Name: 使用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜可视化眼部形态发生 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 了解利用光片显微镜对rx3:GFP转基因斑马鱼胚胎进行眼部形态发生时序成像的完整实验方案。该方法可实现高分辨率实时追踪视泡形成与眼原基发育动态，为研究脊椎动物正常及病理条件下眼球发育提供关键技术平台。

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本研究发表的工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）院长办公室资助（资助号 S10OD020067）以及 NIH 资助 R01EY021769（授予 A.C.M.）的支持。我们感谢 Doug Harrison 和 Jim Begley 在艺术 &amp;感谢肯塔基大学成像与科学中心，以及Lucas Vieira Francisco和Evelyn M. Turnbaugh在斑马鱼饲养方面提供的专业支持。

所有涉及斑马鱼使用的实验均按照肯塔基大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）制定的协议进行。
1. 样品制备
<ol>
	<li>在计划成像的前一晚，将一对 Tg(Rx3:GFP) 斑马鱼放入带隔板的交配缸中。次日早晨，在鱼房灯光开启时移开隔板34,35。 
	注意：所选交配的斑马鱼年龄应在4个月至2年之间，并可根据体型和体色轻松区分雌雄35。</li>
	<li>每隔半小时检查一次交配情况，观察是否有胚胎，并记录在交配缸底部首次观察到胚胎的时间。将胚胎转移至培养皿中，并在28.5 °C条件下维持约10小时，使其发育至1-2体节期（ss）。从1-2体节期（ss）开始进行成像。</li>
	<li>为筛选体节的存在，于受精后10小时（10 hpf）在体视显微镜下观察胚胎，并计数体节数量1。 
	注意：任何发育超过单个体节阶段的胚胎均不应用于本实验。</li>
	<li>在处于单个体节阶段的胚胎中，使用荧光适配器结合体视显微镜检测GFP表达，以确认Rx3:GFP转基因的存在。一旦鉴定出3-5个GFP阳性个体，使用精细镊子去除胚胎的卵膜，并用玻璃移液管将其转移至含有E3胚胎缓冲液的小培养皿中35。</li>
	<li>将胚胎转移至含有0.168 mg/mL Tricaine（MS222）的0.5 mL E3胚胎缓冲液（pH 7）中进行麻醉35,36。自发性肌肉运动最早可在受精后17小时（17 hpf）出现37。确保在超过该时间点后成像时胚胎已充分麻醉。</li>
	<li>将胚胎包埋于含0.168 mg/mL Tricaine和E3的1%低熔点琼脂糖中。 
	注意：该浓度的低熔点琼脂糖为最佳浓度，既能固定胚胎位置，又保持足够的柔韧性，允许胚胎在成像过程中继续生长30,31。</li>
	<li>配制10 mL含2%低熔点琼脂糖的E3缓冲液。使用微波炉以15秒为间隔加热溶解琼脂糖，防止溶液沸腾溢出。待溶液冷却至可手持但未凝固、且不会对胚胎造成伤害的温度。琼脂糖充分冷却后，向含Tricaine和E3的管中加入0.5 mL琼脂糖溶液，并轻轻吹打混合。</li>
	<li>使用1 mm玻璃毛细管和聚四氟乙烯（PTFE）推杆，将琼脂糖溶液中的胚胎吸入毛细管中。确保吸入总共3-5个胚胎（多个胚胎），以提高获得位置合适胚胎的概率。 
	注意：由于此阶段胚胎呈圆形，难以保证其在毛细管中的特定朝向。理想情况下，胚胎体部应侧向置于毛细管中，以便在显微镜下最方便地定位。</li>
	<li>在室温下静置30-60秒，使琼脂糖凝固。将毛细管置于盛有含0.168 mg/mL Tricaine的E3缓冲液的烧杯中，待成像时使用（图1A）。 
	注意：多余的2%低熔点琼脂糖溶液可任其凝固，后续实验中可重新加热使用。</li>
	<li>将毛细管放入样品 holder 中（图1B-F），操作如步骤2.5所述。</li>
</ol>
2. Zeiss Lightsheet Z.1 设置
<ol>
	<li>依次开启显微镜和计算机的各个组件，顺序如下：1）系统，2）PC，3）培养箱图2A).</li>
	<li>将20倍成像物镜和10倍照明物镜安装到显微镜腔室中。在Zen软件界面中匹配相应的物镜设置 维持 表格</li>
	<li>滑动腔室（图2C）插入轨道上的外壳中（图2B）使导管朝外。导管连接至右侧相应的端口，如图所示 图2E.</li>
	<li>使用鲁尔锁紧装置将延长管连接到注射器上（图 2D）；用E3中的Tricaine填充，并将其置于显微镜右侧的固定装置中35将连接至装有Tricaine的E3溶液注射器的延伸管通过鲁尔锁紧装置连接到腔室右下角。推动注射器推杆，使Tricaine/E3缓冲液充满腔室。关闭腔室门。</li>
	<li>将装有样品的毛细管放入毛细管样品架中。毛细管样品架由两个橡胶套、一个金属样品架圆盘、一根金属杆和一个金属帽组成。图1B）。将金属套管卡入金属圆盘的中心位置（图1C将两个橡胶塞插入套管中，使切口朝向套管末端，随后插入毛细管。将毛细管穿过两个橡胶塞的中心。当标记到达金属套管底部时，用金属帽固定。图1D).</li>
