油、5 mL PBS和250 mg叠氮化钠。使用前于-20 °C保存。</li>
	<li>将卵母细胞在含有500 nM MT-Red（储存液：100 µM溶于DMSO）的BM中，于38.5 °C孵育30分钟。</li>
	<li>与MT-Red探针孵育后，用BM洗涤卵母细胞三次，然后在含5 µM H2DCF-DA（储存液：100 µM溶于BM）的相同培养基中继续孵育20分钟。</li>
	<li>探针处理后，用BM洗涤卵母细胞，并在2.5%戊二醛/PBS中固定至少15分钟。</li>
	<li>固定后，用BM洗涤卵母细胞三次，然后将其置于载玻片上，滴加4 µL MM，并加入终浓度为1 mg/mL的Hoechst 33342，使用石蜡垫圈避免样本受压。</li>
	<li>将载玻片于4 °C避光保存，直至检测。</li>
	<li>使用共聚焦激光扫描显微镜对免疫标记切片进行分析。显微镜配备Ar/He/Ne激光器，采用40/60倍油镜。通过顺序激发方式对切片进行分析。</li>
	<li>在线粒体评估中，使用多光子激光观察样本以检测MT-Red（激发波长：579 nm；发射波长：599 nm）。</li>
	<li>使用488 nm氩离子激光束及B-2 A滤光片（激发波长495 nm，发射波长519 nm）检测二氯荧光素（DCF）18。</li>
	<li>在每个单独的卵母细胞中，在赤道面处测量MT-Red和DCF的荧光强度19。</li>
	<li>在整个图像采集过程中，保持与荧光强度相关的参数恒定（激光能量26%，顺序设置1：PMT1增益649-PMT2增益482；顺序设置2：PMT1增益625-PMT2增益589；偏移量0；针孔大小：68）。</li>
	<li>采用Leica LAS AF Lite图像分析软件包进行荧光强度的定量分析，操作步骤参照文献20标准化流程。</li>
	<li>沿Z轴移动，仅采集一次图像，直至到达赤道面。</li>
	<li>对每张图像转换为灰度图，并关闭通道1（对应Hoechst蓝色）。然后手动在感兴趣区域（ROI）绘制一个包围区域，即围绕减数分裂纺锤体的范围。 
	注：该软件可自动读取通道2（FITC）的像素平均值，并从中扣除背景值。</li>
	<li>记录像素的平均值，并用于统计分析。</li>
</ol>
9. 统计分析
<ol>
	<li>采用卡方检验分析以下差异：幼年与成年卵母细胞的存活率，对照组与海藻糖处理组幼年卵母细胞的存活率及发育能力，不同钙离子浓度培养基玻璃化冷冻的成年卵母细胞的存活率、孤雌激活率及发育能力，低钙与高钙浓度培养基玻璃化冷冻幼年卵母细胞的受精率与胚胎发育情况，幼年玻璃化冷冻卵母细胞在复苏后不同培养时间点的线粒体活性表型变化，以及成年与幼年玻璃化冷冻卵母细胞之间的孤雌激活率差异。</li>
	<li>采用Levene方差齐性检验后，通过单因素方差分析（ANOVA）分析玻璃化冷冻成年卵母细胞在复苏后不同培养时间点的卵裂率与胚胎产出率，以及幼年玻璃化冷冻卵母细胞在复苏后不同时间点的线粒体活性荧光强度与细胞内活性氧（ROS）水平；并采用Tukey事后检验（post-hoc test）揭示各组间及组内的差异。</li>
	<li>使用统计学软件进行数据分析，以P &#60; 0.05作为差异具有统计学意义的最低标准。所有结果均以均值±标准误（mean ± S.E.M.）表示。</li>
</ol>

