急性小鼠胰腺组织切片中钙动力学的共聚焦激光扫描显微成像

结合活细胞钙成像技术，急性胰腺组织切片技术能够以高分辨率长时间研究细胞间的钙波传播及多细胞功能连接性。该技术的主要优势在于操作快速、能够保持组织结构完整性，并在获得高组织产率的同时，减少酶解和机械损伤带来的影响。通过检测疾病进展过程中的功能与形态变化，该技术有助于加深对糖尿病等胰腺相关疾病的理解。

该组织切片技术可应用于脑、垂体和肾上腺组织，重点在于保持细胞间接触、旁分泌相互作用以及组织结构的完整性。为准备将琼脂糖注入小鼠胰腺，使用5毫升注射器吸取40摄氏度的液态琼脂糖，并在注射器上安装一支30号针头。在小心用针帽盖住针头后，将注射器针头朝下放置，使琼脂糖全部体积位于水面以下，置于40摄氏度的水浴中。

将一瓶细胞外溶液在常压和室温下持续用碳合气（carbogen）鼓泡，并置于冰上，流速为每分钟1.5毫升，以确保充分氧合且pH维持在7.4。进行琼脂糖注射时，将一只已处死的成年小鼠置于体视显微镜下，通过剖腹手术暴露小鼠腹部，轻柔地将肠道移至左侧以暴露胆总管，用镊子轻轻提起胆总管的十二指肠端，以定位法特壶腹（papilla of Vater）。

使用止血钳夹闭十二指肠乳头处的胆管，以防止琼脂糖从胆管泄漏至十二指肠；用小型锐利镊子伸至胆总管下方，撕裂连接胆管与胰腺组织的膜。在尽可能清除胆管周围的脂肪和结缔组织后，将胆管垂直置于一对较大镊子的尖端，用力按压注射器活塞，将黏稠的液态琼脂糖注入胆总管近端，持续 20 至 30 秒。当组织变为灰白色并轻微膨胀时，移除注射器，缓慢将 20 毫升通入氧气的冰冻细胞外溶液倾倒于胰腺组织上，以冷却组织并使琼脂糖固化。

获取胰腺组织切片时，使用镊子和精细的锋利剪刀，将注入琼脂糖的胰腺轻轻转移至一个含有40毫升冰冻细胞外溶液的100毫米培养皿中。轻轻晃动培养皿以冲洗组织，然后将胰腺转移至第二个盛有冰冻细胞外溶液的培养皿中。用镊子和剪刀将白色、灌注良好的胰腺部分切成最多六块，每块体积为0.1至0.2立方厘米，并从组织块上去除残留的结缔组织和脂肪组织。

将清洗后的组织块放入一个直径35毫米、底部无黏性的培养皿中，培养皿内含有约5毫升40摄氏度的液态琼脂糖，然后立即将培养皿置于冰上。待琼脂糖凝固后，将培养皿倒扣在直径100毫米培养皿的盖子上，用剃须刀片的一半小心地沿培养皿侧壁与琼脂糖之间的边缘切割，将琼脂糖从培养皿中取出。使用剃须刀片将游离的琼脂糖切成单个立方体，每个立方体包含一个组织琼脂糖块，然后用氰基丙烯酸酯胶水将这些块固定在振动切片机的样品板上。

将150毫升冰冻的细胞外液加入振动切片机的切片室中，并持续用碳氧混合气体（carbogen）通气。将样品板用螺丝固定在振动切片机上，并安装新的剃刀刀片。在切片室周围放置冰块，并加入两块体积为10毫升的冰冻细胞外液冰块，该冰块由添加了6毫摩尔葡萄糖的细胞外液制成。

将切片机设置为每秒0.05至1毫米的速度和70赫兹，然后开始切片，以获得厚度为140微米、表面积为20至100平方毫米的琼脂糖切片。使用细毛刷小心地将每一片切片转移至盛有40毫米HEPES缓冲液（其中添加6毫摩尔葡萄糖）的100毫米培养皿中。钙离子染料配制：在15毫升螺旋盖管中溶解50微克细胞膜通透性钙离子指示染料、7.5微升DMSO、2.5微升泊洛沙姆以及6.667毫升HBS溶液。

使用移液器将溶液充分混匀20秒，随后将试管置于超声波清洗仪中处理30秒，并涡旋振荡30秒。然后，将配制好的钙离子指示剂染料溶液每3.333毫升分装至一个5毫升的培养皿中，每10片待标记的组织使用一个培养皿。染料负载时，用柔软的细毛刷将最多10片组织转移至每皿染料溶液中，并将培养皿置于轨道摇床上，在室温、避光条件下以每分钟40转的速度孵育50分钟。

孵育结束后，将最多20个染色的切片转移至装有无染料HBS的独立60毫升培养皿中。进行共聚焦显微镜钙成像时，选择20或25倍放大倍数，将采集模式设置为时间序列成像，针孔设置为100至200微米，并根据实验中使用的荧光染料设定相应的激发光和发射光波长。将记录室和灌流系统安装到显微镜的温度控制载物台上，并将进液口和出液口置于记录室的远端边缘。

将灌流系统的流入和流出速率设置为每分钟一到两毫升。将灌流系统的温度设置为37摄氏度，并使用非刺激性溶液开始灌流。为记录组织的钙动态变化，将单个组织切片放入记录室中，并用带有拉紧尼龙网的U形铂金丝固定组织。

使用明场模式定位目标结构，并利用活体成像将待研究的结构置于视野范围内。为优化信噪比，在保持激光功率最低的前提下，调节激光强度、检测器放大倍数以及线平均采集次数。将焦平面调整至切割表面下方15微米处，以避免采集来自可能受损细胞的信号，然后进行图像采集。

将采样频率设置为每秒一到两赫兹，以实现对单个振荡的初始检测，并记录高分辨率图像。如果条件允许，使用在线图表实时监测样品的响应情况、光照过度、光漂白以及机械漂移。当所有图像采集完成后，保存数据以供后续分析。

在此可以观察到一个理想的组织切片示例，其中细胞可渗透的钙离子指示剂染料已成功加载至胰腺组织切片中。相比之下，这些组织切片由于染料渗透失败、缺乏胰岛细胞，或样本表面存在大量坏死组织，因而不适合成像。胰腺组织切片的高分辨率图像可用于区分胰腺组织的不同区域，例如朗格汉斯胰岛、腺泡组织或胰管。

刺激物可用于功能性区分不同的胰岛细胞，或区分胰岛细胞与非胰岛细胞。例如，β细胞通常对矩形脉冲葡萄糖刺激产生响应，表现为细胞内钙离子浓度先出现短暂升高，随后在持续的平台期上发生快速的钙振荡。相比之下，非β细胞则表现出更快且更不规则的振荡响应。

刺激后细胞内钙离子浓度升高的起始延迟，以及单个细胞之间的异质性和延迟，也可以被测量。相同的参数可用于描述去活化阶段。此处可观察到细胞内钙振荡持续时间、频率以及活跃时间百分比的示意图。

当以高于10赫兹的采样速率进行成像时，可清晰识别出反复在胰岛内传播的钙波。应尽可能靠近十二指肠处夹闭胆总管，以防止意外阻塞进入胰腺的分支。此外，在注射过程中切勿停止按压注射器推杆，因为琼脂糖会立即在针头内凝固。

急性小鼠胰腺组织切片技术还可与膜片钳技术联合使用，以研究离子通道电流、胞吞作用，以及开展免疫组织化学研究和分泌功能研究。