Name: 急性小鼠胰腺组织切片钙动力学的共聚焦激光扫描显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学习使用共聚焦激光扫描显微镜对小鼠急性胰腺组织切片进行活细胞钙成像的方法。该技术保留天然组织结构，可同时研究大量内分泌和外分泌细胞的钙信号动态与细胞间通讯，有助于深入理解胰腺生理及相关疾病机制。

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本研究工作得到了斯洛文尼亚研究署（研究核心资助编号 P3-0396 和 I0-0029，以及研究项目编号 J3-9289、N3-0048 和 N3-0133）和奥地利科学基金 / 科学研究促进基金会（双边资助编号 I3562--B27 和 I4319--B30）的经费支持。我们感谢 Maruša Rošer、Maša Čater 和 Rudi Mlakar 提供出色的技术协助。

作者声明，本研究是在没有任何商业或财务利益的情况下进行的。

胰腺组织切片法是一种快速的实验方法，可在更保守的原位制备条件下研究胰腺内分泌部和外分泌部的形态学与生理学特性。许多优势已在引言部分指出。值得强调的是，通常情况下（不仅限于钙成像实验），采用组织切片方法研究胰腺生理学可节省时间，因为分离后无需恢复期。尽管并非所有类型的实验以及来自不同物种的胰岛分离都绝对需要这一恢复期，但通常采用该步骤以提高纯度、恢复活性与功能，有时还用于收集多个供体的胰岛59,60,61,62,63,64。然而，在钙成像研究中，已发现β细胞的反应依赖于培养时间和培养条件，这是使用分离胰岛时应考虑的重要变异来源15,65。如果将来组织切片的长期培养成为广泛应用的选择，则同样需要考虑这一问题22,36。组织切片法还具有高产量的优点，因此有可能减少动物使用数量，减轻动物痛苦，并提高统计效能。此外，由于可从单个动物制备多个切片，且切片可长期存活，因此将同一动物甚至同一个胰岛同时用于实验组和对照组成为可能。
由于胰腺组织切片保留了原有的结构和细胞间通讯，并且适用于多种结构分析、电生理、成像方法以及激素分泌检测，因此该方法特别适用于研究依赖于单个细胞之间未受干扰相互作用的胰腺功能，例如对促分泌剂的敏感性、不同类型细胞之间的旁分泌和免疫相互作用、电活动模式、钙动力学特性以及多种激素的分泌。对于钙成像而言，使用组织切片的主要优势在于能够暴露胰岛核心区域，并有可能以高分辨率同时获取多种不同类型细胞的信号。根据实验需求和动物年龄，可调整切片厚度，也可对切片进行转染处理，或使用表达遗传编码报告分子的转基因动物获取切片。如下文将详细说明，后两种方法还可实现对非β细胞的特异性功能识别及其反应特征的表征31,66。此外，还可针对器官中解剖位置明确区域的胰岛进行研究，以探索其在反应性或疾病易感性方面的差异。尽管组织切片无需恢复性孵育阶段，但可方便地将其与不同的药理学试剂、脂肪酸、高浓度葡萄糖以及细胞因子共同孵育。
最重要的是，由于能够实现高分辨率，并且可达到单细胞甚至亚细胞水平的分辨率，因此在胰岛切片中进行共聚焦钙成像成为分析钙波、功能连接性以及胰岛不同区域细胞各自功能作用的最合适方法之一54,67。尽管该方法具有诸多优势，但组织切片技术仍存在重要局限性。首先，该方法仍会部分破坏胰岛及外分泌组织的结构，尤其是在切割表面；制备过程中需采取预防措施，例如保持低温、频繁更换溶液以及轻柔快速的操作，以避免额外的机械性损伤和内源性酶解损伤。其次，营养物质和分泌刺激物的递送模式仍不及体内途径，且组织制备样本脱离了系统的神经支配，无法实现器官间的反馈调节（例如胰岛与其靶组织之间的相互作用），这与体内方法形成对比。第三，切片的最大厚度受限于氧气供应、营养物质递送和pH调节，通常约为200 µm9。此外，切片制备和成像均需要大量训练，而对长时间序列及大量细胞的钙信号数据进行深入分析则需要专门知识，这些知识通常不在经典生理学家的技术范畴内，往往需要物理学家或数据科学家的协助。虽然该方法保留了同型和异型细胞间的相互作用，但这也可能因感兴趣区域内存在其他细胞的信号而使样本分析变得复杂。根据具体实验方案，其他细胞的激活可能导致被观察细胞受到间接的额外刺激或抑制。
