Name: 低温结构照明微观数据收集来自低温保存细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 了解低温结构照明显微镜技术，用于在低温条件下对完整细胞进行超分辨率成像。该方法使用常规荧光染料，可精确定位线粒体和微管等亚细胞结构，并兼容X射线断层扫描等关联成像技术。

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本项目获得了欧洲委员会“地平线2020”iNEXT-Discovery项目的资助。I. M. Dobbie 承认获得了惠康信托基金（Wellcome Trust，项目编号：107457/Z/15/Z）的资助。本工作在钻石光源（Diamond Light Source）B24仪器（提案编号：BI25512）的支持下完成。我们感谢Micron的工作人员以及所有优秀的用户和合作者，感谢他们帮助我们建立冷冻SIM技术及其关联成像潜力。

注意：本方案适用于含有在透射电子显微镜（TEM）3 mm 平面金网格（带有穿孔碳支持膜）上培养或沉积的细胞的样品，这些样品已通过浸入冷冻或高压冷冻实现玻璃化。本方案假设样品已使用常规落射荧光和明场显微镜进行成像，以定位在低温结构照明显微镜（cryoSIM）中成像的兴趣区域。整个方案的概览见图1。
1. 冷冻载台的准备
<ol>
	<li>制备无冰液氮（LN2) 通过淋巴结（LN）2 通过一个内衬有标准科学用干性擦拭纸的漏斗。 
	注意：由于LN2&#160;会造成灼伤，操作时应穿戴适当的个人防护装备，包括防冻手套和护目镜。此类液体可能置换氧气，导致迅速窒息，应在通风良好的区域操作。</li>
	<li>使用加压空气清除冷冻载台表面的灰尘。使用加压空气罐前，先排出其中的液体。</li>
	<li>确保样品加载卡盒已安装到位，并使用合适的带孔样品架（检查样品架中是否遗留了之前实验的网格）图2).</li>
	<li>打开冷冻载台外部杜瓦瓶的盖子，倒入过滤过的液氮2&#160;直到大约 1/4th 装满。待初始沸腾平息后再继续倒入；将容器填充至约2/3处rd 装满后，小心盖上盖子，确保喷嘴朝向远离操作人员和载物台/光学部件的方向，同时液氮2&#160;从出口处沸腾溢出。</li>
	<li>一旦LN2&#160;当出口不再有液体流出时，将出口管置于冷冻载台的液氮杜瓦瓶上。</li>
	<li>接通载物台的电源，并将USB线连接至冷冻载物台。确保加热样品室盖已接通电源。将外部杜瓦瓶连接至载物台。 
	注意：在将出口管放置到冷冻载台上的杜瓦瓶之前，切勿连接外部杜瓦瓶。如果液氮2 溢出（或为防止溢出），拔下USB线约10秒，使其平衡，然后重新连接USB线以重新激活传感器。</li>
	<li>淋巴结切除术后2&#160;已将样品送入样品台液氮罐后，按下冷冻样品台上的释放按钮，以释放液氮2&#160;进入样品室。 
	注意：液氮存在时，切勿让系统无人看管2 正在填充腔室。</li>
	<li>等待约30-45分钟，使系统冷却并稳定，然后开始图像采集。定期检查外部杜瓦瓶，并用过滤的液氮补充。2 如果少于四分之一满（大约每小时一次）。</li>
</ol>
2. 将样本储存盒转移至冷冻载台
注意：在接触样本或样本室内的任何低温表面之前，先将样本储存盒、 holder 以及所有器械（例如镊子）的尖端浸入过滤后的液氮（LN2）中进行冷却。处理生物样本时应穿戴实验服和手套。
<ol>
	<li>确保玻璃化样品置于兼容冷冻的容器中，并将其带至显微镜处。按下冷冻载台上的相应按钮，以打开样品腔内的照明灯。</li>
	<li>使用卡带工具上的六角扳手打开样品转移卡带的两片夹板。将夹板张开至足以将载网放入两板之间的程度，但避免完全张开，以防载网从另一侧滑落。</li>
	<li>使用长镊子将样品载网盒从液氮（LN2）中取出，旋转至缺口对准载台内样品储存位置的方向，并将其放置在载台上。使用合适的工具（例如螺丝刀）将储存盒盖打开至目标样品位置。</li>
	<li>使用倒置镊子（或任何尖头外科镊子），从样品 holder 中取出透射电镜（TEM）载网，将其浸入液氮（LN2）中，并放入样品转移卡带的指定位置，在整个转移过程中保持靠近液氮（LN2&#160;）。确保碳膜面朝向最终将面对样品桥上物镜的方向放置。</li>
	<li>使用卡带工具上的六角扳手关闭样品卡带。关闭并移除储存盒及其中剩余的所有样品。</li>
	<li>使用卡带工具上的磁性尖端，将装有载网的卡带提起并安装到样品桥上。在整个转移过程中保持其浸没或靠近液氮（LN2&#160;）。确保其方向与样品桥匹配（两个磁体会与样品桥上的磁体接触）。将卡带平整地放入样品桥的定位销内，并轻轻推动以确保其固定。 
	&#8203;注意：在B24光束线的CryoSIM设施中，也提供一种适用于已制备用于后续聚焦离子束铣削的带夹载网的样品卡带。</li>
</ol>
3. 载物台对接与聚焦
<ol>
	<li>将冷冻载台盖板的开口移至成像位置，并关闭样品室照明。将载台向光学系统方向滑动，使其与物镜对齐。使用杠杆轻柔地将物镜下放至指定位置，确保其位于冷冻载台盖内，但不与之接触。 