	<li>将毛细管样品架放置在显微镜顶部，使白色标记对齐（图1E，F）。盖上盖子。</li>
	<li>点击 定位毛细管 软件界面上的按钮（图3A）。使用 ErgoDrive 控制面板（一种控制毛细管方向的手动装置）图3E），移动毛细管并将其定位在物镜正上方（图3B).</li>
	<li>打开盖子，轻轻推动推杆，直至含有胚胎的琼脂糖部分悬于毛细管底部下方，并位于物镜前方图 3C).</li>
	<li>关闭 定位毛细管 并点击 定位样本 按钮（图3A）。这会将视图从样品室的网络摄像头切换到显微镜物镜（图3D）。使用此视图更精确地调整样品的位置。关闭 定位样本 (图3A).</li>
	<li>切换到 采集 选项卡。勾选相应的复选框 Z轴层扫 和 时间序列.</li>
	<li>在 采集模式 参数窗口中，选择 双侧光片 设置并勾选以下选项 在线双面融合 和 枢轴扫描.</li>
	<li>在 通道 窗口，选择 488 通道将激光功率设为1，曝光时间设为7.5 ms。</li>
	<li>接下来，点击 连续的 点击按钮以获取胚胎的实时图像。使用ErgoDrive控制面板调整胚胎位置，直至眼区正对摄像头。继续调节通道参数中的左右光片，直至眼区充分聚焦。</li>
	<li>设置 Z轴层扫 使用 ErgoDrive 控制面板调整参数，以在 Z 轴方向上移动。将第一个和最后一个 Z 位置设置在超出最后可检测到的荧光信号约 500 µm 的位置。这样可为眼区在延时成像过程中随着胚胎生长而保持在视野内留出空间。设置完 Z 层扫描范围后，点击 最佳 按钮，将步长设置为 0.477 µm，此为最佳设置。</li>
	<li>设置 孵育 通过勾选帕尔帖单元的复选框，将温度维持在 28 °C。在 时间序列 在窗口中选择采集图像的频率和时间间隔。本实验方案中，参数设置为每5分钟成像一次，共166个时间点。</li>
	<li>点击 开始实验 按钮。选择保存图像集的文件夹。设置图像前缀，然后点击 保存 开始成像。 
	注意：显微镜将按照指定的时间间隔依次运行每组图像采集。</li>
	<li>延时成像结束后，将载物台移至装载位置，取下毛细管样品架。按照与组装时相反的顺序拆卸毛细管样品架，并使用推杆将样品及多余的琼脂糖从毛细管中推出。打开成像室门，用注射器吸出成像室内的液体，断开并取下成像室，随后用水冲洗并自然风干。</li>
</ol>
3. 图像分析
<ol>
	<li>打开 arivis Vision4D 软件程序。</li>
	<li>点击 文件，然后选择 导入文件。选中延时成像实验中的所有 .czi 文件并打开。接下来会弹出一个窗口，提供文件导入选项；选择 Z-stacks as Frames，以按照获取顺序排列Z轴层叠图像。文件导入后，软件将保存为单个 .sis 文件。若要指定保存位置，请在点击 导入 前预先选择目标文件夹。</li>
	<li>文件导入完成后，arivis 即可开始渲染延时图像的视频。点击左下角的 4D 查看器立方体 和 比例尺 图标（图 4D-E）。点击视频图标，将故事板任务栏调至屏幕底部（图 4C）。</li>
	<li>在 故事板 任务栏中，选择 添加关键帧序列（图 4F）。设定视频时长（秒），取消勾选 创建旋转 选项，并勾选 使用时间进程，以在视频中包含特定时间点。软件会在 故事板 任务栏右侧显示这些参数，便于随时调整。可将故事板保存，以便将相同参数应用于多个图像集（图 4F）。</li>
	<li>点击 导出视频，保存延时成像的视频文件（图 4F）。设置视频导出参数，包括文件名和保存位置、视频格式（.mp4）、分辨率（1,080 p）、帧率（60 FPS）和数据分辨率（1,297 × 1,297 × 784）。如需，可在此添加时间戳。参数设置完成后，选择 录制（图 4F）。</li>
	<li>可重复步骤 3.4 和 3.5，但需对步骤 3.4 进行修改，以在特定时间点生成旋转视频。在向故事板添加关键帧序列时，勾选 创建旋转 选项，并取消勾选 使用时间进程，然后按照步骤 3.5 的相同说明操作。</li>
	<li>若需在任意时间点以任意方向渲染高分辨率图像，请在 4D 查看器中点击 相机 图标，以获取高分辨率图像（图 4C）。</li>
	<li>若要构建分析流程，请点击 烧瓶 图标，进入 分析 面板（图 4B）。在 分析 面板中，点击 分析操作 下拉菜单。例如，本方案以下展示的是体积分析流程的操作序列。可逐项运行或撤销流程中的每一步，以精细调节各参数（表 1）。</li>
	<li>点击流程顶部的蓝色三角形，以运行整个流程。 
	注意：所需时间取决于计算机性能。流程优化完成后，可轻松将其导出并在 arivis 中导入，用于批量分析多个数据集。</li>
	<li>如需进行批量分析，请在 分析 选项卡下点击 批量分析。</li>
	<li>流程运行完成后，会弹出一个窗口，列出所有检测到的对象。也可通过 表格 图标（图 4B）手动访问该窗口。在窗口顶部，点击标有 特征列 的框，以调出可用于描述目标对象的特征列表。对于眼区体积分析，这些特征包括表面积、体积（体积、体素数）、强度 #1（均值）、属性（ID、类型）和时间点（首次）。点击 导出，将数据导出至电子表格。</li>
</ol>