只有通过去卷积方法、更复杂的刺激方案（包括阻断某些间接效应的物质）、使用特异性基因敲除动物，以及与采用更简化方法的其他研究结果进行仔细比较，才能最终解决这一问题。此外，如果需要进行分泌测量，应注意某些切片可能缺乏胰岛，且单个切片中内分泌组织的总质量通常较低。用于成像的急性胰腺组织切片制备涉及多个关键步骤，这些步骤将在下文各节中讨论，并总结于表1中，读者也可在该表中找到简短但重要的故障排除提示。首先，在配制琼脂糖溶液时，必须确保琼脂糖粉末完全溶解，否则未溶解的颗粒可能堵塞注射过程。应将均匀的琼脂糖溶液保持在37–45 °C，一方面防止因温度过低导致琼脂糖凝固，另一方面避免因温度过高造成组织损伤。使用后剩余的琼脂糖可储存于4 °C并重新加热，但反复加热可能导致水分蒸发而使溶液密度增加，最终使注射变得困难甚至无法进行。
制备过程中的下一个关键步骤是正确夹闭十二指肠大乳头。十二指肠上的一个白色斑点提示胆总管与十二指肠的连接处。夹闭位置过于靠近近端会导致胆总管的一些侧胰管分支受阻，从而无法向这些区域注射；而夹闭位置过于靠近远端则会导致琼脂糖溶液经阻力较小的路径直接漏入十二指肠。在插管胆总管之前，可小心清除周围脂肪组织，以更清晰地暴露导管，并在注射过程中实现更好的控制。若在清除周围组织时操作不够精确，可能导致导管穿孔。用于琼脂糖注射的针头直径选择也十分重要。在小鼠中，优选使用30 G针头；更细的针头（32或33 G）由于琼脂糖溶液黏度较高，操作更为费力，且更容易发生堵塞。然而，若与低浓度琼脂糖溶液联合使用，这些细针头在体型较小的小鼠品系或幼龄动物中可能非常有用。在出生后的最初几天，可选择性地将琼脂糖注射至肾包膜下而非导管内2。在小鼠中使用直径过大的针头极有可能损伤胆总管。即使使用合适直径的针头也可能发生此类损伤，此时可用镊子在注射过程中固定针头位置。对于导管较大的动物（如大鼠），可能只能采用较大直径的针头。若针头过细，无法形成紧密封闭以防止反向渗漏，则可在成功插入导管后，在针头周围结扎固定。
由于琼脂糖溶液具有较高的黏度，注射时需要稍加用力；一旦开始注射过程，就不应中断，否则低熔点琼脂糖溶液可能在注射完成前就在针头或胆管树的主要部分中凝固，导致组织渗透不良，并在切片过程中提供较差的支撑。导管插管应始终在左肝管与胆囊管汇合形成胆总管的位置进行。如果胆总管发生穿孔，应尝试在更靠近十二指肠的位置反复进行插管。当胰腺组织被琼脂糖溶液充分固定并从腹腔中取出后，应切取注射良好的小块组织。在将组织包埋于琼脂糖之前，必须彻底清除所有脂肪和结缔组织，因为这些残留物会增加切片难度。血管和导管残余物同样需要去除，除非它们是实验的关注重点；在此情况下，应确保将其放置在合适的位置，以获得所需的横截面。将组织包埋于琼脂糖时，需确保温度适宜（37 °C），并且组织完全被琼脂糖包围，因为在振动切片过程中产生的作用力可能导致胰腺组织从琼脂糖块中撕脱。
在将组织块放入琼脂糖之前，可将其短暂地放在滤纸上以快速干燥，这有助于防止此步骤中组织与琼脂糖之间接触不良。在琼脂糖凝固过程中，应将培养皿保持水平放置，并避免胰腺组织与培养皿底部接触。如果胰腺未完全灌注，切片过程将会困难。因此，建议降低切片速度以获得组织切片。为了在振动切片过程中尽量减少细胞损伤，应定期更换切片室中的细胞外液（ECS）以及由ECS制成的冰块；后者可降低切片过程中腺泡组织释放的胰酶活性。切片厚度也至关重要。对于钙动力学和电生理实验，通常制备140 µm厚的切片；但根据研究目的，切片厚度可在90 µm至200 µm之间调整。需注意的是，较厚的切片中氧气和营养物质的扩散会受限，但其包含的组织更多。此外，随着切片厚度增加，未被切断的胰岛比例可能随之升高。切片可在室温下置于定期更换的ECS中保存数小时，甚至可在适当的细胞培养基中培养数天；然而，这可能最终影响胰岛细胞的正常生理功能3,22。
