Name: 一种简单灵活的接种方法，用于准确评估拟南芥和其他植物的白粉病感染表型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 了解一种简单灵活的接种方法，用于准确评估拟南芥白粉病感染表型。该方案通过特制接种箱实现孢子均匀分布，提高植物病理学研究的可重复性和准确性。

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本研究工作得到了美国国家科学基金会（IOS-1901566）对 S. Xiao 的资助。作者感谢 F. Coker 和 C. Hooks 对植物生长设施的维护，以及 Jorge Zamora 在接种箱和接种室制作过程中提供的技术支持。

1. 制作带有可拆卸顶盖和网罩的标准接种箱
<ol>
	<li>从商店购买一卷50 µm尼龙膜网或48 µm不锈钢网（推荐使用）。请确保订购足够数量，以便裁剪成多个14英寸×26英寸的片材，用于更换磨损的网片。</li>
	<li>购买一块1/4英寸×2英尺×4英尺的中密度纤维板或胶合板，并将其切割成两块24-1/2英寸×10英寸和两块12英寸×10英寸的木板，用于制作接种箱。使用8个角夹固定四边。 
	注意：当面对箱体的宽面时，左侧的12英寸×10英寸侧板为永久固定，右侧的12英寸×10英寸侧板为可拆卸门，由四个磁性扣固定（图1A，B）。</li>
	<li>在左侧侧板的每个内角上方、距顶部和底部各1英寸处，安装四个2英寸角撑，并标记后钻孔。使用螺丝将左侧短边永久固定到两个长边（前后面板）上。两个长边之间的内侧距离应为12英寸，而非11-1/2英寸。</li>
	<li>保持角夹就位并对准右侧门的位置，在相应位置标记并钻孔以安装四个磁性扣，用于固定右侧可拆卸门。在门上安装一个旋钮。门的顶部卡在顶盖下方（图1A，B）。</li>
	<li>为制作带网的可拆卸顶盖，将长条方形木条切割为两组，分别为26英寸和12-3/4英寸。将这四段木条胶合并钉接，使其能够环绕箱体安装——框架的内径应略大于箱体的外径，因为筛网将被固定在此框架上。</li>
	<li>将筛网裁剪至略小于14英寸×26英寸。确保筛网不超出框架边缘，以避免产生锐利边缘。需协助将筛网在框架上拉紧。用夹具将网和框架固定（图1C），并使用合适钉书钉的钉枪将筛网牢固地固定在框架上。</li>
	<li>再切割两组较短的方形木条（21英寸和9英寸），并使用螺丝通过这四段较短的方形木条将筛网紧密夹紧在框架周围（图1C，D）。</li>
</ol>
2. 制作接种室
<ol>
	<li>从合适的商店购买透明亚克力板和五金件。在盒子前侧的亚克力板上切割出一个 7 in × 20 in 的开口窗，如图所示 图2C.</li>
	<li>使用8个角夹，按照图示将左侧、右侧、前侧（带窗口）和后侧亚克力板组装成一个箱体 图 2A确保培养室的内径尺寸与顶板的尺寸相同。 
	注意：右侧部分仅用于支撑，不会连接到前侧或后侧板上。它比其他板件特意短½英寸。该右侧部分将变为一个 &#34;吸取&#34; &#34;瓣&#34; 由直角固定件固定的门&#160;底部有铰链，顶部有两个磁性扣，如图所示 图2C，D.</li>
	<li>使用角撑板将面板固定在一起（图2B,C）。固定支架位置，用记号笔标记，冲中心孔，然后钻孔。 
	注意：钻有机玻璃与钻其他材料不同，切勿用力过猛，否则钻头对面的孔边缘可能会开裂。请使用铆钉或螺丝固定，但不要过度拧紧螺丝，否则有机玻璃可能随时间推移而开裂。</li>
	<li>将外壳翻转至背面，取下四个角上的夹具，将顶板就位。标记并钻孔。</li>
	<li>安装由¾英寸角撑制成的直角铰链，使用尼龙锁紧螺母作为铰链轴。不要拧紧，需留出间隙，以便门可在该铰链上旋转。</li>
	<li>标记、冲孔、钻孔，并使用 #6-32x3/4 螺钉安装两个磁性门吸&#34; 盘头螺钉。然后使用 #6-32x3/8 螺钉安装扣板&#34; 平头螺钉，参见 图 2C,D.</li>
