用于SARS-CoV-2检测与定量的两步法逆转录微滴数字PCR方案

这些方案可用于使用双色数字滴落式PCR（ddPCR）系统，自行开发检测SARS-CoV-2的多重ddPCR检测方法。该方法适用于希望自主开发SARS-CoV-2及其他病原体检测试剂盒的研究人员。与传统的金标准RT-qPCR相比，RT-ddPCR可在无需标准曲线的情况下对多个SARS-CoV-2基因进行定量分析。

由于数字滴定PCR（ddPCR）是一种新兴技术，通过可视化演示有助于当前和未来的使用者理解并轻松开发用于SARS-CoV-2及其他病原体检测的多重检测方法。进行cDNA合成时，向一个100或200微升的PCR管中加入2微升5X逆转录预混液、5微升目标RNA样本以及3微升无RNase的双蒸水，总体积为10微升，混匀后将PCR管置于冰上。待所有试剂添加完毕后，将样本放入热循环仪中，并设置仪器程序：37°C逆转录反应15分钟，85°C高温灭活逆转录酶5秒，最后在4°C无限期保存。

进行微滴数字PCR之前，将19.8微升新鲜配制的主混合液加入无核酸酶的96孔微滴数字PCR板的相应孔中。向每孔主混合液中加入2.2微升cDNA，使每孔反应体系总体积达到22微升，并使用一次性PCR板封膜密封。随后，将PCR板涡旋振荡15至30秒，并在离心机中离心10至15秒，使孔内液体全部沉降至板底。

在自动液滴生成仪的触摸屏上进行自动液滴生成操作时，点击“配置样品板”，并选择样品在样品板上所在的列。点击“确定”，打开自动液滴生成仪的门。将样品板、液滴生成板以及实验所需的其他材料放入仪器内相应位置，然后关闭门。

当触摸屏变为绿色，表示所有材料均已加载到正确位置时，选择探针用油并启动液滴生成。根据屏幕显示的时间等待液滴生成完成。当屏幕显示“液滴已准备好”时，打开舱门取出含有液滴的板，并在180摄氏度下使用板封膜机封膜五秒钟，用可穿刺铝箔密封板。

在生成液滴后的30分钟内，将密封的液滴板放入96深孔热循环仪中。设置样品体积为40 µL，盖子温度为105 °C。随后，对液滴进行PCR扩增。

进行液滴读取时，扩增完成后，将经过热循环的96孔板转移至液滴读取仪中，并打开与液滴读取仪相连计算机上的配套软件。在设置模式下，选择“新建”，然后双击任意孔以打开孔编辑对话框。选择需要读取的孔，并将实验类型设置为绝对定量，超级混合液设置为探针法微滴数字PCR超级混合液。

将目标一类型指定至通道1未知，目标二类型指定至通道2未知。根据板布局分配样本名称，然后单击应用和确定。保存模板后，单击运行。

当软件提示时，选择 FAM/HEX 颜色。数据采集结束后，从读板仪中取出反应板。在分析数据之前，检查所有孔的数据以获取总液滴数。

设定一个阈值，以确定被计为阳性或阴性结果所需的最少液滴数量。对于单重和双重检测分析，双击要分析的QLP文件，然后选择“分析”。使用一维振幅和二维振幅阈值工具，在正确的通道中，根据节点模板对照和阳性对照样本的参考，区分每个孔中的阳性与阴性液滴。

然后，将结果导出为 CSV 文件以进行进一步分析。对于三重探针混合物检测，打开 QLP 文件，并在板编辑器选项卡中选择要分析的孔。将实验类型设置为直接定量，检测类型设置为探针混合物三重检测，并输入靶标名称。

然后点击“应用”。根据“选择以分配簇”弹出窗口的提示，使用图形工具为不同的目标簇分配特定颜色。当所有目标颜色分配完毕后，定量数据将显示在孔数据窗口中。

将数据导出为 CSV 文件以进行下游分析。对于四重检测实验，将实验类型设置为直接定量，检测类型设置为扩增多重检测。输入靶标名称，然后单击应用。

根据“选择并分配簇”窗口弹出的建议，使用图形工具为不同的目标簇分配特定颜色。当所有目标颜色分配完成后，定量数据将显示在孔数据窗口中。将数据导出为 CSV 文件以进行进一步分析。

如本代表性温度梯度分析所示，在进行双重检测时，较高的退火温度无法清晰区分阳性液滴与阴性液滴。然而，随着退火温度的降低，阳性与阴性液滴之间实现了最佳分离。利用双色反转录液滴数字PCR检测系统，可在单个样本中检测出一至四个SARS-CoV-2靶标。

可使用无模板对照样本来定位阴性液滴，以帮助在单重检测中设定阴性阈值。在双重检测中，分析可在单个通道或二维振幅图中进行。尽管高重检测的数据分析较为复杂，但这类检测仍然具有重要价值，因为它们能够在三重探针混合检测中评估多达八个液滴簇，以及在基于振幅的四重检测中评估多达十六个液滴簇。

根据待开发的检测方法，确保在总反应体系中加入正确的目标引物和探针浓度。通过此操作流程，可更换不同目标序列以开发新的逆转录数字PCR（RT-ddPCR）检测方法。这些检测方法可用于不同的研究目的，或用于新发传染病的诊断。

自开发以来，该技术已用于不同标准品、人体样本及环境样品中病毒核酸拷贝数的准确定量。