<ol><li>Arav, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+oocytes+and+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of oocytes and embryos.</a> Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).</li>
<li>Mullen, S. F., Fahy, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chronologic+review+of+mature+oocyte+vitrification+research+in+cattle%2C+pigs%2C+and+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep.</a> Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).</li>
<li>Hwang, I. S., Hochi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+cryopreservation+of+bovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li>
<li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), (2007).</li>
<li>Quan, G., Wu, G., Hong, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+Cryopreservation+Based+in+Sheep%3A+The+Current+Status+and+Future+Perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective.</a> Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recovery+time+after+warming+restores+mitochondrial+function+and+improves+developmental+competence+of+vitrified+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 110, (2018).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes+affects+in+vitro+pre-implantation+development+and+mRNA+abundance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance.</a> Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitrification+Devices+Affect+Structural+and+Molecular+Status+of+In+Vitro+Matured+Ovine+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).</li>
<li>Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic%2C+rather+than+nuclear-DNA%2C+insufficiencies+as+the+major+cause+of+poor+competence+of+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. , (2015).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+concentration+in+vitrification+medium+affects+the+developmental+competence+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes.</a> Theriogenology. 75 (4), (2011).</li>
<li>Sanaei, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+vitrification+of+in+vitro+matured+ovine+oocytes%3B+beneficial+effects+of+Ethylene+Glycol+Tetraacetic+acid%2C+an+intracellular+calcium+chelator%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator.</a> Cryobiology. 84, 82-90 (2018).</li>
<li>Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+maturation+and+developmental+capability+of+ovine+oocytes+at+germinal+vesicle+stage+following+vitrification+using+different+cryodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices.</a> Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).</li>
<li>Fernández-Reyez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((maturation+and+embryo+development+in+vitro+of+immature+porcine+and+ovine+oocytes+vitrified+in+different+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices.</a> Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).</li>
<li>Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants+and+glycine+can+improve+the+developmental+competence+of+vitrified%2Fwarmed+ovine+immature+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction+in+Domestic+Animals%22%5BJournal%5D)">Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes.</a> Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).</li>
<li>Barrera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+delipidated+estrous+sheep+serum+supplementation+on+in+vitro+maturation%2C+cryotolerance+and+endoplasmic+reticulum+stress+gene+expression+of+sheep+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes.</a> PLoS ONE. 13 (6), (2018).</li>
<li>Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Ovine+Embryos+in+Synthetic+Oviductal+Fluid+Containing+Amino+Acids+at+Oviductal+Fluid+Concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations.</a> Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).</li>
<li>Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+vitrification+method+for+cryopreservation+of+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).</li>
<li>Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+spectral+properties+of+novel+chlorinated+pH+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Luminescence%22%5BJournal%5D)">Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes.</a> Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).</li>
<li>Dell'Aquila, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prooxidant+effects+of+verbascoside%2C+a+bioactive+compound+from+olive+oil+mill+wastewater%2C+on+in+vitro+developmental+potential+of+ovine+prepubertal+oocytes+and+bioenergetic%2Foxidative+stress+parameters+of+fresh+and+vitrified+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes.</a> BioMed Research International. 2014, (2014).</li>
<li>Gadau, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+quantitative+analysis+on+%CE%B1-tubulin+modifications+in+glioblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells.</a> Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).</li>
<li>los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+distribution+and+meiotic+progression+in+canine+oocytes+during+in+vivo+and+in+vitro+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation.</a> Theriogenology. , (2011).</li>
<li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+kinetic+of+the+first+meiotic+division+and+in+active+mitochondrial+distribution+between+prepubertal+and+adult+oocytes+mirror+differences+in+their+developmental+competence+in+a+sheep+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model.</a> PLoS ONE. 10 (4), (2015).</li>
<li>Berlinguer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+trehalose+co-incubation+on+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocyte+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).</li>
<li>Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+features+and+microtubular+changes+in+vitrified+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes.</a> Theriogenology. 148, 216-224 (2020).</li>
<li>Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+dependent+effect+of+post+warming+interval+on+microtubule+organization%2C+meiotic+status%2C+and+parthenogenetic+activation+of+vitrified+in+vitro+matured+sheep+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes.</a> Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).</li>
<li>Ciotti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+recovery+is+faster+in+vitrification+of+human+oocytes+compared+to+slow+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing.</a> Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).</li>
<li>Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Coupling+and+Maturation-Promoting+Factor+Activity+in+In+Vitro-Matured+Prepubertal+and+Adult+Sheep+Oocytes1%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1.</a> Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).</li>
<li>Palmerini, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+maturation+is+slowed+in+prepubertal+lamb+oocytes%3A+ultrastructural+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).</li>
<li>Leoni, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relations+between+relative+mRNA+abundance+and+developmental+competence+of+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes.</a> Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).</li>
<li>Succu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+vitrification+solutions+and+cooling+upon+in+vitro+matured+prepubertal+ovine+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes.</a> Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).</li>
<li>Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-free+vitrification+reduces+cryoprotectant-induced+zona+pellucida+hardening+and+increases+fertilization+rates+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes.</a> Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).</li>
<li>Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+activation+deficiency%3A+a+role+for+an+oocyte+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution.</a> Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).</li>
<li>Rienzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte%2C+embryo+and+blastocyst+cryopreservation+in+ART%3A+systematic+review+and+meta-analysis+comparing+slow-freezing+versus+vitrification+to+produce+evidence+for+the+development+of+global+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance.</a> Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).</li>
<li>De Santis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+vitrification%3A+influence+of+operator+and+learning+time+on+survival+and+development+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Placenta%22%5BJournal%5D)">Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters.</a> Placenta. 32, 280-281 (2011).</li>
<li>Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technologies+in+medical+applications+of+minimum+volume+vitrification%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification.</a> Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