<ol><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
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<li>Pillai-Kastoori, L., Wen, W., Morris, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+an+eye+on+SOXC+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Keeping an eye on SOXC proteins.</a> Developmental Dynamics. 244, 367-376 (2015).</li>
<li>Rembold, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+cell+migration+serves+as+the+driving+force+for+optic+vesicle+evagination%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Individual cell migration serves as the driving force for optic vesicle evagination.</a> Science. 313, 1130-1134 (2006).</li>
<li>Loosli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+eyes+in+zebrafish+caused+by+mutation+of+chokh%2Frx+3%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Loss of eyes in zebrafish caused by mutation of chokh/rx 3.</a> EMBO Reports. 4 (9), 894-899 (2003).</li>
<li>Chuang, J. C., Mathers, P. H., Raymond, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+three+Rx+homeobox+genes+in+embryonic+and+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Expression of three Rx homeobox genes in embryonic and adult zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 84 (1-2), 195-198 (1999).</li>
<li>Cavodeassi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+stages+of+zebrafish+eye+formation+require+the+coordinated+activity+of+Wnt11%2C+Fz5%2C+and+the+Wnt%2F%CE%B2-catenin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early stages of zebrafish eye formation require the coordinated activity of Wnt11, Fz5, and the Wnt/β-catenin pathway.</a> Neuron. 47 (1), 43-56 (2005).</li>
<li>Ivanovitch, K., Cavodeassi, F., Wilson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precocious+acquisition+of+neuroepithelial+character+in+the+eye+field+underlies+the+onset+of+eye+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Precocious acquisition of neuroepithelial character in the eye field underlies the onset of eye morphogenesis.</a> Developmental Cell. 27 (3), 293-305 (2013).</li>
<li>Ebert, A. M., Childs, S. J., Hehr, C. L., Cechmanek, P. B., McFarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sema6a+and+Plxna2+mediate+spatially+regulated+repulsion+within+the+developing+eye+to+promote+eye+vesicle+cohesion%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Sema6a and Plxna2 mediate spatially regulated repulsion within the developing eye to promote eye vesicle cohesion.</a> Development (Cambridge). 141 (12), 2473-2482 (2014).</li>
<li>Emerson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+target+genes+downstream+of+semaphorin6A%2FplexinA2+signaling+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Identification of target genes downstream of semaphorin6A/plexinA2 signaling in zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 246 (7), 539-549 (2017).</li>
<li>Hehr, C. L., Halabi, R., McFarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+and+morphogenesis+of+the+eye+epithelium+requires+the+adhesion+junction+associated+adaptor+protein+Traf4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+and+Migration%22%5BJournal%5D)">Polarity and morphogenesis of the eye epithelium requires the adhesion junction associated adaptor protein Traf4.</a> Cell Adhesion and Migration. 12 (5), 489-502 (2018).</li>
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作者声明不存在竞争性财务利益。