配制染料溶液时，应确保所有组分充分混匀，并避免暴露于环境光线下。胰腺切片由多层细胞构成，钙染料的摄取仅限于最表层的几层细胞，这与先前在分离胰岛中所描述的情况一致。58,68和垂体切片69然而，与孤立的胰岛不同，后者周围的包膜和外层细胞会阻碍染料向深层渗透，而组织切片则允许染料进入胰岛整个横截面，从而能够同时测量来自胰岛各层的数百个细胞的钙动力学。荧光Ca2+ 指示剂是测量钙动态最常用的工具，结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM），可实现高达数百赫兹的高时间分辨率记录。在选择最合适的荧光Ca2+ 指示剂，需考虑多种因素，包括指示剂形态，其会影响细胞加载方法、检测模式（定性或定量）以及解离常数（Kd) 需要位于 Ca2+ 感兴趣的浓度范围，并取决于 pH、温度和 Mg 的存在2+ 以及其他离子，以及蛋白质结合。由于细胞内 Ca2+ 信号通常是瞬时的，Ca2+ 结合速率常数也应予以考虑。用于测量[Ca2+]IC 胰腺细胞中的动力学研究，该研究团队主要使用本方案中所述的细胞通透性Ca2+指示剂染料（材料表）因为它是一种长波长指示剂，其发射波长位于细胞自发荧光通常较少干扰的光谱区域，且激发光能量较低，可减少对细胞的光损伤风险。由于该染料在低 Ca2+ 浓度，这有助于确定基线[Ca2+]IC 并提高细胞在刺激前的可见性。钙离子结合后2+，染料的荧光强度增加14倍，从而能够检测到[Ca2+]IC.
为了成功进行活细胞钙成像，需要考虑若干关键的硬件参数，具体如方案部分所述。在信号强度较低且光毒性风险较高的活细胞成像中，应优先选用数值孔径（NA）更高的物镜，以从样本中收集更多的光信号。若需以高时间分辨率记录钙动态变化，应使用共振扫描器而非线性检流计扫描器。除了选择合适的物镜外，使用高灵敏度探测器（例如所需激光功率更低的混合探测器）有助于避免光毒性和光漂白，这对于长时间的钙成像尤为重要。钙成像中的其他重要步骤还包括时间序列图像采集时的图像质量参数设置，其中最重要的是时间分辨率和空间分辨率。由于钙信号本身的动态特性决定了可接受的最低时间分辨率，因此采样频率应至少为预期信号频率的两倍才能检测到信号，甚至需达到十倍以上才能可靠地捕捉信号的波形特征。在急性胰腺组织切片中，可同时测量数百个细胞的钙动态变化，因此空间分辨率同样重要。提高像素数量或在实时采集过程中增加扫描线平均次数，均可提升空间分辨率。然而，由于空间分辨率与时间分辨率之间存在反比关系，因此需要在这两项设置之间进行权衡。
如果需要在胰腺内特定的细胞群体中进行钙成像，则必须使用一种能够功能上区分切片内不同细胞的刺激方法。高浓度葡萄糖可稳定且快速地激活β细胞，使其产生叠加在升高钙水平上的振荡模式，并且在胰岛内的所有细胞中高度同步32,58,70。β细胞是胰岛中最丰富的细胞类型，在小鼠中主要位于胰岛核心区域。相同的刺激方案会降低α细胞的簇状放电活动，有时甚至不会显著改变其放电模式30,32,58,70,71,72。为了在功能上区分α细胞，可使用低浓度（3 mM）葡萄糖、谷氨酸或肾上腺素来增加其放电频率或基础[Ca2+]IC水平21,72,73,74,75。α细胞约占胰岛细胞的10–20%，通常分布于胰岛外周1。δ细胞也位于胰岛外周，约占胰岛内分泌细胞总数的~5%，通常在6 mM葡萄糖条件下具有活性，并在葡萄糖刺激下表现出较基础水平或轻微升高的钙水平更为不规则的簇状放电活动增强1,32,71,76。在钙成像实验中，可使用胃饥饿素（ghrelin）特异性激活δ细胞21,77,78,79。然而，目前尚无明确的实验方案可用于PP细胞和ε细胞的功能性特异性鉴定。此外，25 nM乙酰胆碱可稳定激活腺泡细胞产生簇状放电活动35,80,81。另外，还可使用多种其他促分泌剂，如胆囊收缩素原（cerulein）、胆囊收缩素（cholecystokinin）和卡巴胆碱（carbamylcholine），以诱发腺泡细胞的钙反应22,40,82,83。
最后，1 mM 鹅脱氧胆酸可稳定地在组织切片的导管细胞中诱导出钙反应；血管紧张素II、ATP以及其他一些分泌刺激剂也可用于此目的11,23,84,85。当基于特定分泌刺激剂和抑制剂的特征性反应进行功能鉴定不足以明确细胞类型时，可采用基因标记动物31、转染细胞73或免疫细胞化学方法来鉴定不同类型的细胞9,22,71,86。在最近几年中，组织切片技术已成功应用于人体组织，为外分泌41和内分泌生理学9,36,37,39开辟了许多重要的研究途径。有趣的是，对人胰岛中钙动力学的详细评估一直极具挑战性，仍有待更深入的研究87。结合先进的共聚焦显微镜技术，胰腺组织切片方法已在小鼠中揭示了许多关于钙动力学的新发现，未来有望在人体组织研究中取得同样成果。