	注意：在数据采集过程中，务必确保外部杜瓦瓶的出口管在任何情况下均不接触冷冻载台上的杜瓦瓶。</li>
	<li>用不透光的黑色遮光帘覆盖载台和光学系统。在冷冻SIM计算机上启动控制软件Cockpit（图3 和 图4）。</li>
	<li>单击每台相机的 读出模式 按钮，并将其设置为 CONV 3 MHz。检查每台相机的温度是否为 -80 °C，且相机风扇已关闭。</li>
	<li>打开 反射 相机。在 光源 下选择 环境光（曝光时间 20 ms），在 linkam 下点击 聚光镜。单击 视频模式 按钮。</li>
	<li>在 马赛克视图 窗口中，使用鼠标滚轮缩小以查看网格轮廓。若无法看到载台，点击 查找载台。通过在圆圈中心双击左键，将网格居中。</li>
	<li>调节样品焦距，直至网格支撑膜（或任何其他相关样品特征）清晰对焦，使用 上 和 下 键上下移动冷冻载台，并使用数字小键盘上的 9 和 3 键调整z步长（初始对焦时设为 20 µm）。 
	&#8203;注意：若z轴行程不足，可手动旋转冷冻载台下方的旋钮来上下移动载台。每次旋转一格，并检查样品是否进入可视范围。若对焦情况恶化，则反向调节。</li>
</ol>
4. 明场图像拼接采集
<ol>
	<li>当载物台居中后，关闭视频模式，采集可见光图像拼接图（在拼接图视图中点击运行拼接，以生成从中心向外螺旋排列的可见光图像瓦片）。如果网格发生弯曲，尝试在网格上选择不同位置（在拼接图视图内双击左键），重新对焦，然后再次点击运行拼接以采集部分拼接图。或者，可在拼接图上方插入一幅已对焦的图像（图3）。</li>
	<li>点击保存拼接图以保存当前视图。文件名应简短，并包含存储盒编号及相应网格编号信息（时间戳将自动附加到文件名末尾）。</li>
</ol>
5. 感兴趣区域的鉴定
<ol>
	<li>检查明场马赛克图像以及先前的任何荧光&#34;图谱&#34;图像，确定目标细胞或生物学特征先前所在的位置。检查这些区域是否能产生合适的荧光信号。
	<ol>
		<li>关闭环境光和聚光镜，如果处于激活状态，还需关闭视频模式&#160;。开启所需的激发激光（405、488、561 或 647 nm），并选择对应的相机和滤光片，初始功率设为 50 mW，曝光时间为 50 ms。 
		注：根据荧光信号的强弱，相应地增加或减少相机和滤光片的设置。</li>
		<li>按0键拍摄图像，按*键进行自动对比度调节。或者，通过图像底部的滑块手动调整对比度。 
		注：打开房间内的激光开启指示标志。</li>
		<li>一旦发现具有合适荧光信号且生物学上有意义的细胞，使用Mosaic view中的标记位点按钮标记其位置。 
		注：这些已标记的位点将显示在列表中，可通过双击坐标进行访问。返回已标记位点时，应先放大该区域再双击。</li>
		<li>在开始图像采集前，继续标记所有潜在的位点。将包含标记位点的马赛克图像重新保存；点击将位点保存至文件。
		<ol>
			<li>若需使用StitchM软件（由B24线站内部开发）拼接马赛克图像，请将.txt 马赛克文件拖放到扩展名为.bat的StitchM文件中，并将拼接后的马赛克图像以TIFF格式保存在同一文件夹中。若要保存包含标记位点的图像，请同时将mosaic.txt文件和markers.txt文件拖放到该程序图标上。 
			&#8203;注：需权衡数据采集量与项目需求之间的关系（例如，若需进行关联成像，应确认合作成像模态可采集的图像数量，并据此选择合适的cryoSIM成像位点数量）。此外，若外部杜瓦瓶需要补充液氮（LN2），冷冻载台系统的位置会发生变化，导致已标记位点无法准确复现；因此在确定成像位点数量时应考虑此因素。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 数据采集策略
<ol>
	<li>根据荧光图像中动态范围内的计数（位于相机视图窗口底部）设置激光曝光时间。选择要应用的滤光片，并针对将要使用的每种激发光波长分别优化这些设置，每次单独开启一种激光。 
	&#8203;注意：尽管10,000–20,000计数为最佳范围，但如果对比度良好，较低的计数也可接受。理想情况下，在每次获取图像堆栈前应检查滤光片设置，因为网格不同区域的细胞可能具有不同的荧光水平。</li>
</ol>
7. 数据收集
<ol>
	<li>点击两者 相机 打开电源开关。返回之前标记的位点，再次聚焦到目标深度。在感兴趣区域获得清晰图像后，向上调节至失焦状态（↑ 关键）在&#160;的 XY 窗口中的 宏平台 选择要采集的z轴堆叠高度，然后单击 保存顶部。向下移动焦距，脱离焦点↓ 键），单击 保存底部 然后在 前往中心位置，并检查图像是否仍处于焦点中。 
	注意：样品高度将显示在窗口中。</li>
	<li>右键单击 slm （空间光调制器）在 驾驶舱 窗口，并确保角度设置为 0.41。在 Cockpit 窗口中，选择 单点实验. 
