Name: 三维类器官和球状体模型的染色和高分辨率成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学习三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像技术，掌握整体免疫标记和石蜡包埋方法。该方案支持100微米至数毫米样本的亚细胞水平分析，适用于发育生物学和疾病建模研究。

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本工作由 St Baldrick 基金会 Robert J. Arceci 创新奖 #604303 资助。

注意：在后续步骤中，进行试剂更换和洗涤时，预计会有不超过初始数量25%的三维结构损失。建议最终至少保留十个大小在100至 500 µm，每种测试条件下进行定性和定量图像分析。如有必要，对于较大的结构，可剪去1 mL移液器吸头的尖端，以避免损坏结构。所有步骤中，若3D结构沉降时间过长，可于50 × g 室温（RT）下5分钟。根据所研究问题的不同，应考虑该离心步骤的优缺点，因为离心可能破坏三维结构的形态。避免离心 &gt;100 × g.
1. 三维细胞培养模型的收集与固定
注意：吸取时需小心，避免吸出3D结构，这些结构仅松散地附着在管壁上。
<ol>
	<li>基质中三维细胞培养模型的收获 
	注意：本节描述了从小鼠Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤（BME）的基底膜提取物液滴中生长的3D结构的回收方法，但该方法可适用于其他基质。有关细胞外基质（ECM）的重要说明，请参见讨论部分。
	<ol>
		<li>从孔中移除培养基，注意不要破坏3D基质。用蛋白质预包被1 mL移液器吸头的内部和外部（称为 预包被1 mL吸头 此后将枪头全长浸入含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）中（称为 0.1% PBS-BSA 溶液 此后，将此溶液上下吹打两次。 
		注意：预先包被可防止细胞粘附于吸头，并尽量减少任何损失。</li>
		<li>用蛋白质预涂离心管（15 mL）内壁（称为 预包被离心管 此后通过反复用 0.1% PBS-BSA 溶液填充并排空管子完成。 
		注意：这可以防止细胞粘附到管壁上，并尽量减少任何损失。</li>
		<li>使用预包被的1 mL枪头，用1 mL预冷的1×PBS轻柔重悬孔中的3D结构，并将含有3D结构的悬液轻柔转移至预包被的离心管中。</li>
		<li>轻轻加入13 mL预冷的1×PBS，将3D结构置于冰上静置至少10 min，使其沉降。 
		注意：如有需要，在 50 × g 条件下离心 5 分钟 g 在 4 °C避免离心 &gt;100 × g，因为这会影响三维结构的形态。</li>
		<li>移去上清液。使用预包被的1 mL吸头，将3D结构轻轻重悬于1 mL预冷的1×PBS中。重复步骤1.1.4至1.1.5，以获得均匀的沉淀，确保无任何3D基质残留。 
		注意：有效的基质去除效果受基质类型、三维结构的数量和大小影响，需针对不同的培养条件进行优化。对于在BME中生长的三维结构，从基质中回收通常需要45–60分钟。</li>
		<li>使用预包被的1 mL枪头，将含有3D结构的1 mL 1×PBS悬浮液转移至预包被的1.5 mL离心管中，并继续进行第1.3节操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收获悬浮的三维细胞培养模型
	<ol>
		<li>使用预包被的1 mL枪头，小心收集并转移3D结构至预包被的1.5 mL离心管中。让3D结构自然沉降，或在50 × g下离心5分钟。 g 室温下</li>
		<li>移去上清液。使用预包被的1 mL枪头，将3D结构重悬于1 mL 1×PBS中。继续进行1.3节操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三维细胞培养模型的固定
	<ol>
		<li>让3D结构沉淀。小心移除上清液；在通风橱中，使用预包被的1 mL吸头，将3D结构在1 mL福尔马林中轻轻重悬。 
		注意：福尔马林含有甲醛，具有危害性。操作该化学品时应在化学通风橱中进行，并佩戴橡胶手套和安全护目镜。</li>
		<li>将3D结构在室温下孵育30分钟。 
		注意：对于各种三维结构（大小、形状和来源各异）的免疫染色，需要使用甲醛进行30分钟的固定。然而，通常情况下，更长的固定时间（&gt;3 h）更有利于保护报告蛋白的荧光特性。</li>
		<li>让3D结构自然沉降，或在50 × g下离心5分钟 g 室温下。轻轻移除甲醛，加入1 mL 1×PBS。用1×PBS重复洗涤两次。将样品置于 4 °C，然后继续第2节或第3节。 
		注意：此处可暂停实验方案，细胞可维持在 4 °C 用于长期保存（&gt;1年）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 三维细胞培养模型的三维整体染色、成像与分析
注意：由于类器官松散地附着在管壁上，操作时应轻柔，因为后续所有试剂更换步骤均可能导致样本损失。开始前，确保已准备好染色所需的正确对照。阳性对照和阴性对照可以分别是已知目标蛋白过表达或缺失的细胞。为判断观察到的信号是否源于二抗的非特异性结合，应设置不加一抗的样本进行孵育。由于某些细胞往往表现出较高水平的自发荧光，需使用不含二抗的对照来判断观察到的荧光信号是否来自背景自发荧光。免疫标记与荧光报告基因的可视化可同时进行。
<ol>
	<li>3D 全组织染色
	<ol>