</ol>
3. 在育苗盘中接种植物
<ol>
	<li>准备新鲜的白粉菌孢子作为接种物（例如， 拟南芥 白粉病 Golovinomyces cichoracearum UCSC1）。培养纯净 拟南芥 免疫缺陷 pad4-1 突变植株 11 在生长室中（22 °C，相对湿度65%，培养6-8周），接种一个或半板 pad4-1 植物以积累足够的新鲜白粉菌孢子（图3A).</li>
	<li>在标准的11英寸×21英寸×2.5英寸育苗盘中种植用于确定侵染表型的植株。 
	注意： 拟南芥 在短日照条件（8小时光照，16小时黑暗；22 °C）下生长6至8周的植物适用于白粉菌感染试验。</li>
	<li>当接种后8-10天（dpi）的感病植株上获得新鲜的白粉病孢子时，将一盘用于感染测试的植株移入接种室内的接种箱中图1B，2C).</li>
	<li>剪取15-20根重度感染的 拟南芥 叶片（或4-6个感病莲座叶，具体数量取决于叶片/莲座叶大小及接种程度），如有冷凝水，需将叶片晾干。</li>
	<li>用一只手使用长镊子夹取1-2片叶片或一个莲座状叶丛，并将叶片倒置。然后，将双手伸入接种室的开口中，缓慢地将叶片或莲座状叶丛移至接种箱内固定在网架上的位置，同时用剪刀轻轻敲击镊子的手柄，使叶片脱落图3B）。重复此步骤，直至使用完所有叶片或莲座叶。 
	注意：成熟的孢子会很容易从感病叶片的分生孢子梗上脱落。尽量使孢子均匀地散落在筛网上。</li>
	<li>使用一到两把精细的扇形搅拌刷，轻轻将孢子刷过筛网（图3C）。确保以不同方向对网筛的整个表面刷涂四次或以上，以使孢子最大程度地均匀分布在接种盒底部的植株上（图3D用刷子轻轻拍打筛网数次，以震落粘附在筛网上的孢子。</li>
	<li>让孢子沉降半分钟，然后将装有接种植株的育苗盘从接种箱中取出。用塑料罩盖住育苗盘，并将其置于生长室中（22 °C，65% 相对湿度）。可在接种后5天或8至12天进行病害表型分析。 12.</li>
</ol>
4. 使用较小的接种盒对植物进行接种
注意：当接种植物数量较少时，仍可使用标准接种箱。请确保将植物放置在箱体中央。在覆盖植物的网罩区域轻敲并刷下孢子，以保证所有植物均被接种，同时节约接种物。或者（更推荐的方法）可使用较小的接种箱（如下所述）。
<ol>
	<li>将纸板箱改装成接种箱。只需移除箱子的顶部和底部，必要时用胶带固定箱角以加固，并通过粘贴或订书钉在顶部安装适当大小的50 µm筛网（图&#160;4A，B）。</li>
	<li>将装有植物的托盘移入接种室，再将较小的接种箱盖在托盘上，以覆盖植物。</li>
	<li>按照上述方法抖落并刷取孢子。</li>
</ol>
5. 在培养皿中接种离体叶片
注意：在以下情况下，可使用离体叶片在 MS-琼脂平板上进行接种：(i) 新鲜的白粉菌孢子数量非常有限；和/或 (ii) 需在保持植株洁净的同时，评估病害表型和/或感染细胞中蛋白质的亚细胞定位。
<ol>
	<li>制作一个仅比培养皿稍大的微型接种箱。</li>
	<li>准备½强度的Murashige和Skoog（MS）培养基琼脂（1.5%）平板。如需减少霉菌污染，可加入噻苯咪唑（40 mg/L）。将平板置于4 °C冰箱中保存，待用。</li>
	<li>从每株待测植物的叶柄基部切取一至两片完全展开的叶片。将离体叶片的叶柄以约30°的角度插入琼脂培养基中。 
	注意：每个平板可容纳20–40片叶片，具体数量取决于叶片和所用平板的大小（图4C）。</li>
	<li>在接种箱内按照上述方法对叶片进行接种。将带盖的平板转移至生长培养箱中。</li>
	<li>切取一小段叶片，在特定时间点观察蛋白质的亚细胞定位。</li>
	<li>为评估侵染表型，于接种后第4或第5天将叶片转移至新的无菌MS琼脂平板上。在将叶片插入新鲜琼脂培养基前，需切除叶柄基部。于接种后第8或第9天评估病害表型。</li>
</ol>