	注意：请勿手动开启 slm；Cockpit 将在图像采集期间自动将其打开。
	<ol>
		<li>从下拉列表中选择 结构光照明显微技术. 改变 堆叠高度 使其等于 z 高度加 1 µm。 
		注意：添加 1 µm 可确保在 z 轴方向完整捕获整个样本，并最大限度减少重建伪影。</li>
		<li>在上方一行输入405 nm和488 nm激光的曝光时间（ms）（用于反射相机），在下方一行输入561 nm和647 nm激光的曝光时间（ms）（用于透射相机）。 
		注意：曝光时间的数值应与之前确定并在主文中显示的数值一致 驾驶舱 窗口</li>
		<li>输入文件名（命名规范：盒子编号_网格区域_滤光片_FL）（根据成像类型选择 FL（荧光）或 BF（明场））。点击 更新 生成一个包含日期和时间的新文件，以避免覆盖先前的文件。然后，单击 开始.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检查 相机视图 在采集数据的同时，若存在任何 xy 方向的位移，需重新拍摄图像。如果淋巴结2&#160;在图像采集过程中为低温台补充杜瓦罐时，通过点击中止该过程 中止 按钮在 驾驶舱 软件
	<ol>
		<li>当外部杜瓦瓶完成对样品台杜瓦瓶的重新填充后，需重复实验，因为重新填充会导致样品在垂直方向上发生位移。重新对焦图像以在 z 轴方向重新居中，并重复该过程 单点实验. 重复该步骤 单点实验 针对所需的所有激光器和滤光片组合。 
		注意：重新加样大约需要 30 秒至 1 分钟。在对一个网格进行成像的过程中，将发生约 4 至 8 次重新加样。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在每个位置，使用可见光采集z轴层扫图像。
	<ol>
		<li>关闭激光器，并打开 环境光 和 冷凝器. 下 单点实验，选择 Z轴扫描，设置 环境光 20毫秒曝光，z轴高度保持同上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对网格上标记的所有位点重复步骤 7.2 至 7.4。</li>
	<li>在转到下一个样本之前，单击以删除马赛克 删除图块.