		<li>通过在 1x PBS 中添加 0.1%-1% 的非离子型表面活性剂（参见材料表）、1% 二甲基亚砜、1% BSA 和 1% 驴血清（或与二抗宿主动物相同来源的血清）来配制通透-封闭（PB）溶液。 
		注意：应根据靶标定位仔细优化非离子型表面活性剂的浓度：膜结构（0-0.5%）、胞质（0.5-1%）、细胞核（1%）。该溶液可在 4°C 下保存最多一个月。BSA 通常适用于封闭步骤，但如果背景噪音较高，应进行经验性测试，以获得特定抗体组合的最佳结果。</li>
		<li>使用预包被的 1 mL 吸头将类器官从 1.5 mL 离心管转移至 0.5 mL 管中。让类器官沉降后，轻轻移除 1x PBS，并加入 0.5 mL PB 溶液。在室温下以轻柔的水平振荡（30-50 rpm）孵育 1 小时。</li>
		<li>让类器官沉降，轻轻移除 PB 溶液，并用 1 mL PBS-BSA 0.1% 洗涤两次，每次 3 分钟。 
		注意：等待 3 分钟可使结构充分沉降至管底。</li>
		<li>轻轻移除 PBS-BSA 0.1%，加入 250 µL 用 PB:1x PBS (1:10) 溶液稀释至适当浓度的一抗。配制 10 mL PB:1x PBS (1:10) 溶液时，将 1 mL PB 溶液加入 9 mL 1x PBS 中稀释。在 4 °C 下以轻柔水平振荡（30-50 rpm）孵育 2-3 天。 
		注意：适当的抗体孵育时间对于确保抗体充分渗透至关重要，因为 3D 结构有时可能达到较大尺寸。</li>
		<li>让类器官沉降，轻轻移除一抗溶液。用 PBS-BSA 0.1% 洗涤 5 次，每次 3 分钟，随后再用 1 mL PBS-BSA 0.1% 洗涤 2 次，每次 15 分钟，均伴随轻柔水平振荡。</li>
		<li>加入 250 µL 用 PB:1x PBS (1:10) 溶液按 1:250 稀释的二抗，在 4°C 下以轻柔水平振荡（30-50 rpm）孵育 24 小时。此步骤需避光操作。</li>
		<li>加入 250 µL 用 PB:1x PBS (1:10) 溶液按 1:1000 稀释的 Hoechst 33342（20 µM 储存液），在 4 °C 下继续以轻柔水平振荡（30-50 rpm）孵育 2 小时。</li>
		<li>让类器官沉降，轻轻移除含二抗和 Hoechst 33342 的溶液。用 1 mL 1x PBS 洗涤 5 次，每次 3 分钟，随后再用 1 mL 1x PBS 洗涤 2 次，每次 15 分钟，均伴随轻柔水平振荡（30-50 rpm）。 
		注意：必须充分洗涤样品，以避免背景噪音或信号丢失。</li>
		<li>将样品保存在 PBS 中，于 4 °C 下直至成像。继续进行第 2.2 节操作。 
		注意：本方案可在此暂停，样品可在避光条件下于 4 °C 保存数月。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共聚焦成像样品准备
	<ol>
		<li>使用预包被的 1 mL 吸头，小心地将类器官转移至 96 孔黑色聚苯乙烯微孔板中，每孔含 50 µL 1x PBS。随后进行步骤 2.2.3 或第 2.3 节。 
		注意：此阶段样品可在避光条件下于 4 °C 保存数周。</li>
		<li>透明化 
		​注意：透明化步骤为可选，可用于免疫标记类器官或检测内源性荧光。透明化可能导致 3D 结构收缩，但除具有大腔室的单层球形类器官外，一般不会改变整体形态4。对于此类囊状类器官，应跳过透明化步骤，直接进行深层组织成像6。
		<ol>
			<li>通过磁力搅拌器混合至少过夜，配制含 50% v/v 甘油、11% v/v 蒸馏水和 45% w/v 果糖的 2.5 M 甘油-果糖透明化溶液，直至完全溶解且均匀。避光保存于 4 °C，最多可保存一个月。</li>
			<li>尽可能移除 1x PBS，避免触碰类器官。使用剪去末端的 1 mL 移液枪头加入 200 µL 透明化溶液，并轻柔重悬以防止气泡产生。在室温下孵育至少 12 小时，随后进入第 3 节。 
			注意：由于透明化溶液黏稠，小体积操作较为困难。为便于操作，请确保溶液处于室温，并缓慢移液。为实现最佳透明化效果，建议在成像前让样品在透明化溶液中沉降至少 24 小时。若成像时 3D 结构仍漂浮，可选择在室温下以 &lt;100 × g 离心 10 分钟，或延长沉降时间（一天至数天）。若避光并在 4 °C（数周）或 -20 °C（数月）保存，本方案可在成像前暂停于此步骤。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集与分析 
	​注意：需使用图像切片技术对 3D 结构进行成像。
	<ol>
		<li>使用共聚焦显微镜，并优先选择数值孔径（NA）较高的浸没式物镜而非空气物镜。根据 3D 结构的大小、图像重建（拼接）需求以及所用分析软件，选择合适的放大倍数物镜（10x、20x、40x）。</li>
		<li>选择采集模式时，应考虑所用物镜的焦深，以确定 Z 轴堆叠的步长，从而实现最佳的 3D 渲染效果。 
		注意：图像分析方法多种多样，需根据所使用的软件调整分析流程。例如，本分析方案基于高内涵分析软件建立（详见材料表和补充图 1），可提供关于对象分割、属性计算以及在 3D 重建对象内细胞群体筛选的数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 三维细胞培养模型的二维切片、染色、成像与分析
注意：三维细胞培养模型的大小各不相同。请根据具体情况选择第 3.1 或 3.2 节进行高效的石蜡包埋（图 2）。在每次洗涤和更换试剂前，应留出足够时间使三维结构充分沉降。吸取液体时需小心，避免将沉降至管底的类器官吸出。进行石蜡包埋时，请参考 图 2 的示意图进行操作。
<ol>