哺乳动物的胰腺是一个大型的外分泌和内分泌腺体。外分泌部分占胰腺总体积的96-99%，由腺泡和导管组成。内分泌部分则由大量胰岛（即朗格汉斯岛）构成，占胰腺总体积的剩余1-4%1。外分泌部分分泌主要的消化酶，用于分解食物中的富能多聚物，同时还分泌富含碳酸氢盐的液体，与其他胃肠道分泌物共同作用，为酶的活性提供适宜环境。内分泌部分分泌激素，调节餐后富能营养物质的分布与储存，以及两餐之间的释放。尽管出生时外分泌组织相对不发达，而内分泌组织相对成熟，但在断奶后，前者会迅速超过后者2,3,4。早期对胰腺功能的研究标志着现代生理学的诞生，该领域每一次重要的方法学进步都伴随着重大的科学突破5。由于胰腺结构复杂，对其进行研究在技术上具有挑战性；然而，鉴于胰腺癌、胰腺炎和糖尿病等疾病对公共健康构成重大威胁，且亟需新的治疗策略，这一研究领域也具有极强的推动力。
分离的胰岛6、腺泡7,8和导管片段已被开发并作为金标准方法使用数十年，因其相较于细胞系以及原代分散的内分泌细胞、腺泡细胞和导管细胞具有优势9,10。尽管分离的细胞群体功能显著改善，但这些方法仍涉及显著的机械和酶消化应激，使细胞脱离周围组织，因而缺乏旁分泌相互作用和机械支持，更重要的是，会引发正常生理状态的显著改变11,12,13。急性小鼠胰腺组织切片于2001年被开发出来，旨在建立一种类似于脑、垂体和肾上腺切片的实验平台，以保留细胞间接触、旁分泌相互作用、间充质及组织结构，同时克服当时胰岛研究金标准方法——分离胰岛——的一些最重要缺陷12,14。这些缺陷包括最外层结构的损伤、胰岛核心区域难以接近，以及需要进行培养，而培养可能对细胞身份和生理状态产生重要影响12,15。此外，组织切片方法使得在胰岛结构严重紊乱、无法通过传统方法分离胰岛或胰岛得率极低的动物模型上开展研究成为可能16,17,18,19,20,21。
此外，由于组织切片能够更全面地观察整个组织，并且适用于研究区域差异，因此在研究糖尿病和胰腺炎发展过程中的形态学变化时尤为适用。重要的是，尽管早期研究主要关注内分泌部分，但组织切片方法本身也能够用于研究外分泌成分9,22,23。在其被提出后的第一个十年中，该方法被用于对β14,24,25,26,27,28,29细胞和α30,31细胞进行电生理学研究，以及对胰腺的形态和功能成熟过程进行分析2,3。十年后的2013年，该方法成功应用于通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对胰岛细胞进行活细胞钙成像，以表征其对葡萄糖的响应32、功能连接模式33，并通过结合荧光钙染料与膜电位染料来研究膜电位与细胞内钙之间的关系34。同年晚些时候，该方法还被用于评估腺泡细胞中的钙&#160;动态变化22,35。在随后的几年中，胰腺组织切片已被应用于多项不同研究，并成功拓展至猪和人组织9,36,37,38,39,40,41。然而总体而言，小鼠胰腺组织切片（尤其是胰岛内）的钙成像研究目前仍主要由该研究团队完成。造成这一现状的主要原因之一，可能在于组织切片制备技术难度较高、需要配备共聚焦显微镜，以及数据分析相对复杂。本文的主要目的是使这一强大方法能够被更多潜在使用者所掌握和应用。
目前已有一些出色的方法学文章，详细论述了组织切片的制备以及利用切片进行结构和分泌研究的方法，但这些文章并未涉及共聚焦钙成像9,42,43。因此，本文重点介绍切片制备过程中的一些额外技巧与注意事项、成功染料负载、图像采集的关键步骤，以及基本钙信号数据分析的主要流程。因此，本研究应被视为对上述方法的补充，而非替代。同样，小鼠胰腺组织切片中的钙成像应被视为一种用于回答特定科学问题的实验手段，因而与其他胰腺生理学中的钙成像方法（如分离的导管或腺泡、分离的胰岛、类器官、移植至眼前房的胰岛以及在体记录）互为补充，而非绝对替代11,44,45,46,47,48。小鼠胰腺组织切片钙成像的潜力，或许最能通过近期在胰岛间质细胞（如周细胞49和巨噬细胞50）以及导管细胞23中成功记录到的钙动力学研究得以体现。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析天平 KERN ALJ 120-4</td><td>KERN &amp; SOHN GmbH</td><td>ALJ 160-4A</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 Leica TCS SP5 II 直立式系统</td><td>Leica</td><td>5100001578</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 Leica TCS SP5 AOBS 串联 II 系统</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>软木垫 15 cm x 15 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;15 mL 离心管</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>CLS430790</td><td></td></tr><tr><td>Corning&amp;nbsp;圆形带盖冰桶，4 L</td><td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td><td>432124</td><td></td></tr><tr><td>双刃剃须刀片</td><td>Personna, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - 精细镊子</td><td>FST, Germany</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock 管 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.023</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶 200 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>027.01.100</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀 - ToughCut</td><td>FST, Germany</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>平板轨道摇床&amp;nbsp; IKA KS 260 basic</td><td>IKA</td><td>Ident. No.: 0002980200</td><td></td></tr><tr><td>玻璃实验瓶 1000 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>091.01.901</td><td></td></tr><tr><td>Hartman 止血钳，弯型</td><td>FST, Germany</td><td>13003-10</td><td></td></tr><tr><td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L（水浸物镜，20x，NA 1.0）</td><td>Leica</td><td>15507701</td><td></td></tr><tr><td>量筒 25 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>015.01.025</td><td></td></tr><tr><td>显微操作器控制箱 SM-7，键盘 SM-7</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>&amp;nbsp;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Gorenje, Slovenia</td><td>MO20MW</td><td></td></tr><tr><td>渗透压仪 Gonotec 010</td><td>Gonotec, Berlin, Germany</td><td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td>Faber-Castell, No.2</td><td></td><td>任何细软圆头2号画笔，优选黑色</td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>灌流泵</td><td>Ismatec</td><td>ISM 827</td><td>Reglo Analog MS - 4/8</td></tr><tr><td>培养皿 100/20 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 35/10 