	<ol>
		<li>用方框框选所有瓦片以将其删除。同时在列表中选中所有标记，然后点击删除。 删除选定的位点.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>关闭环境光和聚光镜，然后进行更换网格的操作。按照第4节步骤的相反顺序操作，将载物台从物镜下方移出，然后更换网格。</li>
</ol>
8. 成像后处理
<ol>
	<li>成像完成后，卸下样品台并取出所有样品。关闭样品室照明。拔下外部杜瓦瓶，将剩余的液氮（LN2&#160;）倾倒至另一个适用于低温的容器中，使杜瓦瓶安全恢复至常温。</li>
	<li>将密封盖安装到冷冻样品台上。等待直至系统显示可执行烘烤操作，此时样品台杜瓦瓶中已无残留液氮（LN2&#160;）。按下烘烤按钮进入加热模式，以去除冷冻样品台上的水分，防止结冰。</li>
</ol>
9. 重建
<ol>
	<li>将原始SIM数据文件转移至适当的计算机工作站进行重建。通过Processing Task builder窗口批量运行处理，使用通道特异性的光学传递函数（OTFs）（由多荧光微球的点扩散函数计算获得）和K0角度（0.29278, -1.8028, 2.3786），所有通道均采用0.004的恒定维纳滤波器和200的偏置偏移量。</li>
	<li>在Additional options面板中，确保仅保留“丢弃负强度”选项，其余选项均不勾选。将SIR图像保存到名为&#34;processed&#34;的文件夹中。 
	&#8203;注意：商用SIM重建软件通常会生成重建后的SIM数据，并保留原始文件名，但在文件名末尾添加SIR.dv。同时会生成一个日志文件，其中包含处理协议、步骤以及关于重建成功率的统计信息。</li>
</ol>
10. 色差校正
<ol>
	<li>下载软件 Chromagnon7 以校正色差位移。</li>
	<li>使用与所采集数据的荧光波长相对应的色差位移参考矩阵（由同步辐射光束线提供）。 
	&#8203;注意：参考文件为“chromagnon.csv”文件，其中包含对准参数，是通过多荧光纳米颗粒的校准图像获得的，可用于批量处理多个数据集。
	<ol>
		<li>选择与用于样品成像的激光波长和滤光片相匹配的适当参考文件，并将其添加到 参考 字段中。将待对准的重建 SIR 数据添加至源字段，然后点击 运行。</li>
		<li>检查荧光信号在图像中是否已对齐。对于批量处理，将所有待对准的 SIR 图像放入源字段，参考文件放入参考字段，然后点击 全部运行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
<li>Ball, G., Demmerle, J., Kaufmann, R., Davis, I., Dobbie, I. M., Schermelleh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIMcheck%3A+A+toolbox+for+successful+super-resolution+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">SIMcheck: A toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy.</a> Scientific Reports. 5 (1), 15915(2015).</li>
<li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+and+soft+X-ray+microscopy+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">3D Correlative cryo-structured illumination fluorescence and soft X-ray microscopy elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182 (2), 515-530 (2020).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Rego, E. H., Shao, L., Rego, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Practical structured illumination microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1251, 1251(2015).</li>
<li>Phillips, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSIM%3A+super-resolution+3D+structured+illumination+cryogenic+fluorescence+microscopy+for+correlated+ultrastructural+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">CryoSIM: super-resolution 3D structured illumination cryogenic fluorescence microscopy for correlated ultrastructural imaging.</a> Optica. 7 (7), 802(2020).</li>
<li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8, 7583(2018).</li>