	<li>大尺寸（直径 ≥ 400 µm）三维细胞培养模型的石蜡包埋
	<ol>
		<li>包埋前一天，将两个装有石蜡（石蜡浴）的 150 mL 锥形瓶、每个样品对应的一个小型金属包埋模具以及精细镊子预热至 65 °C。</li>
		<li>使用预包被的 1 mL 吸头，小心地将类器官从 1× PBS 中转移至带有聚四氟乙烯衬垫瓶盖的平底玻璃管中。让类器官自然沉降，小心吸除 1× PBS，并加入 70% 乙醇。孵育至少 30 分钟。</li>
		<li>让类器官沉降，小心吸除 70% 乙醇。加入 1 mL 即用型伊红 Y 溶液，轻弹管壁混匀，染色至少 30 分钟。小心吸除伊红溶液，随后用 1 mL 100% 乙醇进行三次洗涤，每次约 30 分钟，以脱水。 
		注意：乙醇为易燃且易挥发的液体，可引起严重的眼部和呼吸道刺激。操作时应在通风橱中进行，并佩戴护目镜。</li>
		<li>小心吸除 100% 乙醇，在化学通风橱中用 1 mL 二甲苯进行三次洗涤，每次约 30 分钟，以清除类器官中的乙醇。 
		注意：二甲苯为有毒易燃液体，其蒸气可能引起刺激。操作时应在通风橱中进行，避免直接接触皮肤，并佩戴橡胶手套和护目镜。</li>
		<li>在化学通风橱中，准备一个白色微孔组织包埋盒，在盒的一个腔室内放入一块预先用二甲苯浸润的活检垫。使用预包被的 2 mL 塑料巴斯德移液管，小心地将三维结构转移至活检垫上。再覆盖一块浸有二甲苯的活检垫，以防止类器官移动，然后关闭包埋盒。</li>
		<li>若处理多个样品，可将包埋盒置于二甲苯浴中等待后续处理。待所有样品均装入包埋盒后，将包埋盒放入预热的石蜡浴中，在 65 °C 下处理 30 分钟，随后转移至新鲜的预热石蜡浴中过夜。</li>
		<li>石蜡浸润完成后，取一个预热的包埋模具，加入加热的石蜡。将含有三维结构的活检垫放入模具中，轻轻振荡，使所有类器官沉降至模具底部。使用预热的精细镊子，极其小心地将三维结构置于模具中央。继续进行第 3.3 节操作。 
		注意：操作镊子时需避免破坏三维结构；应推动而非夹捏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小尺寸（直径 ≤ 400 µm）三维细胞培养模型的石蜡包埋
	<ol>
		<li>包埋前一天，将两个装有石蜡（石蜡浴）的 150 mL 锥形瓶、每个样品对应的一个小型金属包埋模具以及精细镊子预热至 65 °C。</li>
		<li>小心吸除类器官悬液中的 1× PBS。用 1 mL 1× Tris-缓冲盐水（TBS）轻柔洗涤三次。尽可能吸除 1× TBS，但不得触碰类器官。 
		​注意：注意避免吸走样品。如有必要，可在室温下以 50 × g 离心 5 分钟。残留的磷酸盐会干扰后续步骤，尤其是影响凝胶聚合。因此，任何处理步骤中均不得使用 PBS 溶液。本步骤使用了一种商业试剂盒，包含包埋盒、试剂 #1（无色液体）和试剂 #2（有色液体），以简化石蜡包埋流程并防止微小片段丢失（见材料表）。请遵循试剂盒说明书操作。包埋盒已预先组装，背板纸和支撑板均已就位。</li>
		<li>向管中加入 2 滴试剂 #2，轻弹管壁混匀。再加入 2 滴试剂 #1，再次轻弹混匀，使凝胶固化。使用精细镊子将凝胶从管中取出，并置于包埋盒的孔腔中。</li>
		<li>在通风橱中，将包埋盒依次置于以下溶液中进行脱水处理（使用 150 mL 锥形瓶，每次更换新鲜乙醇或二甲苯）：70% 乙醇，30 分钟；96% 乙醇，30 分钟；100% 乙醇，三次洗涤，每次 30 分钟；二甲苯，三次洗涤，每次 30 分钟。</li>
		<li>将包埋盒置于预热的石蜡浴中，在 65 °C 下处理 30 分钟，随后转移至新鲜的预热石蜡浴中过夜。石蜡浸润完成后，取一个预热的包埋模具，加入加热的石蜡。打开包埋盒，用精细镊子小心取出凝胶，并将含有三维结构的凝胶置于包埋模具中央。继续进行第 3.3 节操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>石蜡包埋的共通步骤
	<ol>
		<li>轻柔地将模具转移至低温区域，使石蜡形成一层薄薄的固态层，以固定三维结构在适当位置。在模具上方放置一个组织包埋盒，并加入热石蜡覆盖该塑料包埋盒。待其完全凝固后，取走模具，继续进行第 3.4 节操作。 
		注意：石蜡块可在室温下长期保存数年。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="石蜡包埋流程比较：传统方法与凝胶法；包埋成功与失败示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：大尺寸与小尺寸体外三维细胞培养模型石蜡包埋流程概览。 
（A）标准石蜡包埋流程。固定和脱水后，使用伊红对三维结构进行染色，以利于其可视化观察（左上和左下）。使用2 mL巴斯德吸管将三维结构小心地放置在包埋盒中的活检垫（蓝色）上（中图）。石蜡浸透后，用镊子将三维结构轻轻放入液态石蜡中，并在活检垫内轻轻搅动。此步骤中小尺寸三维结构容易丢失，因其无法从垫片上释放（右下：包埋失败）。仅有大尺寸三维结构可成功包埋（右上：包埋成功）。箭头指示三维培养物。（B）标准石蜡包埋方案的替代方法。小尺寸三维结构固定后，使用商用试剂盒将其维持在凝胶中，以利于石蜡浸透后转移至包埋模具（右图：包埋成功）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>切片与染色
	<ol>
		<li>使用标准切片机切割 4 µm 厚的切片，并进行常规组织学和免疫组织化学操作。随后进入第 3.5 节步骤。 
		注意：为获得更好的切片附着效果，使用了特定载玻片（见材料表）。切片载玻片可在室温或 4 °C 下长期保存数年。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像采集与分析
