Name: 从人多能干细胞中定向诱导视网膜类器官 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 了解从人多能干细胞定向诱导视网膜类器官的高效实验方案，优化感光前体细胞的分化效率。该方法为视网膜疾病建模、药物筛选及细胞移植治疗提供可靠的体外研究平台。

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我们感谢502实验室成员在技术方面提供的支持以及对稿件提出的有益意见。本工作部分得到了北京市自然科学基金（Z200014）和国家重点研发计划&amp;中国国家重点研发计划（2017YFA0105300）。

本研究经首都医科大学附属北京同仁医院机构伦理委员会批准。H9 人胚胎干细胞（hESC）购自 WiCell 研究所，并通过基因工程改造为 tdTomato 标记的细胞系。
1. 人类视网膜类器官的生成
<ol>
	<li>在无饲养层条件下培养 hESC。
	<ol>
		<li>按照生产商说明书，用 1 mL 浓度为 0.1 mg/mL 的试剂 A（材料表）在 37 °C 下对 6 孔板的一个孔进行包被，至少孵育半小时。解冻一份含有 1×106 个 hESC 的细胞冻存液。 
		注意：准备 3 mL 预热的试剂 B（材料表），将冻存细胞（1 mL）转移至 3 mL 新鲜培养基中。不要将 hESC 吹打成单细胞悬液。</li>
		<li>以 200 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将细胞以 2 mL 试剂 B 接种至经试剂 A 包被的孔板中，每天更换 2 mL 试剂 B。当细胞融合度达到约 80% 时（通常约 4 天）进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 0 天
	<ol>
		<li>使用培养基 I（表 1）将 hESC 解离为单细胞悬液。通过混合以下成分配制培养基 I：20%（v/v）KnockOut 血清替代物（KSR）、0.1 mM MEM 非必需氨基酸溶液（NEAA）、1 mM 丙酮酸、3 µM IWR-1-endo（IWR1e）、30 ng/mL COCO、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素（PS）、0.1 mM β-巯基乙醇，以及格拉斯哥鹰氏最低必需培养基（GMEM）。 
		注意：在开始解离前，准备培养基 I，并将含 20 µM Y-27632 的 12 mL 培养基 I 转移至一个 10 cm 培养皿中，另将含 0.05 mg/mL 试剂 D（材料表）和 20 µM Y-27632 的 500 µL 试剂 C（材料表）加入一个 1.5 mL 离心管中。上述操作需在避光条件下进行，因为培养基 I 中的组分 IWR1e 对光敏感。</li>
		<li>用预热的 1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤 hESC。</li>
		<li>加入已准备好的 500 µL 试剂（置于 1.5 mL 管中），在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 hESC 3.5 分钟。</li>
		<li>轻敲培养板侧壁和底部数秒使细胞脱落，然后从培养皿中取出 500 µL 已准备的培养基 I 加入 hESC 培养板中。 
		注意：准备一个含 900 µL 1×DPBS 的 1.5 mL 管，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
		<li>将细胞收集至一个新的 1.5 mL 管中，上下吹打细胞悬液，然后从中取出 100 µL，加入含 900 µL DPBS 的计数管中用于细胞计数。</li>
		<li>将剩余的 900 µL 细胞悬液分散，并用培养皿中已准备的培养基 I 稀释至 9×104 个细胞/mL。 
		注意：总体积为 12 mL；共需 1.08×106 个细胞。</li>
		<li>将 100 µL 细胞悬液加入非黏附性 V 型底 96 孔板（材料表）的每孔中。 
		注意：使用多通道移液器以缩短操作时间，并确保每孔含有相等数量的细胞。每次取 100 µL 前需轻轻摇晃培养皿。确保细胞均匀分布至关重要。</li>
		<li>将 96 孔板在低速振荡器上轻柔离心 5 分钟，然后在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育。 
		注意：将培养板置于避光环境中。将该日记为第 0 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 2 天