<li>Kaufmann, R., Hagen, C., Grünewald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+cryo-microscopy%3A+current+challenges+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence cryo-microscopy: current challenges and prospects.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 20, 86-91 (2014).</li>
<li>Phillips, M. A., Pinto, D. M. S., Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPEKcheck-fluorescence+microscopy+spectral+visualisation+and+optimisation%3A+a+web+application%2C+javascript+library%2C+and+data+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Wellcome+Open+Research%22%5BJournal%5D)">SPEKcheck-fluorescence microscopy spectral visualisation and optimisation: a web application, javascript library, and data resource.</a> Wellcome Open Research. 3, 92(2018).</li>
<li>Demmerle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategic+and+practical+guidelines+for+successful+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy.</a> Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).</li>
</ol>

作者声明不存在竞争性财务利益。

与其它超分辨率成像技术相比，低温条件下的三维结构光照明显微镜（3D SIM）在对玻璃态生物样品成像时具有诸多优势。该方法每层z切片所需的图像数量显著少于其他超分辨率方法，从而减少了辐照量，降低了玻璃态样品中冰晶形成的概率。此外，该技术能够对整个细胞进行成像，并可与X射线断层扫描技术联用，实现结构与功能的关联分析。有趣的是，大多数市售荧光染料和荧光标记在低温条件下的光漂白程度低于室温条件。然而，考虑到多数常见荧光染料在室温下已具有较高的量子产率（某些情况下超过80%），所检测到的光子绝对增益并非源于量子产率的改变，而是由于复杂的光漂白过程被抑制所致。有关荧光染料在低温条件下发光产率的更多信息可参见文献8。
使用具备明场功能的常规冷冻荧光显微镜对送达cryoSIM的样品进行预先成像，以生成网格图，这是至关重要的 &#34;地图&#34; 包括对所有潜在的AOI进行高亮显示，以便进一步成像（图5）。cryoSIM 的使用时间通过竞争性流程分配，申请人需提交方案，随后由评审方评估其技术可行性和生物医学影响力。因此，设备使用时间始终紧张 &#34;极为珍贵&#34;，预设的网格标记可实现资源分配的最高效率。在样品从样品 holder 转移至成像平台的过程中，必须始终保持其处于玻璃态，以最大限度减少冰晶形成及由此导致的样品损伤。样品质量应良好，以获得最佳的 SIM 图像。制备良好的样品应具备以下特征：（a）无冰晶污染，（b）使用带定位标记的 finder grid，（c）载网基底平整，（d）载网网格及基底表面无自发荧光，（e）支撑膜无破损。通过谨慎操作样品并确保其始终处于玻璃态，即可满足上述各项前提条件。
在使用冷冻SIM显微镜前，必须预先确认所选用的样品荧光染料是否能够产生足够的信号。诸如SPEKCheck9之类的工具可帮助选择最优的荧光染料和滤光片组合。如果原始数据采集或重建过程存在问题，则在图像重建后可能出现伪影。Demmerle等人10已记录了多种不同类型伪影的实例。若重建结果不理想，可通过打开重建摘要文件，在SoftWoRx日志文件中检查图像重建参数。在特定通道中，不同角度下的条纹间距应保持一致，且振幅应相对稳定。若变化超过30%，或数值显著高于1（若已应用了微珠尺寸补偿），则需进一步排查，此类情况很可能表明重建失败。此外，Fiji中的SIMcheck2软件也可用于对原始数据和重建数据执行多种检查，以诊断成像或重建参数设置中的错误原因。SIM-check及其调制对比度图还可通过判断图像中哪些区域更可能是真实结构而非伪影，辅助评估重建数据的质量。
细胞核区域内较低的调制对比度（如图5E中深色所示）意味着该区域更容易出现重建伪影，因此核内出现的网格状图案（图5D）可被归类为伪影。强荧光信号区域在处理后的数据中更有可能准确反映原始结构。在荧光团分布较广、信号较弱的区域（例如囊泡的整个表面），真实信号可能与处理伪影共存，因此在解读此类数据时应格外谨慎。在检查全范围重建数据以确认不存在异常伪影，并确保背景信号总体呈高斯分布且中心接近零值后，通常将数据在零处进行截断，或使背景信号的众数值（即峰值）非常接近零。这可确保显示图像的动态范围不会被负值背景伪影所主导。当预期信号较弱时，应更加仔细地分析特征，以确认其为真实结构而非重建伪影。
成像系统存在一些局限性。由于样品台是平面的，因此厚度不均或非平面的网格样品并不适合成像。此外，如果将使用软X射线断层扫描进行关联成像，则不应成像靠近网格边界的细胞，因为在倾斜系列采集过程中，这些细胞在X射线显微镜下不可见。最后，样品在浸入冷冻前的 blotting 程度对成像质量有显著影响；blotting 不足会导致样品过厚，从而产生背景噪声较高的次优SIM图像，而 blotting 过度则可能导致细胞变形，因而更容易受到入射激光束的热损伤。总之，冷冻SIM是一种强大的荧光显微镜工具，可用于在接近天然状态下对生物样品进行三维成像，并在多个领域具有广泛的应用前景。