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>培养皿 35 x 10 mm Nunclon Delta</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>153066</td><td>非粘性，用于琼脂糖块</td></tr><tr><td>pH 计 inoLab pH Level 1</td><td>WTW, Weilheim, Germany</td><td>E163694</td><td></td></tr><tr><td>移液器 1000 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3121 000.120</td><td></td></tr><tr><td>移液器 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3121 000.066</td><td></td></tr><tr><td>图钉 23 mm</td><td>Deli, Ningbo, China</td><td>E0021</td><td></td></tr><tr><td>螺口管，15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Semken 镊子</td><td>FST, Germany</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>锥形瓶稳定环</td><td>IsoLab, Germany</td><td>027.11.048</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜 Nikon SMZ 745</td><td>Nikon, Melville, NY USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器 Injekt Solo 5 mL</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>注射器针头 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&quot;)</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr><td>温度控制器</td><td>Luigs &amp; Neumann</td><td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td><td>切片微型室，温度控制器 TC 07</td></tr><tr><td>灌流系统管路</td><td>Ismatec</td><td>SC0310</td><td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + 硅胶管 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td></tr><tr><td>超声波清洗仪 Studio GT-7810A</td><td>Globaltronics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振动切片机 Leica VT 1000 S</td><td>Leica, Nussloch, Germany</td><td>14047235613</td><td></td></tr><tr><td>容量瓶 1000 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>013.01.910</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器 Neolab 7-2020</td><td>Neolab</td><td>&amp;nbsp;7-2020</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅 Thermo Haake 开放式循环水浴</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z527912</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料/试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙 - CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DL-乳酸</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>L1250-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>含 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 和 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 的气体混合物（常压）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶水 Wekem sekundenkleber WK-110</td><td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td><td>WK 110-020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-抗坏血酸</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>A9,290-2</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒，适用于哺乳动物细胞</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁 - MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td><td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td><td>O6807</td><td>可穿透细胞的 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 指示剂（激发/发射：495/523 nm）</td></tr><tr><td>Pluronic F-127（20% DMSO 溶液）</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>P3000MP</td><td>泊洛沙默：非离子三嵌段共聚物</td></tr><tr><td>氯化钾 - KCl</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque GTG 琼脂糖</td><td>Lonza, Rockland, USA</td><td>50111</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 - NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Honeywell, Germany</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠 - NaCl</td><td>Honeywell, Germany</td><td>31434-1KG</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠 - NaOH</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠 - NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>S0751-500G</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>15990-100G</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>FIJI 是一个开源项目</td></tr><tr><td>LASAF</td><td>Leica microsystems, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td>Python 是一个开源项目</td></tr></tbody></table>