在本实验方案中，使用光片显微镜对眼睛发育过程进行延时成像，并对获得的数据进行了分析。该数据集可为眼部形态发生过程以及由基因突变、药物处理或其他实验条件引起的过程扰动提供有价值的见解。本文展示了如何获取此类数据集，并举例说明了如何分析早期发育过程中眼区体积的变化。该数据在生物学重复样本中具有良好的可重复性和一致性（体积差异小于10%），但需注意，在成像开始前胚胎发育阶段的微小差异可能导致最终体积测量值存在一定变异。
在将胚胎初始放置于毛细管中以及将包埋的胚胎置于物镜前方时，应格外小心。正确的方向定位对于防止胚胎生长并移出物镜视野至关重要。在10小时受精龄（hpf）时，胚胎呈圆形，这使得在毛细管中精确保证特定方向具有挑战性。理想情况下，应使胚胎体侧朝向置于毛细管中。在毛细管中加载多个胚胎可提高获得方向合适胚胎的可能性。
在此操作中，需将胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，以使其悬浮于成像和照明物镜前方。选择合适浓度的低熔点琼脂糖至关重要：浓度过高会限制胚胎发育，导致其无法正常生长；浓度过低则会导致琼脂糖结构破裂，无法固定胚胎。本方案的最佳终浓度为1%低熔点琼脂糖30,31。
另一个需要考虑的因素是饱和度。随着眼区的生长和分化，Rx3:GFP 信号强度会逐渐增强。因此，在设定初始成像参数时，应降低曝光时间和激光功率，使图像处于欠饱和状态。这样可以防止随着 Rx3:GFP 信号随时间增强而导致图像过饱和。图像处理过程中可以对欠饱和进行校正，但一旦图像采集完成，过饱和则无法补救。
本研究未描述的方案中，还可进行一些额外的修改，可能对某些项目具有优势。例如，可以在图像采集设置中建立多视角（Multiview）成像。该参数允许在每个时间间隔内沿 y 轴不同位置依次对多个胚胎进行成像。尽管这会增加数据集的复杂性，但可提高数据采集速率。此外，在图像处理方面，也可通过其他参数对视泡区域进行量化。本文中，我们描述了如何以视泡区域体积为参数进行数据量化。此外，还可构建分析流程以量化和追踪单个细胞，或确定视泡外翻的速率。
如前所述，共聚焦显微镜和光片显微镜均已用于斑马鱼的延时成像研究。本项目特别选用光片显微镜，原因在于其具备优异的厚样本（&#62;1 mm）穿透成像能力，配备有孵育装置以维持斑马鱼胚胎的理想温度环境，并且其成像速度优于共聚焦显微镜，能够在本实验方案所需的多个时间点快速获取图像，同时不会对胚胎造成损伤或光漂白21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31。还需注意的是，该光片显微镜具备多荧光团信号的成像能力。本研究所使用的光片显微镜配备有405、445、488、515、561和638 nm的固态激光激发光源，适用于对表达多种荧光报告基因的转基因胚胎进行成像。
尽管本方案详细描述了使用Lightsheet Z.1双光源显微镜系统和arivis Vision4D分析软件进行图像采集与分析的具体操作步骤，但徕卡（Leica）、奥林巴斯（Olympus）和Luxendo等公司也生产其他商业化的光片显微镜，此外Imaris等图像分析软件同样可用于获得类似结果。本方案中所选用的设备和软件取决于本机构的现有条件。
总之，预计本方案将为使用光片显微镜进行斑马鱼早期眼发育的延时成像及图像定量分析提供一个可靠的起点。

胚胎发育是一个复杂的过程，需要多种不同事件的精确协调。脊椎动物眼睛的形成始于正在发育的前脑，其中一部分细胞被确定为眼区。这些细胞将向外突出至表面外胚层，形成两个双侧的视泡1,2,3,4,5,6,7,8,9,10。与表面外胚层的接触随后诱导视泡向内凹陷，形成视杯。表面外胚层将发育为眼睛的前部结构，例如晶状体和角膜，而视杯则将发育为神经视网膜和视网膜色素上皮1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12。该过程中的任何干扰都可能导致先天性缺陷，例如小眼畸形、无眼畸形和裂隙畸形（MAC）。目前尚无纠正这些缺陷的方法3,5,6,7,9,10,11,12。进一步研究眼器官形态发生机制以及可能导致MAC的问题，将为未来可能的治疗手段奠定知识基础。研究眼睛发育过程中细胞动态行为的一个有力工具是延时成像技术，该技术可实现对这一过程在活体内的实时可视化与特征分析 in vivo 和实时观察。
斑马鱼（Danio rerio）是利用延时成像技术观察早期眼部发育的优良模型。它们具有高度保守的脊椎动物眼睛结构，并具备快速、体外发育且在发育早期保持光学透明的特性1。由于这些哺乳动物模型所不具备的特征，斑马鱼为延时成像研究提供了极佳的资源。转基因斑马鱼品系 Tg(rx3:GFP) 的应用极大促进了对斑马鱼眼部发育的延时成像研究13。Rx3（视网膜同源框蛋白 3）是一种对眼部发育至关重要的转录因子14。在斑马鱼的三个 rx 基因中，rx3 是最早表达的基因，其表达始于原肠胚中期，约在受精后 8 小时（hpf）15,16。从约受精后 10 小时的 1 体节期（ss）开始，可在发育中的前脑中观察到 rx3:GFP 转基因的表达15,17,18,19,20。在前脑发育过程中，rx3:GFP 的表达标记了单一视域细胞，而 GFP（绿色荧光蛋白）的表达将持续贯穿整个眼器官形态发生过程。因此，对 rx3:GFP 表达进行高分辨率的延时成像，使我们能够随时间追踪单一视域发育为视网膜的全过程17,18,20。
斑马鱼发育的延时成像研究主要采用共聚焦显微镜或光片显微镜进行。共聚焦显微镜的优势在于能够沿z轴对样品进行精确成像，并减少荧光背景信号。然而，该方法受限于图像采集所需时间较长、样品位置固定以及容易导致活体样品发生光漂白和光毒性。光片显微镜是一种理想的长时间观察眼部形态发生的方法，因其具备穿透较厚样品进行荧光成像的能力、更高的样品取向灵活性、更小的光漂白和光毒性效应，以及高速成像能力21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31。当前光片显微系统可达到的空间分辨率约为250–500纳米（nm）。尽管该分辨率与共聚焦显微镜所能获得的分辨率无显著差异，但样品可自由旋转并从多个角度成像，从而提高了成像深度和分辨率，相比共聚焦平台为活体延时成像实验提供了更大的灵活性27,32。基于上述原因，光片显微镜正迅速成为斑马鱼发育延时成像研究的首选方法。本实验方案描述了利用商用光片显微镜对Rx3:GFP转基因斑马鱼进行成像以定量分析眼器官发生的步骤33&#160;，并详细介绍了使用arivis软件平台进行图像分析的流程。