在过去十年中，超分辨率（SR）成像技术已广泛应用于生物学领域1。这些技术能够对荧光标记的样品进行超越衍射极限的高分辨率成像。然而，将超分辨率显微技术应用于低温样品一直存在挑战2。若能实现，将有利于与电子断层扫描或X射线断层扫描结合进行关联成像。最近，结构光照明显微技术（SIM）已被成功改造用于低温样品，并已在Diamond光源同步辐射装置的关联低温成像光束线B24上，与软X射线断层扫描（SXT）结合，实现了对生物细胞的关联研究（https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Biological-Cryo-Imaging/B24.html）3。SIM通过在三个角度和五个相位上使用条纹状光模式（莫尔条纹）照射样品，可将传统宽场显微镜的分辨率提高一倍。这些光模式与样品荧光之间的干涉可用于计算解析出有关亚衍射结构的额外信息4,5。
与其它超分辨（SR）技术相比，SIM 在低温应用中具有多项优势。首先，它无需专门设计的闪烁荧光染料，可使用常规荧光染料，从而可选择更广泛的荧光标记试剂6。此外，该方法每个 z 层仅需采集 15 幅图像（三维成像）或 9 幅图像（二维成像），而其他超分辨方法每层通常需要约 1000 幅图像，显著增加了样品受热的风险，进而可能导致冰晶形成并产生伪影。最后，该技术能够对厚度超过 10 µm 的生物样品进行成像，从而可在接近天然状态下观察完整细胞6。低温 SIM 系统采用标准光学元件构建，并使用开放获取的成像软件，便于记录和复制6。该低温 SIM 显微镜配备了一个数值孔径为 0.9 的 100 倍物镜（见材料表）；其光学组件、设计参数及性能的更多详细信息已在 Phillips 等人的研究中描述6。本文方案将演示如何使用低温 SIM 显微镜，包括如何在低温载物台上装载和卸载样品、如何在显微镜上采集数据，以及如何重建 SIM 图像。

<table><tbody><tr><td>自动网格</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动网格</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>1036173</td><td></td></tr><tr><td>BioTracker 488 绿色微管细胞骨架染料</td><td>西格玛奥德里奇</td><td>SCT142</td><td></td></tr><tr><td>Cockpit 软件</td><td>牛津大学</td><td></td><td>https://github.com/MicronOxford/cockpit</td></tr><tr><td>冷冻兼容聚氨酯容器</td><td>Jena bioscience</td><td>CC-FD-800</td><td></td></tr><tr><td>冷冻透射电镜网格储存盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>型号#AutoGrid</td><td></td></tr><tr><td>冷冻-SIM 显微镜</td><td>定制设备</td><td>N/A</td><td>定制设备，设计参考如下文献：&amp;nbsp; Michael A. Phillips, Maria Harkiolaki, David Miguel Susano Pinto, Richard M. Parton, Ana Palanca, Manuel Garcia-Moreno, Ilias Kounatidis, John W. Sedat, David I. Stuart, Alfredo Castello, Martin J. Booth, Ilan Davis, and Ian M. Dobbie, &quot;CryoSIM: 超分辨率三维结构光照明显微技术用于关联超微结构成像&quot;，Optica 7, 802–812 (2020)。配备尼康 TU Plan Apo 100x/0.9 NA 物镜。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>冷冻载台系统</td><td>Linkam Scientific Instruments</td><td>CMS196</td><td></td></tr><tr><td>精细尖端手术镊</td><td>Ted Pella</td><td>38125</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker Deep Red FM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>Python 显微镜软件</td><td>牛津大学</td><td></td><td>https://www.python-microscope.org/</td></tr><tr><td>科学用干纸巾</td><td>Kimberly-Clark 7551</td><td>2</td><td></td></tr><tr><td>SIM 重建软件</td><td>softWoRx, GE Healthcare</td><td>版本&amp;nbsp; 6.5.2</td><td></td></tr><tr><td>StitchM 软件</td><td>Diamond Light Source</td><td></td><td>https://github.com/DiamondLightSource/StitchM</td></tr><tr><td>样品用透射电镜网格</td><td>Quantifoil Micro Tools</td><td>G200F1</td><td></td></tr></tbody></table>

冷冻保存细胞的冷冻结构光照显微镜数据采集

Cryo-Structured Illumination Microscopic Data Collection from Cryogenically Preserved Cells