	<ol>
		<li>使用数字切片扫描仪或正置显微镜进行成像，并利用可对整个三维结构切片进行单细胞水平形态学及多重表达数据快速数字化定量分析的平台进行数据分析（详见补充图 2）。 
		注意：本研究团队常规使用 20 倍物镜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multicellular+spheroids+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
<li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82(2019).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051(2019).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy%3A+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li>
<li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+embedding%2Fsectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287(2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细胞培养是揭示组织和器官发育、功能、再生与破坏以及疾病过程中所涉及的基本生物学机制不可或缺的工具。尽管传统的单层二维细胞培养占据主导地位，但近年来的研究已转向生成三维结构的培养方式，这些三维结构更能反映体内&#160;细胞的响应，这主要归因于额外的空间结构和细胞间相互作用，这些因素会影响基因表达和细胞行为，从而可能提供更具预测性的数据7。然而，仍存在诸多挑战，其中包括需要用户友好的染色和成像技术，以实现对复杂三维结构在细胞和亚细胞水平上的详细显微观察与评估。在此背景下，已提供一系列详细、可靠且互补的实验方案，用于对大小从100 µm到数毫米不等的体外固定三维细胞培养模型进行染色及细胞和亚细胞分辨率的成像。
本实验流程介绍了两种不同的策略，用于处理多种尺寸和类型的体外三维细胞培养模型。选择其中一种（三维整体分析）或另一种（二维切片分析）取决于所使用的模型及研究问题。通过共聚焦显微镜进行的三维整体分析能够实现对细胞的可视化观察，其观察深度可达200 µm，而与三维结构的整体尺寸无关；而二维切片分析则适用于任意尺寸的样本，但其可视化结果仍为二维。以下是一些故障排除和技术注意事项的建议。
在实验流程中丢失三维结构是最常见的缺点。三维结构可能粘附在移液枪头和离心管上，因此使用含0.1% BSA的PBS溶液预先包被枪头和离心管至关重要。此外，在更换试剂时应让三维结构充分沉降，并且所有移液操作都必须格外轻柔。如实验步骤中所述，在所有操作中，若三维结构沉降时间过长，可在室温下以50 × g 离心5分钟，使细胞轻柔沉淀。根据研究目的，应权衡此类离心步骤的利弊，因为离心可能破坏三维结构的形态。此外，在固定步骤中也需特别注意保持该形态，因为囊状类器官容易塌陷。固定尺寸小于400 µm的结构有助于防止结构改变。
为了获得最佳的免疫标记效果，将类器官从其三维基质中回收是一个关键步骤。三维基质可能阻碍抗体的充分渗透，或因与基质发生非特异性结合而导致背景染色增强。去除细胞外基质（ECM）可能会改变类器官外段的形态（特别是当存在从小型三维结构延伸出的细小细胞突起时），并部分影响分析结果。对于此类三维结构，可在整个实验过程中保留基质；然而，应仔细优化培养条件，使细胞在尽可能少的基质中生长，以防止溶液和抗体渗透不足，并避免为降低过高背景噪音而进行的多次洗涤步骤6,8。
本方案中3D整体染色部分所述的光学透明化步骤，可使成像深度达到150–200 µm，相比之下未透明化样品的成像深度仅为50–80 µm。与其他常需数周时间并使用有毒透明化试剂的方法相比，本方案采用了一种先前发表的快速且安全的透明化步骤4,9。此外，该透明化步骤是可逆的，可在初始染色基础上添加新的抗体，而不会损失分辨率或荧光亮度4。然而，根据所研究的3D细胞培养模型不同，150–200 µm的成像深度可能不足以获得具有充分信息量的3D结构图像，且该透明化方案可能导致具有大腔室的球形单层类器官整体形态发生变化4。使用者应仔细设计实验方案，必要时优化通透/封闭步骤的时间（以促进抗体和溶液的渗透）、透明化步骤（若需对超过200 µm深度的样本成像，应确保完全透明化）以及图像采集条件。核心设施中最常用的两种成像技术为光片显微镜和共聚焦显微镜。使用者需根据其3D结构的大小及具体的生物学问题谨慎选择合适的技术10。然而，与共聚焦显微镜相比，光片显微镜在对这类深层结构成像时，其分辨率仍不足以实现亚细胞水平的清晰成像。
本文报道了一种针对单个样品包埋的详细且可靠的石蜡包埋流程。有趣的是，Gabriel 等人最近开发了一种高通量的三维细胞培养物石蜡包埋方案。他们使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具，将96个三维结构以微阵列形式限制在一个包埋块中，为包含更多分组、时间点、处理条件和重复次数的三维肿瘤模型研究提供了新视角11。然而，该方法需要较高的操作技能和设备支持，特别是用于制备PDMS模具的预成型模具的制造过程。
综上所述，本文介绍了两种不同但互补且可灵活调整的方法，可用于获取关于三维细胞模型结构和细胞组成方面的准确且定量的信息。这两个参数对于研究肿瘤内细胞异质性及其在治疗耐药性中的作用等生物学过程至关重要。