<table><tbody><tr><td>60 mL 注射器，鲁尔锁扣式接头</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>低熔点琼脂糖</td><td>Promega</td><td>V2111</td><td></td></tr><tr><td>arivis Vision4D 软件</td><td>arivis</td><td>https://www.arivis.com/zh/imaging-science/arivis-vision4d</td><td></td></tr><tr><td>Dumoxel N3C 镊子</td><td>杜蒙</td><td>0203-N3C-PO</td><td></td></tr><tr><td>E3 鱼缓冲液（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，0.33 mM MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管 &amp;ndash; 大小 2（约 1 mm）</td><td>Zeiss</td><td>黑色/701904</td><td></td></tr><tr><td>海德堡延长线 100厘米</td><td>B. Braun</td><td>4097262</td><td></td></tr><tr><td>光 &amp;和滤光片组 &amp;ndash; 皇家蓝</td><td>夜海</td><td>SFA-LFS-RB</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 × 15 mm）</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜荧光适配器</td><td>NightSea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>特氟龙尖端活塞 &amp;ndash; 2号</td><td>Zeiss</td><td>#701997</td><td></td></tr><tr><td>Tg(rx3:GFP) 斑马鱼</td><td></td><td>该细胞系由 Rembold 等人建立。&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine（MS222）</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Z.1 光片显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen 软件</td><td>蔡司</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</td><td></td></tr></tbody></table>

利用rx3:gfp转基因斑马鱼通过光片显微镜观察眼部形态发生过程

Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

脊椎动物的眼睛发育是一个复杂的过程，始于胚胎原肠胚形成末期，需要细胞迁移、增殖和分化的精确协调。时间推移成像技术为观察眼睛发育过程中细胞的行为提供了独特的视角，因为它使我们能够在活体中可视化眼器官的形成过程。由于斑马鱼具有高度保守的脊椎动物眼睛结构，并且能够在体外快速发育的同时保持光学透明性，因此是观察这一过程的理想模型。利用转基因斑马鱼品系 Tg(rx3:GFP) 可极大促进对斑马鱼眼睛发育的时间推移成像研究。在发育中的前脑中，rx3:GFP 的表达标记了单一眼区的细胞，随着眼区外翻形成视泡，随后内陷形成视杯，GFP 的表达持续存在。因此，对 rx3:GFP 表达进行高分辨率的时间推移成像，使我们能够随时间追踪视网膜原基的发育过程。由于光片显微镜具备穿透较厚样本进行荧光成像的能力，同时可最大限度减少光漂白和光毒性，并实现高速成像，因此是长时间观察眼部形态发生的理想方法。本文提供了一套使用市售光片显微镜及图像处理工作站对眼部形态发生进行时间推移成像并分析所得数据的&#160;方案&#160;，&#160;详细描述了胚胎麻醉、包埋于低熔点琼脂糖、在成像腔室中悬浮、设置成像参数，以及最终使用图像分析软件处理成像数据的操作步骤。该方法获得的数据集可为眼部形态发生过程本身，以及因基因突变、药物处理或其他实验干预对该过程造成的扰动提供宝贵的科学见解。