三维结构光照明显微镜（3D-SIM）能够以高于传统荧光显微镜的分辨率对荧光标记的细胞结构进行成像。这种超分辨率（SR）技术可实现对完整细胞内分子过程的可视化，并有望与电子显微镜和X射线断层成像结合使用，以关联结构与功能信息。目前，用于低温保存样品的SIM显微镜（cryoSIM）已在英国同步辐射光源的关联低温成像光束线B24上完成部署并投入使用。
该技术专为在低温条件下对生物样品进行三维成像而设计，且与后续采用X射线显微技术（如冷冻软X射线断层成像）对同一样品进行成像的方法相兼容。本视频文章提供了使用冷冻SIM（cryoSIM）实现成功成像的详细方法与操作流程。除了包含冷冻SIM显微镜的操作说明外，还提供了关于样品选择、荧光染料以及参数设置方面的建议。本方案以U2OS细胞样品为例进行演示，其中线粒体和微管蛋白已通过荧光标记。

一个含有U2OS细胞的样品用绿色微管细胞骨架染料和红色线粒体染料的混合物进行染色，从而标记出细胞骨架中的微管成分（绿色）和线粒体（红色）。随后的成像显示了线粒体在细胞内的定位以及微管的排列，突出了微管为细胞提供的结构框架，以及细胞骨架在细胞核等细胞器周围的组装情况。冷冻SIM的分辨率明显高于标准落射荧光显微镜（图5）。图6展示了如何利用传统落射荧光显微镜获得的荧光“图谱”来定位待成像的兴趣区域，以及从载网上某一位置对应的冷冻SIM重建图像。
<img alt="冷冻成像工作流程图；阶段：制备、成像、后处理；显微镜设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：冷冻SIM成像流程的流程图。缩写：cryoSIM = 冷冻结构光照明显微镜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="用于光学研究和样品装载的带液氮杜瓦的CryoSIM显微镜装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：冷冻载台。（A）冷冻载台装置示意图。（B）由倒置镊子夹持的样品载网示意图。（C）冷冻载台的组件。连接端口已标注，对应颜色分别为：橙色：电源，黄色：加热载台盖，蓝色：外部杜瓦瓶，绿色：连接至PC。缩写：PC = 个人计算机；LN2 = 液氮。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于冷冻台显微镜的激光激发装置；检测与发射设置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：Cockpit 软件界面视图。（A）主界面，（B）宏扫描台 XY 界面，（C）拼图视图，（D）相机视图。缩写：SLM = 空间光调制器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="OMX 实验装置；Z 轴层扫、结构照明显微；显微镜控制界面及键盘操作。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：Cockpit 软件面板的视图。（A）单点 Z 轴层扫实验。（B）单点结构照明显微（SI）实验。（C）图像采集过程中使用的 Cockpit 软件键盘快捷键。（D）cryoSIM 显微镜安装于 Diamond Light Source 同步辐射光源 B24 光束线现场。缩写：cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微分析；图像通过电子显微镜和荧光显微镜显示细胞结构。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：冷冻结构光照明显微镜（cryoSIM）的分辨率。（A）正在检测的载网的拼接视图。（B）感兴趣区域（AOI）的明场图像。（C）伪宽场图像与其（D）SIM图像的对比，显示分辨率的提升。白色箭头指示SIM重建伪影。（E）调制对比度图，将重建图像的像素强度信息与SIMCheck2生成的原始数据中相应的调制对比度噪声比（MCNR）值的颜色信息相结合。明亮和暗淡区域分别表示高和低对比度。比例尺 = 10 µm。冷冻SIM成像参数：激发/发射波长：488/525 nm，50 mW激光功率，50 ms曝光时间；以及647/655 nm，20 mW激光功率，5 ms曝光时间。缩写：cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜示意图；细胞结构分析；网格设置；高分辨率成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62274/62274fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：从常规落射荧光显微图中网格某位置获取的荧光图，经冷冻结构光照明显微镜（cryoSIM）进行图像重建。（A,B）使用常规落射荧光显微镜获得的明场与荧光图像图谱的叠加图。该图谱用于定位感兴趣区域，以便后续在冷冻结构光照明显微镜（cryoSIM）中成像。（C）在（B）所示位置获得的重建冷冻结构光照明显微图像。缩写：cryoSIM = Cryo-structured illumination microscopy。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62274/62274fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验方案展示了如何利用冷冻结构光照明显微镜对生物冷冻保存样品进行成像。我们通过成像U2OS细胞的细胞骨架来演示该方法。

三维（3D）结构光照明显微镜（SIM）能够以高于传统光学显微镜的分辨率对荧光标记的细胞结构进行成像，从而……