<ol><li>Huckelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+bi+ology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li>
<li>Sakurai, H., Hirata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+the+relation+between+the+penetration+hypha+and+haustorium+of+barley+powdery+mildew+and+host+cell.+V.+Influence+of+water+spray+on+the+pathogen+and+host+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Phytopathology+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue.</a> Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).</li>
<li>Shomari, S. H., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Oidium+anacardii+on+cashew+%28Anacardium+occidentale%29+in+southern+Tanzania%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania.</a> Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).</li>
<li>Sitterly, W. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitterly%2C+WR+%22Powdery+Mildews%22">Powdery Mildews</a>. Spencer, D. M. , Academic Press. 369(1978).</li>
<li>Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+systemic+resistance+to+powdery+mildew+and+growth+increase+in+cucumber+by+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Agriculture+%26+Horticulture%22%5BJournal%5D)">Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates.</a> Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).</li>
<li>Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuum-operated+settling+tower+for+inoculation+of+powdery+mildew+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi.</a> Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).</li>
<li>Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+delivering+Blumeria+graminis+f.+sp+hordei+spores+for+laboratory+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments.</a> Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+mildew+resistance+in+Arabidopsis+thaliana+mediated+by+RPW8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8.</a> Science. 291 (5501), 118-120 (2001).</li>
<li>Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+three+loci+controlling+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+accession+Ms-0+to+two+powdery+mildew+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases.</a> The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).</li>
<li>Reuber, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+defense+gene+induction+defects+with+powdery+mildew+susceptibility+in+Arabidopsis+enhanced+disease+susceptibility+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants.</a> The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+resistance+gene%2C+RPW8%2C+recruits+components+of+basal+defence+for+powdery+mildew+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们的网格盒接种方法相较于其他接种方法具有多项优势。首先，若操作得当，可实现孢子的均匀分布，如图5所示。其次，采用约50 µm的筛网，并通过轻轻摇动感病叶片使孢子脱落，可减少来源于供体植株的蓟马或其他植物病原昆虫对植株的侵染。第三，使用不同尺寸的接种盒在塑料接种室中对植株或离体叶片进行接种（两者均可通过喷洒75%乙醇轻松清洁），可更有效地利用接种物并减少交叉污染。我们发现，在整个接种过程中，几乎没有或仅有极少量真菌孢子从接种室中逸出。
高质量的接种箱是确保均匀接种的关键。我们发现，标准接种箱可用于拟南芥幼苗和成株（图1）、草莓幼苗、苦苣菜以及N. benthamiana（未展示）的接种。若植株高度超过5英寸，可进一步增加接种箱的高度，以确保网罩与下方植株之间有足够的距离（&gt; 5 in），从而实现孢子的均匀分布。此外，塑料室的高度也可相应增加，以便在接种箱顶部操作时有充足的空间进行孢子振落和刷涂。
<p class="jove_con...

白粉病是多种粮食作物和观赏植物中最常见且最重要的病害之一1。白粉病相关研究十分广泛，仅在Web of Science数据库中以“powdery mildew”为关键词进行检索，截至2020年11月就已有超过10,500篇相关出版物。事实上，根据《分子植物病理学》（Molecular Plant Pathology）期刊的评价，白粉菌（以Blumeria graminis为代表）被认为是十大重要真菌病原体之一2。在鉴定参与植物抗病或感病反应的基因，或功能鉴定白粉菌中候选效应子基因时，对病害敏感性进行定量分析是必不可少的步骤。然而，与其他大多数真菌病原体相比，白粉病的表型鉴定更为困难，部分原因在于，与后者不同，白粉菌物种的孢子（根据本实验室经验，如Golovinomyces cichoracearum UCSC1）在经过水悬浮处理后活力会下降3,4。若对测试植物接种特定白粉病原菌时接种量不足或分布不均，可能导致表型分析结果不准确。
已有多种接种方法被报道用于白粉病研究。这些方法包括：（i）将感病叶片上的孢子直接刷到待测植株上5；（ii）将孢子悬浮液喷洒至待测植株6；（iii）利用真空驱动的沉降塔将孢子吹至塔底植株上7；以及（iv）结合尼龙网膜和声波振动进行孢子递送8。孢子刷涂（或撒粉）法操作简便，但接种不均匀，因此可能不适用于定量评估。孢子喷雾法方便且分布均匀，但如上所述，可能导致孢子萌发率较低4。后两种方法（即iii–iv）在实现均匀接种方面有显著改进；然而，它们在单次接种所涉及的植株数量方面调整灵活性较差，设备制备较为复杂，且其使用受限于具备真空源和/或电源的实验室环境。
我们的实验室研究植物与白粉菌互作已超过20年9,10。在过去的十年中，我们测试了多种接种方法，并近期开发出一种简单而有效的白粉菌接种方法。这种基于筛网的孢子刷涂法可确保接种均匀，操作简便且可扩展，因此任何从事白粉菌研究的实验室都可轻松采用。

