使用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜可视化眼部形态发生
2021年4月5日
在这里，提供了一种方案，用于使用市售的光照相显微镜和图像处理工作站对眼部形态发生进行延时成像，以分析结果数据。该协议详细说明了胚胎麻醉的程序，嵌入低熔点温度琼脂糖，悬浮在成像室中，设置成像参数，最后使用图像分析软件分析成像数据。
我们的方案提供了关于眼部形态发生过程如何在正常和病理条件下发生的视觉和实时信息。我们的协议允许快速采集z堆栈，从而减少数据集中每个3D图像之间的时间。这增加了眼部形态发生方式的时间分辨率。
由于胚胎在单个体温阶段呈球形，因此将胚胎定位在毛细管内可能具有挑战性，因此将多个胚胎加载到毛细管中以确保至少有一个胚胎处于正确的方向非常重要。为了在受精后10小时筛查菌丝的存在，将胚胎置于体视显微镜下，并使用荧光适配器确认rx3:GFP转基因的存在。一旦鉴定出三到五个GFP阳性的单索米特胚胎，使用细镊子对胚胎进行去核。
为了将胚胎嵌入琼脂糖中，将胚胎转移到含有500微升E3胚胎缓冲液的微量离心管中，该缓冲液补充了每毫升三卡因168微克，并加入500微升冷却但液体2%低熔点温度琼脂糖和E3缓冲液到管中，轻轻混合。使用带有PTFE柱塞的一毫米玻璃毛细管将琼脂糖嵌入的胚胎拉入毛细管中，并让琼脂糖在室温下固化30至60秒。然后将毛细管放入补充三卡因的E3缓冲液烧杯中。
要设置用于胚胎成像的光片显微镜，请将毛细管放入毛细管样品架中，然后单击固定器金属盘中心的金属鞘。将两个橡胶塞放入护套中，缝隙朝向护套的末端，并将毛细管滑过橡胶塞的中间。一旦标记位于金属护套的底部，使用金属盖将毛细管固定到位，并将支架放在显微镜的顶部，使白色标记对齐。
关闭样品架的盖子，然后单击显微镜软件界面中的定位毛细管按钮。使用尔格驱动器控制面板，将毛细管移动到物镜的正上方。打开盖子后，轻轻推动柱塞，直到含有胚胎的琼脂糖部分悬挂在物镜前的毛细管底部下方。
关闭定位毛细管并单击定位样品以将视图从样品室网络摄像头切换到显微镜物镜，并使用此视图更精确地调整样品的位置。然后关闭定位样本并切换到采集选项卡。检查 z 堆栈和时间序列框。
在采集模式参数窗口中，选择双面光照板设置，然后选中在线双面融合和枢轴扫描框。单击连续以获得胚胎的实时视图。在通道窗口中，选择488通道，并将激光功率设置为1，曝光时间设置为7.5毫秒。
使用Ergo Drive控制面板调整胚胎的位置，直到眼场直接面向相机，并在通道参数中调整左右光片，直到眼场充分聚焦。将第一个和最后一个 z 位置设置为比最后一个可检测荧光信号高 500 微米左右的位置，然后单击最佳位置将步长设置为 0.477 微米。要设置孵育参数，请选中珀尔帖装置的复选框，将温度保持在28摄氏度。
在时间序列窗口中，选择适当的实验频率和时间间隔来获取图像。点击开始实验。选择要存储映像集的文件夹并设置映像前缀，然后单击"保存"以开始映像。
对于图像分析，将图像文件导入相应的 4D 图像分析软件程序，然后单击 4D 查看器立方体、比例尺和视频图标以打开情节提要任务栏。选择"添加关键帧序列"并指定视频的持续时间（以秒为单位）。取消选中创建旋转框，然后选中使用时间进度以在视频中包含特定时间点。
保存情节提要以将相同的参数应用于多个图像集。单击导出影片以保存延时摄影的视频并指定影片导出设置，包括文件名和位置、视频格式、视频分辨率、帧速率、数据分辨率等。如果需要，请添加时间戳，然后选择"记录"。
要在特定时间点创建旋转视频，请添加刚才演示的关键帧序列，但选中创建旋转框并取消选中使用时间进度框。要在任何方向和任何单个时间点渲染高分辨率图像，请在 4D 查看器中选择相机图标。要构建用于分析的管道，请选择 Flask 以访问分析面板，然后打开分析操作菜单以选择感兴趣的操作序列。
单击蓝色三角形以启动管道。在运行结束时，单击弹出窗口中的要素列以查看可提供感兴趣对象相关信息的要素列表，然后单击导出将数据导出到电子表格。在该具有代表性的分析中，从一个somite阶段到受精后24小时，每五分钟从背侧有利位置对转基因rx3:GFP胚胎进行成像，总共14小时。
如前所述，对从该分析中捕获的图像进行管道运行有助于生成发育中的眼睛的掩模。请注意，当眼场被分成两个视囊泡时，可以观察到前脑中促成下丘脑的第三个rx3:GFP阳性区域。该信息也在体积数据中观察到，并且可以很容易地与视囊泡数据分离，因为它的体积比在任一视神经囊泡中观察到的体积小得多。
此过程之后可以进行其他分析，例如，跟踪图像数据集中的单个细胞。
概述
该协议概述了一种使用光片显微镜对眼部形态发生进行时间跃进成像的方法。它包括胚胎准备、成像设置和数据分析的详细步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 成像技术
背景
- 眼部形态发生对于理解眼睛发育至关重要。
- 时间跃进成像为动态生物过程提供了洞察。
- 光片显微镜能够进行高分辨率成像，同时降低光毒性。
- 成像过程中胚胎的定位是成功的关键因素。
研究目的
- 开发一个观察眼部形态发生的可靠协议。
- 提高发育过程成像的时间分辨率。
- 促进正常和病理条件的分析。
使用的方法
- 胚胎麻醉和在琼脂中嵌入。
- 使用光片显微镜进行成像。
- 使用专门软件进行图像采集和分析。
- 创建时间跃进视频和数据管道以供分析。
主要结果
- 成功对转基因rx3:GFP胚胎进行长达14小时的成像。
- 识别关键的发育阶段和结构。
- 生成发育中眼部结构的掩模。
- 观察视囊形成及相关脑结构。
结论
- 该协议为研究眼部发育提供了一个强大的框架。
- 时间跃进成像可以揭示形态发生过程的关键洞察。
- 未来的研究可以在此方法基础上进行进一步分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution, time-lapse lightsheet microscopy of rx3:GFP transgenic zebrafish embryos enables direct visualization of vertebrate ocular morphogenesis in vivo. This workflow provides quantitative, 4D datasets that support mechanistic de-risking and target validation for early-stage ophthalmic discovery. The approach facilitates predictive confidence in evaluating genetic or pharmacological perturbations impacting eye development, informing risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables real-time visualization of eye field specification and morphogenetic events.