急性小鼠胰腺组织切片中钙动力学的共聚焦激光扫描显微成像

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

急性小鼠胰腺组织切片是一种独特的原位制备方法，能够保持细胞间通讯和组织结构的完整性，相较于典型的体外研究中所描述的分离胰岛、腺泡、导管或分散细胞，其制备过程引起的变化显著更少。通过将急性胰腺组织切片与共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）中的活细胞钙成像技术相结合，可同时在大量内分泌和外分泌细胞中以单细胞甚至亚细胞分辨率研究钙信号。该方法具有高灵敏度，能够检测到细微变化，可用于研究细胞间的钙波传播、功能连接性，以及细胞生理反应对其在胰岛内定位及与其他细胞旁分泌关系的依赖性。最后，从动物福利的角度来看，同时记录大量细胞信号可减少实验所需的动物数量，有助于实现“3R”原则——即替代（replacement）、减少（reduction）和优化（refinement）。

将琼脂糖溶液注入胰管是制备胰腺组织切片最关键的步骤。成功的注射可通过胰腺组织变白来识别，如图3A左侧所示，而注射不完全的胰腺部分则如图3A右侧所示。胰岛（Langerhans岛）可通过肉眼或体视显微镜观察识别，这有助于切割胰腺的适当部位，用于后续包埋于琼脂糖块中（图3B）。在新鲜切割的小鼠胰腺组织切片中，胰岛在体视显微游戏副本下表现为白色斑点，可轻易与周围的外分泌组织和间充质区分开来（图3C），在光学显微镜下则呈现为棕褐色结构（图3D）。胰腺组织切片在切割后至少12小时内可用于多种类型的实验。除在体视显微镜和光学显微镜下进行大体形态学评估外，还可通过钙成像过程中细胞的功能性反应来评估胰腺组织切片的活性（图4）。
<img alt="显示细胞结构的荧光显微镜图像；红-绿染色突出显示分布情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：组织切片中细胞的存活率。 细胞存活率通过活/死细胞染色法（Live/Dead assay）测定。活细胞被Calcein AM染色（显示为绿色），而死细胞被乙啶同源二聚体-1（ethidium homodimer-1）染色（显示为红色）。黄色线条表示底部和右侧所示Z层扫描X-Y截面的位置。Z层扫描的总深度为88 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
对于钙成像实验，荧光钙指示剂需要穿透数层细胞。图5A展示了细胞膜通透性Ca2+指示剂染料成功加载至胰腺组织切片的情况，其中可清晰分辨单个胰岛细胞和腺泡细胞。相比之下，图5B-D中的切片并不理想，原因分别为染料未能有效渗透（图5B）、缺乏胰岛细胞（图5C），以及组织表面存在大量坏死区域（图5D）。此类切片可予以弃用，或检查是否存在被切割或染色效果更佳的其他胰岛（参见表1中的故障排除建议），也可用于记录外分泌细胞的反应。
<img alt="荧光显微镜图像；细胞组织分析；发射强度分布。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图5"> 
图5：可用与不可用制备样本的示例。（A）胰腺组织切片成功制备的示例，其中朗格汉斯岛内的细胞染色良好，同时导管细胞及周围腺泡组织也清晰可见。（B）染色不良的组织切片示例。（C）朗格汉斯岛存在结构中断的示例。（D）包含大量死亡细胞和碎片的朗格汉斯岛示例。右侧的“glow-over, glow-under”查找表显示绿色代表0强度，蓝色代表饱和强度。比例尺 = 100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
使用细胞膜通透性 Ca2+ 荧光指示剂染料进行钙成像的代表性结果如图6所示。图6A展示了一张高分辨率的胰腺组织切片图像，其中包含朗格汉斯胰岛、腺泡组织和胰管。为便于区分，图6A所示胰腺组织切片中的内分泌部、外分泌部和导管部分在图6B中以不同颜色标出。通过施加适当的刺激，可对不同类型的胰岛细胞或胰岛细胞与非胰岛细胞进行功能性区分51。β细胞通常在葡萄糖方波刺激下表现出 [Ca2+]IC 的短暂升高，随后在持续的平台期上出现快速钙振荡（图6C，上图）。
由于所有β细胞通过功能性合胞体相互耦合，这些振荡也通过细胞内钙离子浓度[Ca2+]IC波的传播在不同细胞间高度同步32,34,52,53,54（图7C）。周期为5–15分钟的较慢[Ca2+]IC振荡可能构成快速振荡的基础，甚至可能是主要的响应类型55,56。相同的简单实验方案可能揭示其他类型的响应，尤其是在胰岛边缘区域（图6C，下图）。由于这些细胞与β细胞不同步，且在低葡萄糖条件下即表现出更快、更不规则的振荡，或表现为活性下降，此类响应强烈提示为非β细胞21,32,57,58。然而，对其功能的明确鉴定需要更复杂的实验方案，包括额外的刺激步骤或其他方法，相关内容将在下文讨论。腺泡细胞和导管细胞的典型响应分别见于图6D和图6E。有关腺泡细胞和导管细胞的更多细节，请参阅相关文献22,23,35。
<img alt="胰岛示意图，显示β细胞、腺泡细胞、导管细胞及刺激反应曲线。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6：不同类型胰腺细胞中钙动力学的代表性结果。 （A）包含周围组织的朗格汉斯胰岛高分辨率图像。比例尺 = 100 µm。（B）胰腺组织不同部分的界定，其中腺泡组织显示为黄色，朗格汉斯胰岛显示为红色，导管树的一段显示为蓝色。比例尺 = 100 µm。（C）在12 mM葡萄糖刺激下β细胞和假定非β细胞中的典型钙动力学曲线；非刺激条件使用3 mM葡萄糖。更特异性区分非β细胞的实验方案见讨论部分。（D）腺泡细胞在25 nM乙酰胆碱刺激下的典型钙动力学曲线。（E）导管细胞在1 mM鹅脱氧胆酸刺激下的典型钙动力学曲线。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
钙成像成功完成后，数据首先根据方案部分所述，通过指数和线性拟合组合进行导出并校正漂白效应。图7A展示了漂白校正前后的时序结果。随后，可对响应的激活相、去激活相以及平台相中的多个参数进行分析。刺激后[Ca2+]IC上升起始的延迟时间可用图7B中所示的delayA表示，并可进一步分析单个细胞间延迟的异质性（delayA1）。相同的参数（delayD和delayD1）可用于描述去激活相。在初始瞬时[Ca2+]IC升高之后，胰岛中大多数胰腺β细胞的平台相特征表现为相对规律的高频[Ca2+]IC振荡。该平台相可通过分析经典的功能参数进行描述。图7C示意图展示了[Ca2+]IC振荡的持续时间、频率以及活跃时间百分比。在采集速率高于10 Hz的钙成像中，还可清晰识别出反复在胰岛中传播的钙波（图7C）。
<img alt="电生理学图谱；神经刺激响应；时间延迟分析；200秒内的数据趋势。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 7"> 
图7：时间序列数据的分析。（A）对光漂白效应进行校正后的时间序列数据。（B）分析在12 mM葡萄糖刺激后激活的延迟时间，以及刺激停止后去激活的延迟时间。刺激持续时间由图中浅灰色阴影条表示。（C）对平台期多个参数的分析：I）在半峰高处确定的振荡持续时间，II）通过振荡间间隔确定的振荡频率，III）振荡频率与持续时间的乘积所表示的活跃时间。I-IV）在跨越胰岛的任意一次振荡波中，各细胞达到振荡半峰高所需时间的延迟（Δt）所确定的振荡间延迟。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">请点击此处下载此表格。</a>