家畜卵母细胞的冷冻保存不仅有助于雌性遗传资源的长期保护，还能推动胚胎生物技术的发展。因此，建立一种标准化的卵母细胞玻璃化冷冻方法将有利于畜牧业和科研领域。本方案提供了一种成年绵羊卵母细胞玻璃化冷冻的完整方法，可为建立高效的幼龄卵母细胞玻璃化冷冻体系提供可靠的起点。
该方法的主要优势之一在于，它涵盖了从卵母细胞采集、体外成熟、玻璃化冷冻到复温的全部步骤。此外，该方法还包括一段复温后的培养期，使卵母细胞在受精前能够从玻璃化冷冻过程中所受的损伤中恢复。最佳受精时间应根据冷冻保存方法、卵母细胞初始质量、患者年龄和物种进行个性化调整，同时必须兼顾恢复时间和卵母细胞老化两个方面25,26。因此，选择复温后孵育时间的长短具有挑战性，并可能影响卵母细胞玻璃化冷冻项目的最终结果。根据本方案所述条件下获得的卵裂率和胚胎发育结果，成年绵羊卵母细胞在玻璃化冷冻后，最佳受精时间为复温后孵育4小时（表4）6。这一...

雌性配子的长期保存具有广泛的应用前景，例如通过遗传选育项目改良家畜育种，通过异地野生动物保护计划促进生物多样性保护，以及利用可储存的卵母细胞开展体外胚胎生产或核移植项目，从而推动体外生物技术的研究与应用1,2,3。对幼年个体的卵母细胞进行玻璃化冷冻还可通过缩短育种过程中的世代间隔，提高遗传增益4。目前，通过超快速降温与复温实现卵母细胞玻璃化已被视为家畜卵母细胞冷冻保存的标准方法5。在反刍动物中，通常在从屠宰场获取的卵巢卵泡中采集卵母细胞后，先进行体外成熟，再实施玻璃化冷冻2。成年动物、尤其是未成熟前的幼龄动物的卵巢4,6，实际上可提供近乎无限数量的可用于冷冻保存的卵母细胞。
近十年来，多个实验室普遍报道，牛卵母细胞经玻璃化冷冻及复温后，囊胚发育率通常可超过&#62;10%3。然而，在小型反刍动物中，无论是幼龄还是成年个体的卵母细胞，玻璃化冷冻技术仍相对较新，绵羊卵母细胞的标准化玻璃化冷冻方法尚未建立2,5。尽管近年来取得了一些进展，但经玻璃化冷冻和复温的卵母细胞确实存在多种功能和结构上的改变，限制了其发育潜能7,8,9。因此，仅有少数研究报道了玻璃化冷冻/复温后绵羊卵母细胞的囊胚发育率达到或超过10%2。为减少上述不利改变，研究人员已探索了多种策略：优化玻璃化冷冻液和复温液的成分10,11；尝试使用不同的冷冻载具8,12,13；以及在体外成熟（IVM）期间4,14,15和/或复温后的恢复阶段6施加特定处理措施。
本文描述了一种对来自未成年和成年供体且经体外成熟培养的绵羊卵母细胞进行玻璃化冷冻保存的方案。该方案涵盖了从卵母细胞体外成熟、玻璃化冷冻、复温到复温后培养的全部操作步骤。