- Supports functional validation of candidate genes or pathways involved in ocular development.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying developmental phenotypes under experimental perturbations.
- Provides high-content imaging data for hypothesis-driven target triage.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative imaging platform for phenotypic screening of genetic or compound libraries.
- Delivers standardized, high-throughput compatible datasets for downstream analysis.
- Enables robust assay development with minimized photobleaching and phototoxicity.
- Supports reliable evaluation of compound effects on ocular morphogenesis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns zebrafish ocular development with vertebrate disease models for translational relevance.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of developmental targets.
- Provides quantitative endpoints for assessing disease-relevant phenotypes and biomarker alignment.
- Supports risk-adjusted advancement of ophthalmic candidates based on in vivo developmental outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol integrates from early discovery through lead identification and preclinical validation in ophthalmic R&D pipelines.
- Discovery Biology: Quantitative 4D imaging supports hypothesis testing and pathway clarification in ocular development.
- Screening: Standardized imaging and analysis enable reproducible phenotypic screening and assay readiness.
- Analytics: Automated segmentation and feature extraction provide robust quantitative outputs for condition comparison.
- Translational Research: Disease-relevant zebrafish models bridge discovery and preclinical validation for ocular targets.
- Enterprise Reuse: The workflow is adaptable for diverse genetic, pharmacological, or environmental perturbation studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in ocular target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible imaging datasets for cross-team use.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient prioritization of ophthalmic programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and de-risking of early-stage ocular assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, transgenics, and advanced microscopy.
- Needs access to lightsheet microscopy and 4D image analysis infrastructure.
- Demands cross-team standardization of imaging and analysis parameters for reproducibility.
- Adaptable to other developmental models with appropriate genetic markers.
- Embryo orientation and imaging throughput may limit scalability for large screens.