<table><tbody><tr><td>&amp;nbsp;48 &amp;micro;m 不锈钢格栅网筛；尺寸：24&quot; X 48&quot;&amp;nbsp;</td><td>亚马逊</td><td>NA</td><td>用于制作接种箱的盖子</td></tr><tr><td>#6-32 x &amp;frac34;&quot; 机械螺钉、平垫圈和螺母&amp;nbsp;</td><td>家得宝</td><td>NA</td><td>用于制作接种室</td></tr><tr><td>#6-32 镀锌尼龙锁紧螺母（4 件装）</td><td>家得宝</td><td>NA</td><td>用于制作接种室</td></tr><tr><td>#6-32x3/8&amp;rdquo; Phillips 平头机械螺钉、平垫圈和螺母&amp;nbsp;</td><td>家得宝</td><td>NA</td><td>用于固定&amp;nbsp; 磁性门扣板</td></tr><tr><td>#8-32x1/2&quot; 机械螺钉、平垫圈和螺母</td><td>家得宝</td><td>NA</td><td>用于固定角撑和门铰链</td></tr><tr><td>0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜保护板；&amp;nbsp; 大小：17 &amp;frac12;&quot; ×20&quot;</td><td>专业塑料</td><td>SACR.250CEF</td><td>用于制作接种室</td></tr><tr><td>0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜覆盖板材；尺寸：18&quot; ×20&quot;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>专业塑料</td><td>&amp;nbsp;SACR.250CEF</td><td>用于制作接种室</td></tr><tr><td>0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜遮蔽板；尺寸：18&quot; X 30&quot;&amp;nbsp;</td><td>Professional Plastics</td><td>SACR.250CEF</td><td>用于制作接种室</td></tr><tr><td>0.250 英寸厚透明挤出丙烯酸薄膜遮蔽板材；尺寸：20&quot; X 29 &amp;frac12; &quot;</td><td>专业塑料</td><td>SACR.250CEF</td><td>用于制作接种室</td></tr><tr><td>1-5/8&quot; 柜门磁性扣 白色</td><td>家得宝</td><td>型号 #P110-W</td><td>用于制作接种室</td></tr><tr><td>2&quot; 镀锌钢角撑（8 件装）&amp;nbsp;</td><td>家得宝</td><td>&amp;nbsp;型号 #13611&amp;nbsp;</td><td>用于制作接种箱 &amp;和 室</td></tr><tr><td>3&quot; 角夹</td><td>Harbor Freight Tools</td><td>货号 63653、1852、60589</td><td>用于制作接种室</td></tr><tr><td>3/4&quot;&amp;nbsp; 镀锌钢角撑（4 件装）</td><td>家得宝</td><td>型号 #13542</td><td>用于制作接种箱 &amp;和室</td></tr><tr><td>4-7/8&quot; 镀锌轻型门拉手</td><td>家得宝</td><td>型号 #15184</td><td>用于制作接种箱</td></tr><tr><td>细扇形搅拌刷</td><td>米歇尔商店</td><td>M10472846&amp;nbsp;</td><td>用于接种</td></tr><tr><td>Kelleher 3/4&quot; x 3/4&quot; x 36&quot; 木制方形棒材&amp;nbsp;</td><td>家得宝</td><td>NA</td><td>用于制作接种箱的盖子</td></tr><tr><td>中密度纤维板（1/4英寸）&quot; x 2' x 4'&amp;nbsp;</td><td>家得宝</td><td>型号 1508104</td><td>用于制作接种箱</td></tr><tr><td>圆形玻璃盖玻片，直径500 &amp;micro;m 网格</td><td>ibidi USA Inc.</td><td>10816</td><td>用于确定&amp;nbsp; 孢子密度</td></tr></tbody></table>