数十年来，干细胞生物学和体外三维培养技术的进步预示着生物学和医学领域的革命。三维条件下更高复杂性的细胞模型日益流行，因为它们允许细胞在周围细胞外基质环境中生长并相互作用，能够更真实地模拟活体组织的多种特性，包括组织结构、细胞排列与相互作用，甚至扩散特性。因此，三维细胞培养模型可在体外为研究发育或病变组织中细胞的行为提供独特的见解。类器官和球状体均为多细胞三维结构，尺寸范围从数微米至数毫米，是目前最主要的体外三维结构。两者均可在支撑性支架中培养，支架包括：（i）来源于动物（基底膜提取物、胶原蛋白）、植物（海藻酸盐/琼脂糖）或化学合成的水凝胶，或（ii）含有促进细胞增殖与生长孔隙的惰性基质。
类器官和球状体也可以在无支架支持的情况下形成，依赖细胞自身聚集并自组装成细胞簇。该过程采用多种不同技术，例如使用非黏附性材料以抑制细胞贴壁、利用表面张力和重力作用（如悬滴法），或对培养容器进行持续的圆周旋转（如旋转培养法）。在所有这些情况下，这些技术均有助于促进细胞间以及细胞与基质间的相互作用，从而克服传统单层细胞培养的局限性1。过去，“类器官”和“球状体”这两个术语常被混用，但这两类三维细胞培养模型之间存在关键差异。类器官是指来源于多能干细胞或组织特异性干细胞的体外三维细胞聚集体，其中细胞可自发地自组织形成前体细胞和分化细胞类型，并至少部分模拟目标器官的功能2。而球状体则涵盖更广泛的多细胞三维结构，是在非黏附条件下形成，可来源于多种类型的细胞，如永生化细胞系或原代细胞3。因此，由于类器官固有的干细胞来源特性，其在自组装能力、存活率和稳定性方面均高于球状体。
然而，从本质上讲，这两种模型都是由多种细胞组成的三维结构，因此用于研究它们的技术也非常相似。例如，需要具备单细胞分辨率的强有力成像方法，以探究类器官和球状体的细胞复杂性。本文通过总结本研究团队以及类器官领域领军专家的经验4，详细描述了对大小从100 µm到数毫米不等的类器官和球状体进行二维（2D）和三维（3D）整体染色、成像以及细胞与亚细胞组成和空间结构分析的具体操作流程。该方法提供了两种不同且互补的染色与成像采集方式，可用于分析多种尺寸和类型的体外三维细胞培养模型。采用其中哪一种方法（3D整体成像分析或2D切片分析）取决于所研究的模型及拟解决的科学问题。例如，利用共聚焦显微镜进行3D整体分析可对深度达200 µm的三维培养物中的细胞进行可视化观察，而无需考虑三维结构的整体尺寸；而2D切片分析则适用于任意尺寸的样本，但仅提供二维层面的信息。该方法已成功应用于多种来源于人和小鼠细胞、起源于不同胚层的类器官4,5和球状体。本操作流程的总体概览见图1，图中展示了主要步骤、各步骤之间的关系、关键操作环节以及预期耗时。
<img alt="3D整体装片与2D切片染色示意图；免疫分析与成像的显微镜设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：实验流程示意图。 体外3D细胞培养模型收集并固定后，可选择进行3D整体装片染色（选项a）或包埋于石蜡中进行2D切片与染色（选项b）。在3D整体装片染色实验中，固定后的3D结构在固定步骤后进行免疫标记。可选的光学透明化步骤可用于减少成像过程中的光散射，从而提高光学显微镜的成像质量和成像深度。图像使用倒置共聚焦显微镜或共聚焦高内涵成像系统采集，并通过相应软件进行分析。对于石蜡包埋，3D结构可直接处理（选项b.1，适用于较大结构，≥400 µm）或包埋于凝胶中（选项b.2，适用于较小结构，≤400 µm），随后进行脱水和石蜡包埋。石蜡块切片后进行染色（组织学或免疫化学染色）。2D切片图像通过数字切片扫描仪或正置显微镜获取，并在图像分析平台上使用快速数字定量分析方法进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Path 蓝色活检垫</td><td>VWR</td><td>720-2254</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500</td><td>VWR</td><td>720-2233</td><td></td></tr><tr><td>微盒式双白</td><td>VWR</td><td>720-2183</td><td></td></tr><tr><td>化学通风橱</td><td>Erlab</td><td>FI82 5585-06</td><td></td></tr><tr><td>1000 微升滤芯吸头 &amp;micro;L</td><td>Star lab Tip-One</td><td>S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>金字塔创新</td><td>R35002-E</td><td></td></tr><tr><td>平底玻璃管，带聚四氟乙烯衬垫，2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11784259</td><td>优秀&amp;nbsp; 环境&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 样本，&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 药物和诊断试剂。聚四氟乙烯（PTFE）设计旨在实现最高的产品安全性。PTFE提供完全惰性的内密封和与样品或产品接触的表面。</td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>Ibedi</td><td>2018003</td><td></td></tr><tr><td>水平振荡</td><td>N-BIOTEK</td><td>NB-205</td><td></td></tr><tr><td>65℃预热的培养箱 &amp;deg;C</td><td>Memmert 培养箱</td><td>LAB129</td><td></td></tr><tr><td>15x15 不锈钢模具</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片 Matsunami TOMO-11/90</td><td>罗氏诊断</td><td>8082286001</td><td>这些载玻片用于提高切片的附着性</td></tr><tr><td>切片机</td><td>Microm 微技术 法国</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>全景扫描 II</td><td>3dhistech</td><td>2397612</td><td></td></tr><tr><td>石蜡包埋设备</td><td>Leica</td><td>EG1150C</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 塑料巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td></td></tr><tr><td>Q Path 瓶，150 mL，白色瓶盖 ×250</td><td>VWR</td><td>216-1308</td><td>对环境有益&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 样本，&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 药物和诊断试剂。