<table><tbody><tr><td>2&amp;prime;,7&amp;prime;-二氯荧光素二乙酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-6883</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白V组分，无蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>双苯并咪唑H 33342三盐酸盐（Hoechst 33342）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl2 2H20）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica Microsystems GmbH, Wetzlar</td><td>TCS SP5 DMI 6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Cryotop Kitazato</td><td>Medical Biological Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>半胱胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9768</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)果糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-海藻糖无水物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>蛋黄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3556</td><td></td></tr><tr><td>乙二醇（EG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5638</td><td></td></tr><tr><td>戊二醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>次黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1384</td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜</td><td>Diaphot, Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3534</td><td></td></tr><tr><td>L-精氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3784</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4284</td><td></td></tr><tr><td>L-天冬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4534</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-胱氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8786</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>LH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6420</td><td></td></tr><tr><td>L-组氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9511</td><td></td></tr><tr><td>L-异亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7383</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1512</td><td></td></tr><tr><td>L-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1137</td><td></td></tr><tr><td>L-甲硫氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2893</td><td></td></tr><tr><td>L-鸟氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O6503</td><td></td></tr><tr><td>L-苯丙氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5030</td><td></td></tr><tr><td>L-脯氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4655</td><td></td></tr><tr><td>L-丝氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5511</td><td></td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>L-缬氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V6504</td><td></td></tr><tr><td>七水合氯化镁（MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Makler计数板</td><td>Sefi-Medical Instruments ltd. Biosigma S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Red CM-H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;XRos</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>新生小牛血清，热灭活（FCS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4762</td><td></td></tr><tr><td>青霉素G钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>酚红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇（87-90%水解，平均分子量30,000-70,000）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>羊血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2202</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO&lt;sub&gt;3)&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>DL-乳酸钠溶液糖浆</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>精子分类分析仪</td><td>Microptic S.L.</td><td>S.C.A. v 3.2.0</td><td></td></tr><tr><td>统计软件 Minitab 18.1</td><td>2017 Minitab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7146</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15,456-3</td><td></td></tr></tbody></table>

绵羊成年与未成年卵巢体外成熟卵母细胞的玻璃化冷冻

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

在畜牧业中，由于可以从屠宰场方便地获取大量卵巢和卵母细胞，体外胚胎生产系统得以建立并维持。成年动物的卵巢始终带有多个腔状卵泡，而在未成年供体中，4周龄时可获得的卵母细胞数量最多，此时卵巢中的腔状卵泡数量达到峰值。因此，尽管未成年卵母细胞的发育潜能低于成年个体的卵母细胞，4周龄的羔羊仍被认为是良好的供体。
成功冻存来自成年和青春期前供体的玻璃化卵母细胞，将有助于推动基础研究和商业应用的发展。对青春期前供体所采集卵母细胞进行玻璃化保存，还可缩短世代间隔，从而提高育种计划中的遗传增益。然而，冻存后发育潜能的下降使得哺乳动物卵母细胞成为最难冻存的细胞类型之一。在现有的冻存技术中，玻璃化法已广泛应用于动物和人类卵母细胞的保存。尽管该技术近年来已有进步，但高浓度冷冻保护剂的暴露以及冷损伤和渗透压应激仍会引发多种结构和分子水平的改变，降低哺乳动物卵母细胞的发育潜能。本文介绍了一种对来自未成年和成年供体、经体外成熟后的绵羊卵母细胞进行玻璃化冻存的实验方案。该方案涵盖了从卵母细胞体外成熟、玻璃化冻存、复温到复温后培养的全部操作步骤。处于MII期的卵母细胞经玻璃化冻存和复温后确实可以受精，但在受精前需要额外的培养时间，以修复冻存过程造成的损伤并提升其发育潜能。因此，复温后的培养条件和培养时间对于恢复卵母细胞发育潜能至关重要，尤其是在卵母细胞来源于未成年供体的情况下。

来自未成年供体的卵母细胞的冷冻耐受性低于成年供体。首先观察到的现象是，与成年卵母细胞相比，未成年卵母细胞在复温后的存活率较低（图1A；χ2检验 P&lt;0.001）。未成年卵母细胞在复温后表现出较低的膜完整性（图1B）。在成熟培养基中添加海藻糖旨在验证这种糖是否能够减少未成年卵母细胞的冷冻损伤。已有研究数据23表明，添加海藻糖体外成熟24小时的卵母细胞，在玻璃化冷冻/复温后的存活率高于未处理组（表1：分别为85.7% vs 75.3%；χ2检验 P&lt;0.05）。事实上，添加海藻糖与复温后更高的膜完整性相关（图2A）。因此，在未成年卵母细胞的体外成熟过程中使用海藻糖，使其玻璃化冷冻后的存活率（85.7%）提高到接近成年卵母细胞的水平（90.3%）。然而，海藻糖的添加并未提高未成年卵母细胞的卵裂率、受精率及发育率（表...