一种简便且灵活的接种方法，用于准确评估拟南芥及其他植物的白粉病侵染表型

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

减少由真菌病害引起的作物损失，需要深入理解调控植物免疫和真菌致病性的机制，而这又依赖于对植物感染特定真菌病原体后疾病表型的准确判定。然而，对于无法培养的专性活体营养型真菌病原体（如白粉菌），准确的病害表型鉴定难以实现，可能成为研究项目的限速步骤。本文以拟南芥—白粉菌互作为例，建立了一种安全、高效且易于操作的病害表型鉴定系统。该系统主要包括三个部分：（i）一个配有可拆卸盖子的木质接种箱，盖子上安装有孔径约50 µm的不锈钢或尼龙网，用于对一批植物进行真菌孢子接种；（ii）一个带有小型前开口的透明塑料接种室，可在内部进行接种操作的同时最大限度减少孢子逸出；（iii）一种用于均匀有效地分散和分布孢子的孢子脱落与分布方法。本文所述方案包括以低成本制作接种箱和塑料接种室的具体步骤与参数，以及一段视频演示，展示如何使用该系统实现白粉菌孢子的均匀接种，从而提高病害表型鉴定的准确性与可重复性。

本文介绍一种新型白粉病孢子接种方法，该方法易于制备、操作和调整。图1展示了标准接种箱的组装结构，重点说明了带有50 µm膜网的可拆卸盖子的构造。图2展示了接种室的组装方式。图3图示了使用该系统进行接种过程的关键步骤。图4展示了其他类型的接种箱，可用于接种整盘或少量植株，或接种在MS-琼脂培养基上的离体叶片。最后，图5提供了数据，以展示孢子分布或植株感染表型所反映的接种均匀性。
<img alt="生长箱组装示意图：五个标注面板展示了尺寸、网筛安装和磁性闭合装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62287/62287fig01.jpg" data-altupdatedat="...

我们介绍一种构建简单孢子分布系统的方案，该系统由一个带有约50 µm孔径筛网的接种箱和一个透明塑料培养室组成。该装置可用于将白粉病孢子均匀地接种到植物上，从而能够准确且可重复地评估所研究植物的病害表型。

减少作物因真菌病害导致的损失需要更深入地理解调控植物免疫和真菌致病性的机制，这在……

白粉病是一种重要的植物病害。准确判断其病害表型需要对病原体进行均匀接种。由于现有方法效率较低，我们开发了本实验方案。我们的孢子接种方法可轻松实现均匀接种，且操作简便、可扩展性强。因此，任何从事白粉菌研究的实验室均可轻松采用此方法。研究人员还可将网筛固定在纸板箱上，用于孢子接种。如何将孢子震落并刷过筛网是关键步骤，因此通过视频演示可能非常有帮助。对于本实验方案，需准备一卷50 µm尼龙膜筛网或48 µm不锈钢筛网。使用中等密度的胶合板，裁切出 24.5×10 英寸和 12×10 英寸的木板，用于制作接种箱。若要制作带网孔的可拆卸顶盖，将长条形木方裁成两组，长度分别为 26 英寸和 12.75 英寸，然后用胶水粘合并用钉子将四段木方固定在箱体四周。取亚克力板，使用八个角夹将所有亚克力板组装成一个盒子。在盒子亚克力板的前侧切割一个7×2英寸的开口窗。为制备新鲜的白粉菌孢子作为接种物，将洁净的拟南芥免疫缺陷型pad4-1突变体植株置于22°C、相对湿度65%的生长室中培养六至八周。在标准育苗盘中培育植株，以确定其感染表型。接种部分或全部 pad4-1 植株，以获得充足的活体白粉菌孢子。当获得来自感病植株的新鲜孢子后，将一盘植株移入接种室内的接种箱中，进行感染试验。剪下15至20片严重感染的拟南芥叶片，如果有冷凝水，需先让其干燥。用一对长镊子将一到两片叶片倒置夹住，并用一只手握住。然后将双手穿过接种室的开口，用剪刀轻轻敲击镊子的手柄，同时缓慢地在接种箱上安装的网筛上方移动叶片。使用精细的扇形混合刷，以不同方向将孢子刷过整个筛网表面，以最大限度地将孢子均匀分布在植株上。用刷子轻轻拍打筛网数次，使卡在筛网中的孢子脱落。待孢子沉降后，将接种后的植株连同育苗盘从接种箱中移出。用塑料罩盖住培养盘，并将其置于22摄氏度、相对湿度65%的生长室中。接种后5天或8至12天可进行病害表型分析。通过移除纸箱的顶部和底部，用胶带固定箱角以加固，并在顶部用胶水安装一个50微米的网筛，将纸箱改造成接种箱。将装有植物的托盘移入接种室，并将较小的接种盒放在托盘上以覆盖植物。然后震落并刷下孢子。制作一个略大于培养皿的微型接种盒。将平板置于4°C冰箱中保存至使用。对每株待测植物，从叶柄基部切取一至两片完全展开的叶片。将离体叶片的叶柄以30度角插入琼脂培养基中。在接种室内接种叶片，并将带盖的培养皿转移至生长室。为评估感染表型，于接种后四至五天将叶片转移至新鲜的无菌MS琼脂平板。在将叶片插入新鲜琼脂培养基前，剪去叶柄基部。在接种后第八或第九天评估疾病表型。显微分析显示，培养皿底部载玻片上的孢子分布均匀。在低剂量接种后，六个不同位置的孢子密度计算结果显示无显著差异。在使用孢子进行大量接种后，也获得了类似的结果。在大量接种后的第12天，检测了不同植物基因型之间的接种均匀性。与野生型植株哥伦比亚0（Columbia 0）相比，pad4-1植株表现出更强的疾病敏感性。使用接种后约10天在感病植株上产生的足量新鲜孢子非常重要，因为新鲜孢子更容易脱落，且更易建立定殖。白粉菌仅定殖于植物表皮细胞。通过剥离表皮或激光显微切割分离受白粉菌侵染的细胞，将有助于更精准地开展宿主响应的转录组学和蛋白质组学研究。该方法将帮助研究人员更高效地确定白粉病感染表型，从而促进对植物白粉病互作更有效的功能研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一种简单灵活的接种方法，用于准确评估拟南芥和其他植物的白粉病感染表型