聚丙烯（PP）具有刚性，&amp;nbsp; 固体，提供优异的&amp;nbsp; 应激&amp;nbsp; 裂纹&amp;nbsp; 和&amp;nbsp; 影响&amp;nbsp; 抗性并具有&amp;nbsp; 良好的油性和酒精阻隔性以及耐化学性。聚乙烯（PE）衬垫瓶盖抗应力开裂，且提供&amp;nbsp; 优秀&amp;nbsp; 密封&amp;nbsp; 特征。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>移液器套装&amp;nbsp; (p200, p1000)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td><td></td></tr><tr><td>OPERA PHENIX</td><td>PerkinElmer</td><td>HH14000000</td><td></td></tr><tr><td>SP5 倒置共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋盒</td><td>VWR</td><td>720-0228</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiomager 显微镜</td><td>Leica</td><td>SIP 60549</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>细胞块（试剂盒）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10066588</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57648266</td><td>警告：有毒且易燃。蒸气可能引起刺激。应在通风橱中操作。避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。</td></tr><tr><td>1% 伊红水溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 96%</td><td>VWR</td><td>83804.360</td><td>警告：可引起严重的眼部刺激。易燃液体和蒸气。可引起呼吸道刺激。应在通风橱中操作。佩戴护目镜。</td></tr><tr><td>乙醇 100%</td><td>VWR</td><td>20821.365</td><td>警告：引起严重眼刺激。易燃液体和蒸气。引起呼吸道刺激。应在通风橱中操作。佩戴防护护目镜。</td></tr><tr><td>4% 甲醛</td><td>Microm 微技术 法国</td><td>F/40877-36</td><td>警告：福尔马林含有甲醛，具有危害性。应在通风橱中操作，避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。</td></tr><tr><td>果糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>Gill苏木精II型</td><td>Microm Microtech France</td><td>F/CP813</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>警告：疑似导致遗传缺陷。&amp;nbsp; 避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>石蜡蜡 tek III</td><td>樱花</td><td>4511</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）1 ×</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Tris缓冲盐水（TBS）10X</td><td>Microm 微型科技 法国</td><td>F/00801</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td>注意：Triton X&amp;shy;100 具有危害性。避免与皮肤和眼睛接触。</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>警告：二甲苯具有毒性和易燃性。其蒸气可能引起刺激。应在通风橱中操作。避免与皮肤直接接触。佩戴橡胶手套和护目镜。</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>澄清溶液</td><td>甘油-果糖透明溶液为60%（体积/重量）甘油和2.5 M果糖。配制10 mL该溶液时，混合6 mL甘油与4.5 g果糖，再用dH2O定容至10 mL，磁力搅拌过夜。室温（RT：19 ℃）下折射率为1.4688。&amp;ndash;23 &amp;deg;C）。4℃保存 &amp;deg;在黑暗中4°C保存，最长可保存1个月。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1% PBS-BSA 溶液</td><td>配制0.1%（体积/重量）PBS-BSA 0.1%溶液，将500 mg BSA溶解于50 mL PBS-1X中（4 ℃保存）&amp;deg;C下保存最多2周）。将1 mL该溶液加入9 mL的1×PBS中稀释。此溶液可用于预包被枪头和离心管。&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>通透-封闭液（PB 溶液）</td><td>PBSDT 封闭液是在 1× PBS 的基础上添加 0.1% Tween-20 &amp;ndash; 1% Triton X-100（根据蛋白定位选择膜或核）、1% DMSO、1% BSA 和 1% 驴血清（或与二抗宿主动物一致的血清）。该溶液可在 4℃ 保存&amp;deg;最多可于 C 保存 1 个月。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PB：PBS-1X &amp;nbsp;(1:10) 溶液</td><td>PB：PBS-1X &amp;nbsp;(1:10) 溶液是指将 PB 溶液稀释 10 倍。配制 10 mL 该溶液时，取 1 mL PB 溶液加入 9 mL PBS-1X 中混匀。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halo 软件</td><td>Indicalabs</td><td>NM 87114</td><td></td></tr><tr><td>Harmony 软件</td><td>PerkinElmer</td><td>HH17000010</td><td></td></tr></tbody></table>