我们介绍了急性胰腺组织切片的制备方法及其在共聚焦激光扫描显微镜中的应用，用于在长时间内以高时空分辨率同时研究大量活细胞中的钙动力学。

急性小鼠胰腺组织切片是一种独特的原位制备方法，可保留细胞间通讯和组织结构，其涉及……

结合活细胞钙成像技术，急性胰腺组织切片技术能够以高分辨率长时间研究细胞间的钙波传播及多细胞功能连接性。该技术的主要优势在于操作快速、能够保持组织结构完整性，并在获得高组织产率的同时，减少酶解和机械损伤带来的影响。通过检测疾病进展过程中的功能与形态变化，该技术有助于加深对糖尿病等胰腺相关疾病的理解。该组织切片技术可应用于脑、垂体和肾上腺组织，重点在于保持细胞间接触、旁分泌相互作用以及组织结构的完整性。为准备将琼脂糖注入小鼠胰腺，使用5毫升注射器吸取40摄氏度的液态琼脂糖，并在注射器上安装一支30号针头。在小心用针帽盖住针头后，将注射器针头朝下放置，使琼脂糖全部体积位于水面以下，置于40摄氏度的水浴中。将一瓶细胞外溶液在常压和室温下持续用碳合气（carbogen）鼓泡，并置于冰上，流速为每分钟1.5毫升，以确保充分氧合且pH维持在7.4。进行琼脂糖注射时，将一只已处死的成年小鼠置于体视显微镜下，通过剖腹手术暴露小鼠腹部，轻柔地将肠道移至左侧以暴露胆总管，用镊子轻轻提起胆总管的十二指肠端，以定位法特壶腹（papilla of Vater）。使用止血钳夹闭十二指肠乳头处的胆管，以防止琼脂糖从胆管泄漏至十二指肠；用小型锐利镊子伸至胆总管下方，撕裂连接胆管与胰腺组织的膜。在尽可能清除胆管周围的脂肪和结缔组织后，将胆管垂直置于一对较大镊子的尖端，用力按压注射器活塞，将黏稠的液态琼脂糖注入胆总管近端，持续 20 至 30 秒。当组织变为灰白色并轻微膨胀时，移除注射器，缓慢将 20 毫升通入氧气的冰冻细胞外溶液倾倒于胰腺组织上，以冷却组织并使琼脂糖固化。获取胰腺组织切片时，使用镊子和精细的锋利剪刀，将注入琼脂糖的胰腺轻轻转移至一个含有40毫升冰冻细胞外溶液的100毫米培养皿中。轻轻晃动培养皿以冲洗组织，然后将胰腺转移至第二个盛有冰冻细胞外溶液的培养皿中。用镊子和剪刀将白色、灌注良好的胰腺部分切成最多六块，每块体积为0.1至0.2立方厘米，并从组织块上去除残留的结缔组织和脂肪组织。将清洗后的组织块放入一个直径35毫米、底部无黏性的培养皿中，培养皿内含有约5毫升40摄氏度的液态琼脂糖，然后立即将培养皿置于冰上。待琼脂糖凝固后，将培养皿倒扣在直径100毫米培养皿的盖子上，用剃须刀片的一半小心地沿培养皿侧壁与琼脂糖之间的边缘切割，将琼脂糖从培养皿中取出。使用剃须刀片将游离的琼脂糖切成单个立方体，每个立方体包含一个组织琼脂糖块，然后用氰基丙烯酸酯胶水将这些块固定在振动切片机的样品板上。将150毫升冰冻的细胞外液加入振动切片机的切片室中，并持续用碳氧混合气体（carbogen）通气。将样品板用螺丝固定在振动切片机上，并安装新的剃刀刀片。在切片室周围放置冰块，并加入两块体积为10毫升的冰冻细胞外液冰块，该冰块由添加了6毫摩尔葡萄糖的细胞外液制成。将切片机设置为每秒0.05至1毫米的速度和70赫兹，然后开始切片，以获得厚度为140微米、表面积为20至100平方毫米的琼脂糖切片。使用细毛刷小心地将每一片切片转移至盛有40毫米HEPES缓冲液（其中添加6毫摩尔葡萄糖）的100毫米培养皿中。钙离子染料配制：在15毫升螺旋盖管中溶解50微克细胞膜通透性钙离子指示染料、7.5微升DMSO、2.5微升泊洛沙姆以及6.667毫升HBS溶液。使用移液器将溶液充分混匀20秒，随后将试管置于超声波清洗仪中处理30秒，并涡旋振荡30秒。然后，将配制好的钙离子指示剂染料溶液每3.333毫升分装至一个5毫升的培养皿中，每10片待标记的组织使用一个培养皿。染料负载时，用柔软的细毛刷将最多10片组织转移至每皿染料溶液中，并将培养皿置于轨道摇床上，在室温、避光条件下以每分钟40转的速度孵育50分钟。孵育结束后，将最多20个染色的切片转移至装有无染料HBS的独立60毫升培养皿中。进行共聚焦显微镜钙成像时，选择20或25倍放大倍数，将采集模式设置为时间序列成像，针孔设置为100至200微米，并根据实验中使用的荧光染料设定相应的激发光和发射光波长。将记录室和灌流系统安装到显微镜的温度控制载物台上，并将进液口和出液口置于记录室的远端边缘。将灌流系统的流入和流出速率设置为每分钟一到两毫升。将灌流系统的温度设置为37摄氏度，并使用非刺激性溶液开始灌流。为记录组织的钙动态变化，将单个组织切片放入记录室中，并用带有拉紧尼龙网的U形铂金丝固定组织。使用明场模式定位目标结构，并利用活体成像将待研究的结构置于视野范围内。为优化信噪比，在保持激光功率最低的前提下，调节激光强度、检测器放大倍数以及线平均采集次数。将焦平面调整至切割表面下方15微米处，以避免采集来自可能受损细胞的信号，然后进行图像采集。将采样频率设置为每秒一到两赫兹，以实现对单个振荡的初始检测，并记录高分辨率图像。如果条件允许，使用在线图表实时监测样品的响应情况、光照过度、光漂白以及机械漂移。当所有图像采集完成后，保存数据以供后续分析。在此可以观察到一个理想的组织切片示例，其中细胞可渗透的钙离子指示剂染料已成功加载至胰腺组织切片中。相比之下，这些组织切片由于染料渗透失败、缺乏胰岛细胞，或样本表面存在大量坏死组织，因而不适合成像。胰腺组织切片的高分辨率图像可用于区分胰腺组织的不同区域，例如朗格汉斯胰岛、腺泡组织或胰管。刺激物可用于功能性区分不同的胰岛细胞，或区分胰岛细胞与非胰岛细胞。例如，β细胞通常对矩形脉冲葡萄糖刺激产生响应，表现为细胞内钙离子浓度先出现短暂升高，随后在持续的平台期上发生快速的钙振荡。相比之下，非β细胞则表现出更快且更不规则的振荡响应。刺激后细胞内钙离子浓度升高的起始延迟，以及单个细胞之间的异质性和延迟，也可以被测量。相同的参数可用于描述去活化阶段。此处可观察到细胞内钙振荡持续时间、频率以及活跃时间百分比的示意图。当以高于10赫兹的采样速率进行成像时，可清晰识别出反复在胰岛内传播的钙波。应尽可能靠近十二指肠处夹闭胆总管，以防止意外阻塞进入胰腺的分支。此外，在注射过程中切勿停止按压注射器推杆，因为琼脂糖会立即在针头内凝固。急性小鼠胰腺组织切片技术还可与膜片钳技术联合使用，以研究离子通道电流、胞吞作用，以及开展免疫组织化学研究和分泌功能研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