来源：Lee, H. et. al., 利用分裂绿色荧光蛋白系统可视化细菌感染过程中递送的效应蛋白。J. Vis. Exp.

监测植物细胞中的细菌感染与效应蛋白递送

来源：Rufián, J. S., 等. 植物组织内 Pseudomonas syringae 基因表达的单细胞分析. J. Vis. Exp.

通过真空渗透法将细菌病原体接种至Arabidopsis叶片中

来源： 刘，X. 等细菌叶片浸润法用于精细表征植物防御反应 拟南芥-丁香假单胞菌 病理系统 视觉实验杂志. (2015).本视频演示了一种评估感染了Pseudomonas syringae的拟南芥（Arabidopsis...

评估 Pseudomonas syringae 感染负荷在 拟南芥 叶片

本文介绍了一种利用针头注射法将专性寄生真菌病原体Ustilago maydis接种于玉米和类蜀黍植物的方法。针头注射接种法可将真菌病原体精确地递送至植物叶片之间，病原菌在此处通过形成附着胞侵入植物体内。该方法效率高，能够实现U.

一种快速高效评估致病性的方法 Ustilago maydis 在玉米和大刍草品系上

病原菌生长的定量分析是表征多种Arabidopsis thaliana（以下简称：拟南芥）免疫反应的有力工具。本文所述方法提供了一种优化的注射浸润实验，用于定量测定丁香假单胞菌致病变种（Pseudomonas syringae pv. maculicola）ES4326...

利用细菌叶片浸润实验精细表征植物防御反应 拟南芥-丁香假单胞菌 病理系统

本文介绍了一种利用植物病原菌Magnaporthe...

植物感染试验：喷雾与伤口介导接种植物病原菌 Magnaporthe Grisea

我们报道了一种简单且通用的方法，可用于对拟南芥（Arabidopsis...

一种通用的封片方法 拟南芥 用于活体时间序列成像的叶片

本文介绍了两种在免疫诱导物处理后定量分析拟南芥（Arabidopsis...

模式触发的氧化爆发与幼苗生长抑制实验 拟南芥

本方案详细总结了将土传微生物接种至植物根部的策略。以长孢轮枝菌（Verticillium longisporum）和大丽轮枝菌（Verticillium...

接种策略以感染植物根部的土传微生物

本实验方案描述了一种方法，可用于对在植物质外体中生长的Pseudomonas...

单细胞表达分析 Pseudomonas syringae 植物组织中的基因

本文介绍了一种改进的拟南芥（Arabidopsis...

高分辨率单颗粒 体内 花粉水合生物测定法 拟南芥

了解一种简单灵活的接种方法，用于准确评估拟南芥白粉病感染表型。该方案通过特制接种箱实现孢子均匀分布，提高植物病理学研究的可重复性和准确性。

一种简便且灵活的接种方法，用于准确评估拟南芥及其他植物的白粉病侵染表型

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