此处显示的数据集采用上述方案进行成像。对一个 Tg(Rx3:GFP) 胚胎从1体节期（ss）至24小时（hpf）进行了连续成像，总时长为14小时，图像采集间隔为5分钟。延时成像便于轻松选择和比较显示感兴趣表型的任意时间点。图5展示了从背侧视角在选定发育时间点生成的一系列高分辨率图像。在 arivis Vision4D 中运行的分析流程构建了一个掩膜（mask），用于标识由荧光信号所显示的正在发育的眼结构。在图5以及视频1–6中，该掩膜可与发育中眼睛的荧光渲染图像进行对比观察。此外，表 2列出了在每次成像时间点所获取的发育中眼睛的体积数据。该数据集包括片段名称、编号、体积（单位为 µm3 和体素数量）、目标的平均荧光强度、目标被识别的时间点，以及目标的表面积（单位为 µm2）。需要注意的是，当眼区在第64个时间点开始分裂为两个视泡时，在前脑中仍存在第三个呈 Rx3:GFP 阳性的区域，该区域将参与下丘脑的形成38,39,40（图5D–M）。这一区域在表2的体积数据中有所体现（从第71个时间点起以黄色高亮显示），由于其体积远小于任一视泡，因此可轻松将其与视泡区分开来。
<img alt="色谱装置：用于紫外-可见吸收光谱分析的组件组装示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：样品制备。（A）胚胎在玻璃毛细管中的放置位置。箭头指向毛细管中的一个胚胎。（B）玻璃毛细管和毛细管支架的部件。（C）部分组装的毛细管支架。（D）完全组装好的毛细管支架。（E）光片显微镜安装腔室。箭头指示用于确定毛细管支架方向的白线。（F）正确安装在光片显微镜中的毛细管支架。箭头显示对齐的白线，表明毛细管支架已正确取向。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静态平衡装置；光学元件；光子测量示意图；光谱学设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：光片成像装置示意图。（A）用于开启光片显微镜、计算机和培养单元的控制面板。数字表示操作顺序。（B）光片显微镜物镜腔室。（C）成像腔室。（D）将与成像腔室连接的注射器和管路。（E）成像腔室已正确放置于物镜腔室内，所有管路均连接至右侧相应接口。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显微成像流程图；毛细管中的样本处理；神经科学成像系统搭建与分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3样品放置。 (A) 定位毛细管 和 定位样本 Zen软件中的按钮，如箭头所示。B) 玻璃毛细管的位置。箭头指示的是位于物镜镜头正上方的玻璃毛细管边缘。C) 胚胎悬液超出玻璃毛细管。箭头指示位于物镜前方玻璃毛细管下方琼脂糖中悬浮的胚胎。D通过物镜观察胚胎。EErgoDrive 控制面板 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于数据处理与可视化的科学软件界面图标；工具栏按钮标注 A-F。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：arivis Vison4D 导航中的重要图标。 每个面板从左到右依次标明图标的对应功能。(A) 打开、保存、关闭。(B) 分析面板、显示对象表、打开轨迹编辑器。(C) 将当前视图内容以图像形式复制到剪贴板、切换书签、为当前视图创建高分辨率图像、切换故事板。(D) 显示测量框、显示方向十字、显示图例、显示比例尺。(E) 以二维视图显示、以画廊视图显示、以四维视图显示、以信息视图显示、以投影视图显示。F) 刷新所有关键帧、添加关键帧、添加关键帧序列、插入关键帧、移除所有关键帧、导出视频、加载故事板、保存故事板、调整整个视频的目标时间、首关键帧、播放、暂停、停止、末关键帧。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎发育显微图像序列；三维神经解剖重建；荧光成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：高分辨率图像与眼区掩膜。（A-M）从背侧视角渲染的一组高分辨率图像；（A'-M'）每个对应时间点的眼区掩膜。每组图像均标注了成像开始后的时间以及相应的发育阶段，以体节期（ss）或受精后小时（hpf）表示。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：Tg(rx3:GFP) 斑马鱼胚胎从 1 体节期至 24 小时受精后的时间推移视频。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video1_timelapse_rx3-GFP_1ss-24hpf%20MED%20RES.mov" target="_blank">请右键单击此处下载视频（另存链接为）。</a>
视频 2：Tg(rx3:GFP) 斑马鱼胚胎从 1 体节期到 24 hpf 的延时视频，其中视区由 arivis Vision4D 分析流程识别。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video2_timelapse_rx3-GFP_eyefieldmask_1ss-24hpf%20MED%20RES.mov" target="_blank">请右键单击此处下载视频（另存链接为）。</a>
视频 3：Tg(rx3:GFP) 斑马鱼胚胎在 1 体节期（1 ss）的 360° 旋转图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video3_360-rotation_rx3-GFP_1ss(1).mp4" target="_blank">请右键单击此处下载视频（另存为链接）。</a>
视频 4：1 体节期 Tg(rx3:GFP) 斑马鱼胚胎眼区掩模的 360° 旋转。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video4_360-rotation_rx3-GFP_eyefieldmask_1ss.mp4" target="_blank">请右键点击此处下载视频（另存链接为）。</a>
视频 5：24 小时受精后 Tg(rx3:GFP) 斑马鱼胚胎的 360° 旋转。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video5_360-rotation_rx3-GFP_24hpf.mp4" target="_blank">请右键单击此处下载视频（另存链接为）。</a>
视频 6：24 小时受精后 Tg(rx3:GFP) 斑马鱼胚胎眼区掩膜的 360° 旋转图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video6_360-rotation_rx3-GFP_eyefieldmask_24hpf.mp4" target="_blank">请右键单击此处下载视频（链接另存为）。</a>
表1：用于发育中眼区体积分析的 arivis Vision4D 分析流程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Table1%20revised.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：通过arivis Vision4D获取的发育中视场的体积与表面积。与假定下丘脑相关的行以黄色高亮显示，以区别于视泡。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Table2(2).xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格</a>。