本方案旨在提供一种用于成年和幼年绵羊卵母细胞玻璃化冷冻的标准方法。该方案涵盖了从体外成熟培养基的制备到复苏后培养的全部步骤。卵母细胞在MII期采用Cryotop法进行玻璃化冷冻，以确保使用最小必要体积。

在畜牧业中，由于能够轻松获取大量卵巢和卵母细胞，体外胚胎生产系统得以建立并维持……

卵母细胞在长期保存后维持其潜在活力是一项极具前景的技术，可促进通过遗传选育项目改良家畜育种，有助于通过野生动物物种保护来维护生物多样性，并推动生物技术领域的研究。幼年动物卵母细胞的玻璃化冷冻技术显著缩短了育种项目的世代间隔。超快速冷却与复温的玻璃化冷冻法已被视为牛卵母细胞保存的标准方法。然而，在绵羊中，该技术仍被视为相对较新，且缺乏标准方法。在本视频中，我们介绍了一种对来自未成年和成年供体、经体外成熟后的绵羊卵母细胞进行玻璃化冷冻的方案。该方案包括体外成熟、玻璃化冷冻、复温及复温后培养的全部操作步骤。在回收卵丘-卵母细胞复合体后，将其中的未成熟卵母细胞在体外培养24小时，培养条件为静态环境，且针对幼龄卵母细胞，在成熟培养基中添加100 µM的海藻糖。体外成熟后，通过轻柔吹打机械去除卵母细胞的卵丘细胞，并在体视显微镜下以60倍放大倍数进行观察。选择用于玻璃化冷冻程序的卵母细胞是确保该操作成功应用的首要关键步骤。必须挑选那些细胞质均匀、脂滴分布均一、透明带完整且厚度适中并连续、致密，透明带外径约为19微米，并已排出第一极体、处于M2期的卵母细胞。玻璃化冷冻采用最小必需体积法，使用Cryotop装置进行。挑选后，将五枚未成熟卵母细胞置于基础培养基中，在38.5°C条件下孵育两分钟。随后，卵母细胞通过暴露于校准溶液中3分钟进行脱水。将卵母细胞装载到所使用的玻璃化冷冻装置中是一个重要且关键的步骤。Cryotop使用附着在支架上的聚丙烯条。在此方法中，将处于玻璃化冷冻溶液中的卵母细胞（体积小于0.1毫升）用玻璃毛细管迅速加载到薄膜条表面。随后需去除溶液，仅留下足以覆盖待冻存细胞的薄层。接着立即将其装入Cryotop装置，并在30秒内直接浸入液氮中。对于温暖的内部生物学温度，将每个玻璃化冷冻装置中的内容物从液氮中转移至含有递减浓度海藻糖溶液的200微升液滴中。使用细玻璃移液管将卵母细胞逐个转移，以促进细胞内冷冻保护剂的去除。最后，将卵母细胞在含5%二氧化碳的培养箱中，于基础培养基中进行预培养。复温后立即以及在复温后培养的每个时间点，均使用倒置显微镜在100倍放大倍数下对卵母细胞进行形态学评估。来自未成年供体的卵母细胞的冷冻耐受性较低，与复温后膜完整性下降有关。在成熟培养基中添加海藻糖可提高未成年卵母细胞的膜完整性，从而增加玻璃化冷冻后的存活率。然而，海藻糖的添加并未提高幼年期卵母细胞的卵裂率、受精率和发育率。使用钙离子浓度为2.2毫克/分升的培养基对幼年期卵母细胞进行玻璃化冷冻，理论上应比使用其他钙离子浓度的卵母细胞获得更高的受精率，但实际并未发现显著差异，无法促进胚胎的有效生产。通过比较复温后不同培养时间的影响，我们发现，来自较年长个体的卵母细胞在复温后培养4小时即可恢复其能量储备和微管结构，并恢复发育潜能，从而实现更高的卵裂率和囊胚形成率。与其它时间点相比，玻璃化冷冻后复温的幼年卵母细胞在复温后培养4小时时线粒体活性更高。在复温后培养6小时期间，线粒体分布模式也发生了改变。此外，与0、4和6小时相比，幼年卵母细胞在复温后2小时的细胞内活性氧水平显著降低。然而，与其他卵母细胞不同的是，幼年个体卵母细胞在复温后培养期间，其自发孤雌激活率有所上升。本方法的主要优势之一在于，它涵盖了从卵母细胞采集、体外成熟、玻璃化冷冻、复温，直至复温后培养的全部步骤，其中复温后培养阶段有助于卵母细胞从玻璃化冷冻过程中所受损伤中恢复。选择最佳受精时机具有挑战性，且可能影响玻璃化冷冻程序的结果。还应考虑到，与慢速冷冻不同，玻璃化冷冻是一种手工操作技术，因此依赖于操作者。正因如此，一个主要挑战是需要技术熟练的技术人员和研究人员，并在评估玻璃化冷冻程序结果时充分考虑操作者效应。我们实验室的进一步研究将有助于标准化卵母细胞玻璃化冷冻程序及筛选方法，并更好地根据未成年卵母细胞的需求优化培养基成分。对于培养条件、细胞特性及抗氧化剂使用的深入探索，为我们提供了具有前景的研究方向。

