三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像

在细胞和亚细胞分辨率下对三维体外模型进行表征对于充分开发利用至关重要，但可能具有挑战性。因此，我们提供了配套的实验方案，用于对固定后的三维体外模型（尺寸范围从100微米至数毫米）进行染色及亚细胞分辨率成像。这些三维结构呈辐射状，操作时应格外小心。

移液前，请检查3D结构在离心管中的位置，以避免吸到结构。由于我们采用了经典的包埋技术来处理类器官或球状体等小型结构，可视化操作指南可帮助初次使用者更轻松地完成操作。接下来将与我一同演示该操作的是病理学研究平台的实验室技术员 Laura Francols。

为进行3D整体染色样品的制备，使用预先加入BSA的一毫升移液器吸头，将一毫升3D结构悬液加入含有500微升PBS的500微升离心管中。待3D结构沉降至管底后，小心移除PBS，并加入500微升通透封闭液，在室温下以每分钟30至50转的轻柔水平振荡孵育一小时。孵育结束后，让3D结构再次自然沉降，随后用一毫升含0.1% BSA的PBS小心洗涤两次，每次洗涤三分钟。

最后一次洗涤后，在4°C条件下，用250微升PBS中的初级抗体对3D结构进行标记，轻轻水平振荡孵育2至3天。孵育结束后，每次加入1毫升含0.1% BSA的PBS，共进行五次3分钟洗涤和两次15分钟洗涤。最后一次洗涤后，在4°C避光条件下，用250微升PBS中的相应二抗对3D结构进行标记，轻轻水平振荡孵育24小时。

第二天，将3D结构置于含有适当浓度Hoechst 3342的250微升溶液中，在4°C条件下避光孵育2小时，并轻轻水平振荡。孵育结束后，用1毫升PBS对3D结构进行洗涤，前五次每次3分钟，后两次每次15分钟，操作如图所示。最后一次洗涤完成后，将3D结构转移至96孔黑色聚苯乙烯微孔板中，轻轻加入200微升透明溶液覆盖结构，避免产生气泡。

然后将用铝箔覆盖的培养板置于 4 摄氏度环境中，至少放置 48 小时。若要包埋较大的三维细胞培养模型，请使用经牛血清白蛋白（BSA）包被的 1 毫升移液器吸头，小心地将三维结构转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）衬里瓶盖的平底玻璃管中。待结构沉降后，小心地将磷酸盐缓冲液（PBS）替换为 70% 乙醇，在室温下孵育 30 分钟。

孵育结束后，将70%乙醇替换为1毫升即用型伊红Y溶液。轻弹管壁，使结构至少染色30分钟。孵育结束后，用1毫升100%乙醇进行三次连续洗涤，每次30分钟，以脱水结构。

最后一次脱水后，在通风橱中用二甲苯进行三次连续洗涤，每次加入一毫升二甲苯，每次洗涤30分钟。最后一次浸入二甲苯后，将一块浸有二甲苯的活检垫放入白色Microtwin组织包埋盒的一个腔室中，使用经BSA包被的2毫升塑料巴斯德吸管将3D结构转移至垫上。再用另一块浸有二甲苯的活检垫覆盖3D结构，以固定其位置，然后关闭包埋盒。

所有样品转移完成后，将包埋盒置于65摄氏度的石蜡浴中30分钟，随后将包埋盒放入新鲜的65摄氏度石蜡浴中过夜。次日早晨，向每个样品对应的已预热至65摄氏度的包埋模具中加入液态石蜡，并将一个石蜡包埋的样品放入每个模具中。轻轻振荡模具，直至所有三维结构沉至底部，使用预热至65摄氏度的精细镊子将三维结构置于每个模具的中央位置。

将模具冷却至石蜡形成一层薄的固体层，以固定3D结构。放置一个组织包埋盒，并在模具上加入热石蜡。待石蜡完全凝固后，移除模具。

为了包埋小型三维细胞培养模型，需用一毫升 TBS 轻柔洗涤三维结构，共洗涤三次。最后一次洗涤后，在不接触结构的前提下尽可能吸除 TBS，然后加入商品化石蜡包埋试剂盒中的试剂二两滴。通过轻敲混匀，再滴加试剂一两滴并继续轻敲，直至凝胶固化。

使用精细镊子将凝胶从试剂盒中预组装胶盒的孔中取出，并在通风橱中按照所示步骤，依次用梯度乙醇和二甲苯孵育30分钟进行脱水处理。最后一次二甲苯浸润后，将胶盒置于65摄氏度的石蜡浴中过夜。随后，用精细镊子将石蜡包埋的样品转移至已加入液态石蜡并预热至65摄氏度的包埋模具中央。然后参照大型三维细胞培养模型的操作，再覆盖一层石蜡以固定三维结构。

三维整体染色与共聚焦显微镜技术可提供深度达200微米的三维培养模型中细胞组成及其空间位置的可视化信息。采用本方案可获得高分辨率的三维结构图像，从而适用于细胞及亚细胞水平的分割算法，用于定量分析细胞数量，并检测不同细胞亚型中的多种细胞标志物。无论整体结构如何，三维整体样本分析均可用于深度达200微米范围内的可视化细胞。

相反，二维切片分析可以提供关于任意大小细胞的信息。