此处，一种&#160;方案是&#160;提供&#160;使用市售的光片显微镜和图像处理工作站对眼球形态发生过程进行延时成像，并分析所得数据。本方案详细描述了胚胎麻醉、包埋于低熔点琼脂糖、在成像腔室中悬浮、设置成像参数，以及最终利用图像分析软件对成像数据进行分析的操作步骤。&#160;

利用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜观察眼部形态发生过程

脊椎动物眼睛的发育是一个复杂的过程，始于胚胎原肠胚形成末期，需要细胞迁移的精确协调，……

本方案在正常和病理条件下，均可提供关于眼球形态发生过程的可视化和实时信息。本方案能够快速获取z轴堆叠图像，从而减少数据集中每幅三维图像之间的时间间隔，进而提高对眼球形态发生过程的时间分辨率。由于胚胎在单体节阶段呈球形，将其在毛细管中定位可能具有挑战性，因此需要将多个胚胎装入毛细管中，以确保至少有一个胚胎处于正确方向。为在受精后10小时筛查体节的存在，将胚胎置于体视显微镜下，并使用荧光适配器确认rx3:GFP转基因的存在。一旦鉴定出3至5个GFP阳性的单体节胚胎，即使用精细镊子去除胚胎的卵膜。为了将胚胎包埋在琼脂糖中，将胚胎转移至含有500微升E3胚胎缓冲液的微量离心管中，该缓冲液中添加了168微克/毫升的三卡因，并加入500微升冷却但仍为液态的2%低熔点琼脂糖与E3缓冲液的混合液，轻轻混匀。使用带有PTFE推杆的1毫米玻璃毛细管，将包埋有琼脂糖的胚胎吸入毛细管中，在室温下静置30至60秒，使琼脂糖凝固。然后将毛细管放入盛有添加三卡因的E3缓冲液的烧杯中。为建立用于胚胎成像的光片显微镜系统，将毛细管插入毛细管样品架中，并将金属套管卡入样品架金属圆盘中心。将两个橡胶塞插入套管中，使切口朝向套管两端，并将毛细管穿过两个橡胶塞的中间。当标记到达金属套管底部时，使用金属盖帽固定毛细管，并将样品架放置在显微镜顶部，使白色标记对齐。关闭样品架的盖子，然后在显微镜软件界面中点击定位毛细管按钮。使用Ergo Drive控制面板，将毛细管移至物镜正上方。打开盖子后，轻轻推动推杆，直至含有胚胎的琼脂糖部分悬垂于毛细管底端前方，并位于物镜前方。关闭定位毛细管，点击定位样品，将视图从样品室网络摄像头切换至显微镜物镜，并使用此视图更精确地调整样品位置。然后关闭定位样品功能，切换至采集选项卡。勾选z轴层扫和时间序列选项。在采集模式参数窗口中，选择双侧光片设置，并勾选在线双侧融合和摆动扫描选项。点击连续采集以获得胚胎的实时图像。在通道窗口中，选择 488 通道，并将激光功率设置为 1，曝光时间为 7.5 毫秒。使用 Ergo Drive 控制面板调整胚胎位置，使眼区正对相机，并在通道参数中调节左右光片，直至眼区充分聚焦。将第一和最后一个 z 轴位置设置在可检测到荧光信号的范围之外约 500 微米处，然后单击“最优”以将步长设为 0.477 微米。设置孵育参数时，勾选帕尔帖装置的选项框，以保持 28 摄氏度的温度。在时间序列窗口中，选择适当的实验频率和时间间隔以采集图像。单击“开始实验”。选择用于保存图像集的文件夹并设置图像前缀，然后单击“保存”以开始成像。进行图像分析时，将图像文件导入合适的4D图像分析软件程序，点击4D查看器立方体、比例尺和视频图标以打开故事板任务栏。选择添加关键帧序列，并以秒为单位指定视频的持续时间。取消勾选创建旋转框，勾选使用时间进程，以在视频中包含特定的时间点。保存故事板，以便将相同的参数应用于多个图像集。单击“导出视频”以保存延时成像的视频，并指定视频导出设置，包括文件名和保存位置、视频格式、视频分辨率、帧率、数据分辨率。如需可添加时间戳，然后选择录制。若要在特定时间点创建旋转视频，请按上述方法添加关键帧序列，但需勾选“创建旋转”选项，同时取消勾选“使用时间进程”选项。如需在任意方向和任意单个时间点渲染高分辨率图像，请在4D查看器中选择相机图标。要构建分析流程，请选择烧瓶图标以进入分析面板，并打开分析操作菜单，选择所需的分析操作序列。单击蓝色三角形以启动分析流程。运行结束后，在弹出窗口中单击特征列，查看可提供有关目标对象信息的特征列表，然后单击“导出”将数据导出至电子表格。在此代表性分析中，从体节形成阶段到受精后24小时，每隔五分钟从背侧视角对一个转基因 rx3:GFP 胚胎进行成像，共计14小时。如所观察到的，对本次分析中获取的图像进行流程化处理，有助于生成发育中眼睛的掩膜。需要注意的是，当眼区分离为两个视泡时，可在前脑中观察到第三个表达rx3:GFP的区域，该区域参与下丘脑的形成。该信息同样可在体积数据中观察到，并且由于其体积明显小于任一视泡，因此可轻松地将该区域的数据与视泡数据区分开来。此操作可进一步结合其他分析，例如，在图像数据集中追踪单个细胞。