vitrification-vitro-matured-oocytes-collected-from-adult-prepubertal

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从绵羊的成人和前卵巢收集的体外成熟卵母细胞的振动

本文描述了一种从形态学和生物化学角度对马卵母细胞进行表征的实验方法。具体而言，本研究展示了如何通过超声引导下的卵母细胞采集术（OPU）获取未成熟和成熟的马卵母细胞，并阐述了如何研究染色体分离、纺锤体形态、组蛋白整体乙酰化水平以及mRNA表达。...

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本文展示了两种在三维培养条件下包封猪卵母细胞的实验方案。第一种方法是将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包封于纤维蛋白-海藻酸盐微珠中；第二种方法是将其与氟化乙烯丙烯粉末颗粒（微型生物反应器）共同封装。这两种系统均可提供最佳条件，以维持卵母细胞的三维结构。...

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本文描述了一种使用实验室自制培养基在商用载体上对未成熟猫卵母细胞进行最小体积玻璃化冷冻的实验方案。该方案涵盖了从离体性腺中分离卵母细胞到玻璃化冷冻及复温的每一个步骤。...

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本文介绍了用于玻璃化冷冻小鼠和绵羊植入前胚胎的蒙得维的亚刮铲法，该方法采用自制的刮铲和自制的溶液。胚胎在两种浓度递增的冷冻保护剂溶液中快速平衡后，被加载到刮铲上，浸入液氮中，最后用0.5...

用于哺乳动物胚胎玻璃化冷冻的蒙得维的亚刮铲装置

本方案概述了从体外受精（IVF）过程中分离和处理卵泡液、体细胞及未成熟卵母细胞的标准化方法，可用于高质量的分子与细胞分析。这些方法有助于利用临床治疗中通常被丢弃的材料，开展针对生育力、生殖衰老及卵巢功能障碍的转化医学研究。...

从接受辅助生殖技术治疗的个体中收集人卵泡液、卵泡体细胞及未成熟卵母细胞 体外 受精

我们描述了操作Xenopus laevis未成熟卵母细胞、卵母细胞体外成熟为卵子以及胞质内精子注射的方法。in...

操作与 体外 成熟 非洲爪蟾 卵母细胞，继以胞质内精子注射，用于研究胚胎发育

体外集落形成实验用于鉴定从成年小鼠胰腺中分离的三潜能前体细胞

了解绵羊卵母细胞玻璃化冷冻的标准化方案，涵盖体外成熟、冷冻保存及复苏培养全过程。该方法适用于成年和幼年供体，有助于优化生殖生物技术中的遗传资源保存策略。

绵羊成年与未成年卵巢体外成熟卵母细胞的玻璃化冷冻

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