三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

体外三维（3D）细胞培养模型（如类器官和球状体）是多种应用的重要工具，包括发育与疾病建模、药物发现以及再生医学。为了充分挖掘这些模型的潜力，必须在细胞和亚细胞水平对其进行研究。然而，对这类体外三维细胞培养模型的表征在技术上具有挑战性，需要特定的专业知识以开展有效的分析。本文提供了详细、可靠且互补的实验方案，用于对大小从100 µm到数毫米的固定体外三维细胞培养模型进行染色及亚细胞分辨率成像。这些方案适用于多种在细胞来源、形态和培养条件上各不相同的类器官和球状体。从三维结构的收获到图像分析，整个流程可在4至5天内完成。简而言之，收集三维结构后进行固定，随后可选择通过石蜡包埋进行组织学/免疫组织化学染色，或直接进行免疫标记，并为共聚焦显微镜下的光学透明化和三维重建（成像深度达200 µm）做准备。

本方案概述了二维和三维全组织染色的关键步骤，以及三维细胞培养模型的成像与定量分析方法（图3 和 图4）。该方法适用于多种三维细胞培养模型——从不同物种或组织来源的类球体到类器官——并能够在细胞和亚细胞水平上获取有关结构、细胞排列及相互作用的准确且定量的信息（图3 和 图4）。各实验室可能需要根据自身需求优化二维组织学和免疫组织化学技术及抗体浓度。
两种方法均可提供有价值的生物学信息。三维整体染色结合共聚焦显微镜技术可提供有关细胞组成和空间位置的可视化信息，成像深度可达200 µm(图3B)。然而，对于较大的三维结构，二维切片更便于观察整个三维结构的切片中细胞的精细形态特征，因为在较大样本中，光散射会降低分辨率，使得原位观察变得困难。此外，这两种技术均可提供定量数据。实际上，所获得的分辨率足以应用细胞和亚细胞分割算法，用于量化细胞数量，并检测不同细胞亚型中多种细胞标志物的存在情况(图3F 和 图4)。总之，本文所述的成像技术具有可重复性、操作简便且互为补充，是研究细胞异质性的有力工具。
<img alt="高级别胶质瘤的荧光显微镜图像；Ki67、Olig2染色；细胞分割分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：3D整体成像及其3D与2D光学切片图像与分析的代表性结果。（A）培养一周的人源（h）高级别胶质瘤类球体的共聚焦图像，用Hoechst（蓝色）、Olig2（黄色）和Actin（红色）标记（20倍水镜）。所有采集图像的显微镜参数均首先通过阳性对照设定（上图），随后在完全相同的参数条件下拍摄阴性对照图像，以验证在无一抗情况下无荧光信号（下图）。（B）对培养一周的人源（h）高级别胶质瘤类球体进行Ki67染色后的正交3D整体成像（甘油-果糖透明化处理；20倍水镜，共聚焦显微镜）。（C）培养一周的人源（h）高级别胶质瘤类球体的共聚焦图像，用Hoechst（蓝色）、Olig2（黄色）和Phalloidin-488（绿色）标记（甘油-果糖透明化处理；20倍水镜）。（D）培养一周的人源（h）横纹肌肉瘤（上图）和小鼠（m）神经嵴细胞（下图）类球体的共聚焦图像，分别用Hoechst（蓝色）、Actin（红色）和Ki67（绿色）标记（甘油-果糖透明化处理；20倍干镜）。（E）培养一周的人源（h）高级别胶质瘤类球体的共聚焦图像，用Hoechst（蓝色）和Ki67（绿色）标记（甘油-果糖透明化处理；40倍水镜）（左上图）。利用高内涵分析软件对Hoechst通道进行细胞核分割，并识别绿色通道中Ki67阳性（+）的核区域（参见补充图1和材料表）（下图）。输出结果为每个分割出的3D结构中Ki67+核所占的百分比（右上图）。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="组织学分析，H&amp;E染色；Ki67定量；细胞大小分布；柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4二维光学切片成像与分析的代表性结果 (A，D) 通过数字切片扫描仪获得的三维细胞模型（人横纹肌肉瘤球体，培养一个月）的二维切片图像，并在快速数字定量分析平台上进行分析。A) H&amp;E染色并根据细胞大小进行检测。比例尺 = 500 µm. (B) 直方图显示细胞百分比 &lt; 100 µm2 和 &gt; 100 µm2 使用快速数字定量分析软件（左侧：Halo）或手动计数（右侧：MC）进行检测。（CKi67染色及根据细胞3,3'-二氨基联苯胺（DAB）信号强度进行细胞检测。阴性（蓝色），弱阳性（黄色），阳性（红色）。比例尺 = 500 µm. (D) 直方图显示 Ki67 阴性、弱阳性及阳性细胞的百分比。缩写：H&amp;E = 苏木精-伊红染色；MC = 人工计数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
补充图1：成像分析软件操作步骤概览。 分析基于模块化组件的组合。每个模块对应一项功能——分割、计算、关联、输出定义——并提供多种算法和可变选项，以适配正在成像的生物样本。该软件提供多种预设解决方案（RMS）分析流程，可直接使用或修改。集成的图像分析流程可被保存，应用于不同数据集，并在用户间共享。简而言之，分析流程包括依次进行的对象分割：类球体、细胞核，最后是Ki67信号区域（A488）。随后计算Ki67信号区域的平均荧光强度，以进一步区分阳性信号。最终，包含Ki67阳性信号区域的细胞核被判定为阳性并被选中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图2：定量分析软件操作步骤概览。步骤1：使用研究标签上传文件。文件将在图像操作部分打开。步骤2：打开注释标签，然后点击图层操作，使用工具栏中的圆形工具在结构周围创建新图层。对于非圆形结构，可改用钢笔工具。步骤3：可使用工具栏设计注释，并通过<img alt="瞬态吸收光谱, ΣFx=0, 光学分析图, 光谱设置, 激发测量" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1">工具可视化定量结果。步骤4：打开分析标签，选择最适合样本分析的条件（此处可能需要多次尝试）。步骤4.1：使用染色选择部分设置染色条件。若存在多种染色，可添加并重命名，同时可修改虚拟颜色。可指定定位检测方式——核染色或胞质染色。步骤4.2：使用细胞检测部分设置细胞检测参数。该部分对分析最为关键。核对比度阈值部分可用于检测所有细胞核。若存在多种细胞群体大小，需特别注意，软件可能将一个大细胞误识别为多个小细胞。核大小和核分割强度部分可用于量化细胞大小的群体范围。步骤5：说明如何运行样本分析。请按照图中所示步骤操作。注释图层部分将仅对该切片应用设置。可通过<img alt="瞬态吸收光谱, ΣFx=0, 光学分析图, 光谱设置, 激发测量" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1">工具可视化定量结果。重复步骤4.1–5，直至获得满意的定量结果。步骤6–6.1：这些步骤可帮助您使用该软件绘制图表。步骤7：通过软件获得的定量图表可被保存。步骤8：数据可被导出。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本文提供了详细、可靠且互补的实验方案，用于对厚度从100 µm到数毫米的固定三维细胞培养模型进行染色及亚细胞分辨率成像，从而实现对其形态、细胞类型组成及相互作用的可视化观察。