visualizing-ocular-morphogenesis-lightsheet-microscopy-using-rx3gfp

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Developmental Biology

发育生物学

使用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜可视化眼部形态发生

在本视频中，提供了多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。延时成像用于监测多种目标细胞类型的行为...

多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

来源：Williams, A. L., et al. 利用多光子延时成像技术实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移的神经嵴细胞的可视化. J. Vis. Exp.

利用多光子延时成像技术观察斑马鱼胚胎中神经嵴细胞的迁移

实验数据的可视化已成为向科学界展示研究成果的关键要素。对发育中的胚胎进行活体延时成像，有助于更清晰地展示和理解复杂的发育过程。本实验方案提供了通过光转化斑马鱼中Kaede蛋白实现细胞标记的逐步操作指南。...

利用延时共聚焦显微镜观察 sox10:kaede 转基因斑马鱼品系中的颅面发育过程

当胚胎被包埋在低浓度琼脂糖的光学透明聚合物管中时，可通过光片显微镜在数天内连续观察斑马鱼的发育过程。...

斑马鱼长期光片显微镜成像的多层封片技术

光片荧光显微镜是成像胚胎发育的优秀工具，能够在接近生理条件下对活体胚胎进行长时间的延时成像。我们展示了其在跨越广泛时空尺度下斑马鱼眼部发育成像中的应用，并提供了一套多视角数据集融合与去卷积的处理流程。...

利用光片荧光显微镜成像斑马鱼眼睛发育过程

结合激光扫描显微镜的先进光学技术与长波长多光子荧光激发，对 Tg(sox10:EGFP) 和 Tg(foxd3:GFP)...

多光子延时成像实时可视化发育过程：斑马鱼胚胎中迁移性神经嵴细胞的可视化

本文介绍了一种在斑马鱼中以四维（4-D）方式可视化心脏发育的实验方案。通过光片荧光显微镜（LSFM）进行的4-D成像，可在时间序列上获取三维（3-D）图像，从而重建发育中心脏的动态过程。我们通过定性和定量分析表明，剪切应力在心腔发育过程中可激活心内膜的Notch信号通路，进而促进心脏小梁化。...

利用光片荧光显微镜捕捉调控剪切应力对斑马鱼心脏发育影响的四维图像

本文介绍了一系列标准化的实验方案，用于观察新近发现的脊椎动物眼球中一种在进化上保守的结构——眼上沟。利用斑马鱼幼体，我们展示了识别参与眼上沟形成与闭合因素所必需的技术方法。...

上眼眶沟的可视化 斑马鱼 胚胎发生

活体成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜实时观察斑马鱼发育过程中大量多色Brainbow标记细胞的技术。...

利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

本方案描述了一种对斑马鱼早期眼部发育进行整体标记和多维成像的方法。我们介绍了利用激光扫描共聚焦显微镜进行标记、包埋和四维（4D）成像的操作步骤，并讨论了优化数据采集的注意事项，以深入解析视杯形态发生机制。...

斑马鱼视杯形态发生的四维成像

本文介绍了如何通过手术从活体斑马鱼幼体中摘除眼球，作为研究视网膜输入如何影响视顶盖生长与发育的第一步。此外，本文还提供了幼体麻醉、固定和脑组织解剖的方法，并进一步介绍了免疫组织化学染色和共聚焦成像技术。...

活体斑马鱼幼鱼眼球摘除以研究视觉系统发育和生长对神经支配的依赖性

了解利用光片显微镜对rx3:GFP转基因斑马鱼胚胎进行眼部形态发生时序成像的完整实验方案。该方法可实现高分辨率实时追踪视泡形成与眼原基发育动态，为研究脊椎动物正常及病理条件下眼球发育提供关键技术平台。

利用rx3:GFP转基因斑马鱼通过光片显微镜观察眼部形态发生过程

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