该方法可实现对完整生物细胞的超分辨率冷冻成像，从而精确定位细胞结构。它还可与其他成像模式联用，作为相关成像工作流程的一部分。该技术的主要优势在于，可在低温条件下利用常规荧光染料和相对较低的光照剂量快速完成超分辨率成像。CyroSIM 是一种强大的工具，有助于深入理解细胞超微结构在内部或外部信号刺激下的动态变化。其应用包括疫苗的生产与推广、质量控制、上市后监测、抗体工程与优化，以及纳米颗粒的表征。在冷冻载台上操作样品需要一定练习，以确保载网的安全。在开始数据采集之前，最好先熟悉 Cockpit 窗口中的各项控制功能。首先，取下冷冻载台外部杜瓦瓶的盖子，倒入过滤过的液氮，直至液位约为容器的四分之一。待初始剧烈沸腾停止后，再继续添加液氮，将容器填充至约三分之二满。小心盖上盖子，将喷嘴朝向远离操作者的方向，以便液氮顺利排出。当液氮不再从出口流出后，将出口管置于冷冻载台的杜瓦瓶上。插入电源，连接 USB 线缆，并将外部杜瓦瓶连接至载台。注入液氮后，按下冷冻台上的释放按钮，使其进入样品室，并等待30至45分钟，待系统冷却并稳定后再开始图像采集。使用卡带工具上的六角扳手打开样品转移卡带的两个夹板。将夹板张开至足以使载网落入两板之间的程度，但不要完全张开至最大位置。使用长镊子将样品载网盒从液氮中取出。旋转载网盒，使其缺口与样品台内的存储位置对齐，然后将其放置在样品台上。使用适当的装置将存储盒盖打开至正确的样品位置。使用倒置的镊子将透射电镜载网从样品 holder 中取出，浸入液氮中，确保碳膜面朝向最终将面对样品台桥架上的物镜方向，并将其放入样品转移盒中的指定位置。使用盒体工具上的六角钥匙关闭样品盒。利用盒体工具上的磁性尖端提起并安装含有载网的样品盒至样品台桥架上。保持其浸没或靠近液氮，并确保方向正确。将包埋盒平放在桥架的定位针内，并轻轻推动以确保其固定。关闭并取出储存盒以及任何剩余的样品。将冷冻载台盖板开口移至成像位置，并关闭样品室照明。将载台向光学系统方向滑动，使其与物镜对齐，然后使用杠杆轻轻将物镜降至指定位置，确保物镜位于冷冻载台盖板内部但不与其接触。用不透光的黑色遮光帘覆盖载台和光学系统，随后在冷冻SIM计算机上启动控制软件Cockpit。点击每台相机的读出模式按钮，并将其设置为CONV3兆赫兹。检查每个相机的温度是否为 80 摄氏度，并确认相机风扇已关闭。打开反射相机，在透射光下选择环境光，连接 Linkam 装置，开启聚光镜，然后点击视频模式按钮。在 Mosaic 视图窗口中，缩小显示以查看网格轮廓。如果无法看到载物台，请点击“Find Stage”，然后在圆形中心位置双击鼠标左键以居中网格。使用上下键调节样品焦距，直至网格支撑膜或任何其他相关特征清晰对焦。使用数字键盘上的“9”和“3”键来改变Z轴步进值。当载物台居中后，关闭视频模式。在拼接视图中点击“运行拼接”（Run Mosaic），采集可见光图像的马赛克图，生成从中心向外螺旋排列的图像瓦片。点击“保存拼接图”（Save Mosaic）以保存该视图。通过关闭环境光、聚光镜以及视频模式，然后打开所需的激发激光器，并选择对应的相机和滤光片（初始设置为50毫瓦功率和50毫秒曝光时间），来检查明场马赛克图像与之前的任何荧光图谱图像。按下“零”键拍摄图像，按下“星”键进行自动对比度调节。或者，可通过图像底部的滑块手动调整对比度。找到具有合适荧光且生物学上有意义的细胞后，使用马赛克视图中的“标记位点”按钮标记其位置。在开始图像采集前，继续标记所有潜在位点。通过点击“将位点保存到文件”，将包含已标记位点的马赛克图像重新保存。使用 stitchEm 软件拼接马赛克图像时，将文本格式的马赛克文件拖放到扩展名为 BAT 的 stitchEm 文件中，并将合并后的马赛克图块的 TIF 图像保存在同一文件夹中。若要保存带有标记位点的图像，请同时将马赛克文本文件和标记点文本文件拖放到图标上。根据相机视图窗口底部荧光图像中的计数和动态范围设置激光曝光时间。选择要应用的滤光片，并针对每种激发光波长优化设置，依次单独打开各激光器。点击两台相机以将其开启。返回之前标记的位点之一，再次聚焦至目标深度。在XY窗口的宏观载物台上，当目标区域对焦清晰后，使用上箭头键移出焦点平面，以确定Z轴层扫的顶部高度，然后点击“保存顶部”。接着使用下箭头键向下移出焦点平面，点击“保存底部”，再点击“转至中心”，并确认图像仍处于对焦状态。在控制面板窗口中选择单点实验。从下拉列表中选择结构照明显微成像。调整堆栈高度，使其等于Z轴高度加上一微米。在上方一行中输入405纳米和488纳米激光器用于反射相机的曝光时间（单位为毫秒），在下方一行中输入561纳米和647纳米激光器用于透射相机的曝光时间（单位为毫秒）。输入文件名，然后点击“更新”以生成一个包含日期和时间的新文件，避免覆盖之前的文件，接着点击“开始”。如果在图像采集过程中液氮杜瓦瓶正在为冷冻载台补液，请点击 Cockpit 软件中的“中止”按钮以终止该过程。在每个位置，通过关闭激光器并打开环境光和聚光镜，使用可见光采集Z轴序列图像。在单点实验下，选择Z层扫描，并将环境光设置为20毫秒曝光，同时保持Z轴高度。对所有标记位点重复此操作。成像完成后，退出载物台并移除所有样品。关闭样品室光源。拔下外部杜瓦瓶，并将剩余的液氮倒入另一个兼容低温的容器中，使杜瓦瓶安全恢复至常温。等待直至样品台杜瓦瓶中不再有液氮后，烘烤冷冻台的选项显示可用。按下烘烤按钮以进入加热模式。将盖子塞入冷冻载台。冷冻SIM的分辨率明显高于标准落射荧光显微镜。利用传统落射荧光显微镜获得的荧光图谱可用于定位成像感兴趣区域，并可从载网上的相应位置获取对应的冷冻SIM图像。一个含有U2OS细胞的样品用绿色微管细胞骨架染料和红色线粒体染料混合物染色，从而标记了细胞骨架中的微管组分和线粒体。后续成像显示了线粒体在细胞内的定位，以及微管的排列情况，突出了微管为细胞提供的结构框架及其围绕细胞器组装的细胞骨架结构。SIM 重建过程可能产生伪影，可使用免费的 ImageJ 插件 SIMCheck 来识别这些伪影。通过 SIMCheck 生成的调制对比度图显示细胞核区域内存在调制对比度较低的区域，表明该区域更容易出现重建伪影。白色箭头指示一处重建伪影。在执行该方案时，应始终确保样品保持浸没在液氮中或接近液氮温度，以避免脱玻璃化。同时需注意动态范围内的曝光时间和计数，因为这会影响数据质量，并防止激光对样品造成损伤。在完成冷冻成像后，同一样品可进一步采用其他成像模式进行观察，例如我们B24光束线提供的冷冻软X射线断层成像。通过将冷冻SIM图像与包含细胞结构信息的图像相结合，我们可以进一步回答有关细胞超微结构和功能的关键问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

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