体外三维（3D）细胞培养模型，如类器官和球状体，在多种应用中具有重要价值，包括发育研究和……

在细胞和亚细胞分辨率下对三维体外模型进行表征对于充分开发利用至关重要，但可能具有挑战性。因此，我们提供了配套的实验方案，用于对固定后的三维体外模型（尺寸范围从100微米至数毫米）进行染色及亚细胞分辨率成像。这些三维结构呈辐射状，操作时应格外小心。移液前，请检查3D结构在离心管中的位置，以避免吸到结构。由于我们采用了经典的包埋技术来处理类器官或球状体等小型结构，可视化操作指南可帮助初次使用者更轻松地完成操作。接下来将与我一同演示该操作的是病理学研究平台的实验室技术员 Laura Francols。为进行3D整体染色样品的制备，使用预先加入BSA的一毫升移液器吸头，将一毫升3D结构悬液加入含有500微升PBS的500微升离心管中。待3D结构沉降至管底后，小心移除PBS，并加入500微升通透封闭液，在室温下以每分钟30至50转的轻柔水平振荡孵育一小时。孵育结束后，让3D结构再次自然沉降，随后用一毫升含0.1% BSA的PBS小心洗涤两次，每次洗涤三分钟。最后一次洗涤后，在4°C条件下，用250微升PBS中的初级抗体对3D结构进行标记，轻轻水平振荡孵育2至3天。孵育结束后，每次加入1毫升含0.1% BSA的PBS，共进行五次3分钟洗涤和两次15分钟洗涤。最后一次洗涤后，在4°C避光条件下，用250微升PBS中的相应二抗对3D结构进行标记，轻轻水平振荡孵育24小时。第二天，将3D结构置于含有适当浓度Hoechst 3342的250微升溶液中，在4°C条件下避光孵育2小时，并轻轻水平振荡。孵育结束后，用1毫升PBS对3D结构进行洗涤，前五次每次3分钟，后两次每次15分钟，操作如图所示。最后一次洗涤完成后，将3D结构转移至96孔黑色聚苯乙烯微孔板中，轻轻加入200微升透明溶液覆盖结构，避免产生气泡。然后将用铝箔覆盖的培养板置于 4 摄氏度环境中，至少放置 48 小时。若要包埋较大的三维细胞培养模型，请使用经牛血清白蛋白（BSA）包被的 1 毫升移液器吸头，小心地将三维结构转移至带有聚四氟乙烯（PTFE）衬里瓶盖的平底玻璃管中。待结构沉降后，小心地将磷酸盐缓冲液（PBS）替换为 70% 乙醇，在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，将70%乙醇替换为1毫升即用型伊红Y溶液。轻弹管壁，使结构至少染色30分钟。孵育结束后，用1毫升100%乙醇进行三次连续洗涤，每次30分钟，以脱水结构。最后一次脱水后，在通风橱中用二甲苯进行三次连续洗涤，每次加入一毫升二甲苯，每次洗涤30分钟。最后一次浸入二甲苯后，将一块浸有二甲苯的活检垫放入白色Microtwin组织包埋盒的一个腔室中，使用经BSA包被的2毫升塑料巴斯德吸管将3D结构转移至垫上。再用另一块浸有二甲苯的活检垫覆盖3D结构，以固定其位置，然后关闭包埋盒。所有样品转移完成后，将包埋盒置于65摄氏度的石蜡浴中30分钟，随后将包埋盒放入新鲜的65摄氏度石蜡浴中过夜。次日早晨，向每个样品对应的已预热至65摄氏度的包埋模具中加入液态石蜡，并将一个石蜡包埋的样品放入每个模具中。轻轻振荡模具，直至所有三维结构沉至底部，使用预热至65摄氏度的精细镊子将三维结构置于每个模具的中央位置。将模具冷却至石蜡形成一层薄的固体层，以固定3D结构。放置一个组织包埋盒，并在模具上加入热石蜡。待石蜡完全凝固后，移除模具。为了包埋小型三维细胞培养模型，需用一毫升 TBS 轻柔洗涤三维结构，共洗涤三次。最后一次洗涤后，在不接触结构的前提下尽可能吸除 TBS，然后加入商品化石蜡包埋试剂盒中的试剂二两滴。通过轻敲混匀，再滴加试剂一两滴并继续轻敲，直至凝胶固化。使用精细镊子将凝胶从试剂盒中预组装胶盒的孔中取出，并在通风橱中按照所示步骤，依次用梯度乙醇和二甲苯孵育30分钟进行脱水处理。最后一次二甲苯浸润后，将胶盒置于65摄氏度的石蜡浴中过夜。随后，用精细镊子将石蜡包埋的样品转移至已加入液态石蜡并预热至65摄氏度的包埋模具中央。然后参照大型三维细胞培养模型的操作，再覆盖一层石蜡以固定三维结构。三维整体染色与共聚焦显微镜技术可提供深度达200微米的三维培养模型中细胞组成及其空间位置的可视化信息。采用本方案可获得高分辨率的三维结构图像，从而适用于细胞及亚细胞水平的分割算法，用于定量分析细胞数量，并检测不同细胞亚型中的多种细胞标志物。无论整体结构如何，三维整体样本分析均可用于深度达200微米范围内的可视化细胞。相反，二维切片分析可以提供关于任意大小细胞的信息。

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Biology

生物学

三维类器官和球状体模型的染色和高分辨率成像

光学相干断层扫描（OCT）是一种三维成像技术，可用于监测和表征多细胞肿瘤球体的生长动力学。本研究展示了基于体素计数法对肿瘤球体进行精确的体积定量分析，并利用内源性光学衰减对比实现无需标记的球体内坏死组织检测。...

利用光学相干断层扫描对三维肿瘤球体进行长期形态学与生理学监测

本文介绍了一种用于指导人原代前列腺类器官操作的实验方案，并提出了用于评估表型的检测终点。内容包括类器官的接种、培养维持、从基质胶中回收、形态学定量分析、包埋与切片、石蜡包埋切片（FFPE）、整体染色以及商用检测试剂盒的应用。...

人原代前列腺类器官培养的处理与评估

利用此处所述的单细胞分辨率三维成像方案，可完整捕获类器官的整个三维结构、细胞组成及其与原始组织的表型相似性。该方案适用于来源、大小和形状各异的多种类器官。...

单细胞分辨率下完整类器官的三维成像

本文提供了一项详细的实验方案，用于描述一种 体外...

人鼻上皮类器官的培养与成像

本文介绍了一种新型培养基底的制备方案，该基底每平方毫米含有数百个微容器2，其中可培养类器官并利用高分辨率显微镜进行观察。还详细描述了细胞接种和免疫染色方案。...

一种用于类器官培养与三维成像的高通量平台

本研究描述了在多功能装置内，使类球体和类器官保持在水凝胶中完整状态的情况下，对其进行培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记以及在各种显微镜下观察的方法学。...

在水凝胶中完整培养、冻存、处理及成像类器官与球状体

本研究介绍了一种经济高效且简便的3D细胞结构制备方法，该方法采用基于印章的系统在琼脂糖模具中制备微孔。该系统可促进均一的类球体/类器官形成，从而增强细胞间相互作用。该方法降低了实验变异性，适用于药物筛选和组织工程等应用。...

利用新型印章装置从二维细胞培养生成三维球状体/类器官

该方案结合光学透明化与免疫标记技术，实现对整体视网膜类器官的全体积共聚焦成像。该方法可保持三维结构，从而实现对关键神经元通路的精细可视化，有助于深入研究视网膜成熟过程、空间组织特征，及其在疾病建模和个体化医学中的潜在应用。...

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

我们介绍了一种利用低相干全息层析技术对类器官进行高分辨率、无标记、三维成像的逐步操作方案。本方案详细说明了类器官培养制备、成像采集以及计算图像分析的全过程，可实现对活体类器官结构动态变化及药物反应的实时可视化观察。...

无标记、高分辨率三维成像结合低相干全息层析与机器学习分析肠道类器官

从Aplysia中获取神经元细胞培养物用于生长锥的高分辨率成像

学习三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像技术，掌握整体免疫标记和石蜡包埋方法。该方案支持100微米至数毫米样本的亚细胞水平分析，适用于发育生物学和疾病建模研究。

三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像

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