急性小鼠胰腺组织切片钙动力学的共聚焦激光扫描显微镜

本视频介绍了实时成像胰岛细胞的技术，用于研究胰岛细胞中少数亚群细胞质内钙离子浓度的变化。可通过功能性反应来鉴定少数细胞亚群，例如利用肾上腺素和饥饿素等标记化合物，这些化合物可诱导胰岛细胞特定亚群中细胞质钙离子浓度发生变化。该方法有助于深入了解血糖水平与胰岛分泌输出之间的相互作用。...

胰腺细胞中钙动力学的成像：一种研究胰岛细胞质钙浓度实时变化的技术

在本视频中，我们介绍了通过稳定窗口对小鼠胰腺进行活体成像，以实现对细胞动态的长期可视化观察。...

活体成像：通过稳定成像窗口在细胞水平观察小鼠胰腺的方法

我们介绍一种可重复的小鼠胰腺腺泡细胞制备方法，用于在生理和病理相关刺激下检测腺泡细胞的钙信号及细胞损伤。同时提供了一种对这些细胞进行腺病毒转染的方法。...

用于钙成像、细胞损伤检测及腺病毒感染的胰腺腺泡细胞制备

本文介绍了一种用于成像和定量分析异质性细胞群体（如胰岛细胞）中钙动力学的实验方案。将荧光报告分子递送至胰岛外周层细胞，随后对胰岛进行固定并成像，进而对单个细胞的荧光强度动力学进行分析。...

小鼠胰岛细胞亚群中钙动力学的成像

本研究介绍了活体胰腺组织切片在胰岛生理学及胰岛-免疫细胞相互作用研究中的应用。...

观察活体胰腺组织切片中的胰岛功能及胰岛-免疫细胞相互作用

利用胰腺活体成像窗实现了对胰腺的体内高分辨率成像。...

在小鼠模型中通过胰腺活体成像窗口实现胰腺的稳定纵向体内细胞水平可视化

我们介绍一种用于小鼠胰腺亚细胞分辨率成像的稳定植入式光学窗口的外科手术植入方案，可实现对健康和病变胰腺的连续性及纵向研究。...

小鼠胰腺活体成像的稳定窗口技术

本方案描述了如何利用已故器官捐献者的胰腺制备人胰腺切片，以在接近生理条件下研究细胞功能。这一创新方法能够实现对正常及结构受损胰岛的检测，并深入探究内分泌与外分泌区域之间的复杂相互作用。...

生成人胰腺组织切片以研究内分泌和外分泌胰腺生理学

激光捕获显微技术，又称激光显微切割（LMD），可使用户从冷冻或...

哺乳动物组织的激光显微切割

获得高质量且数量合适的胰岛是成功进行胰岛移植的重要前提之一。在本视频中，我们将逐步介绍采用改良自动化方法进行人胰腺胰岛分离的操作流程（第一部分：胰腺组织的消化与收集）。...

人胰岛分离：第一部分：胰腺组织的消化与收集

学习使用共聚焦激光扫描显微镜对小鼠急性胰腺组织切片进行活细胞钙成像的方法。该技术保留天然组织结构，可同时研究大量内分泌和外分泌细胞的钙信号动态与细胞间通讯，有助于深入理解胰腺生理及相关疾病机制。

急性小鼠胰腺组织切片中钙动力学的共聚焦激光扫描显微成像

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