	<ol>
		<li>加入 1% 试剂 A（材料表）。通过将 133.4 µL 试剂 A 加入 2 mL 培养基 I 中配制试剂 A（蛋白浓度为 10 mg/mL）。 
		注意：使用前需将试剂 A 在 4 °C 下过夜保存，以确保完全且均匀融化。请注意产品信息，并在公司官网查询目录号和批号，以确认每瓶试剂 A 的蛋白浓度，因为不同批次的蛋白浓度可能不同。若蛋白浓度较低，可适当增加试剂 A 的体积。</li>
		<li>向每孔加入 20 µL 已配制的试剂 A，并在孔中央吹打两次以分散死细胞。 
		注意：操作过程中需保持试剂 A 和 96 孔板处于低温环境，所有步骤均需在冰上完成。将培养板置于避光环境中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 2–12 天
	<ol>
		<li>清洁 96 孔板底部，在 37 °C 和 5% CO2 条件下继续孵育至第 6 天。第 6 天时，通过从每孔中移除 58 µL 培养基并加入 60 µL 培养基 I，更换一半培养基。 
		注意：使用多通道移液器完成半量换液操作。操作需轻柔，确保不将细胞团块从孔中移除。将吸出的培养基转移至一个洁净的 10 cm 培养皿中。若其中有细胞团块，应将其重新加回 96 孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 12–18 天
	<ol>
		<li>第 12 天将培养基更换为培养基 II（表 1）。通过以下成分配制含 1%（v/v）试剂 A 的培养基 II：10% 胎牛血清（FBS）、0.1 mM NEAA、1 mM 丙酮酸、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、0.1 mM β-巯基乙醇、100 nM SAG 二盐酸盐以及 GMEM。储存于低温避光环境中。</li>
		<li>从 96 孔板中收集细胞团块至一个 15 mL 圆锥形离心管中，在室温下静置 5 分钟使其自然沉降。 
		注意：轻柔地从液面下移除上清液和团块，避免产生气泡。</li>
		<li>小心处理类器官的同时移除上清液。将细胞聚集体转移至含 18 mL 已配制培养基 II 和试剂 A 的 10 cm 悬浮培养皿中。 
		注意：不要提前将已配制的培养基 II 加入 10 cm 培养皿中，因为试剂 A 应保持在 4 °C。</li>
		<li>在 37 °C 和 5% CO2 条件下继续孵育至第 18 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第 18 天及以后
	<ol>
		<li>将培养基更换为培养基 III（表 1）。在避光条件下配制培养基 III，混合以下成分：10% FBS、1×补充剂 1、0.5 µM 视黄酸（RA）、100 µM 牛磺酸、100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素，以及 1:1 混合的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）/营养混合物 F-12。</li>
		<li>第 18 天，当半透明的视泡结构形成后，使用显微外科刀切割类器官。 
		注意：通常在含培养基 II 的培养皿中将类器官切割为四块。每一块将在接下来的数周内发育为一个完整的视杯结构。</li>
		<li>将所有团块聚集至培养皿中央。将细胞收集至一个 15 mL 圆锥形离心管中，静置自然沉降，然后轻柔移除上清液。 
		&#8203;注意：由于类器官尺寸较大，可通过在水平面上单向旋转培养皿约 90° 数次，使其聚集至中央。</li>
		<li>将团块悬浮并分散至两个 10 cm 培养皿中，每皿加入 18 mL 培养基 III，轻柔转移至培养箱中以避免细胞聚集。继续在 37 °C 和 5% CO2 条件下使用培养基 III 培养，并每周更换一次培养基。在第 45 天至第 120 天之间可检测到 CRX 的表达，以及光感受器外节段的形成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分析人类类器官
<ol>
	<li>流式细胞分析
	<ol>
		<li>使用剪切过的1 mL枪头从培养皿中收集三个CRX-tdTomato和三个H9 ES来源的类器官。用1 mL预温（室温）的DPBS洗涤类器官。</li>
		<li>通过将0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液与0.05 mg/mL试剂D混合，制备消化缓冲液。</li>
		<li>使用制备好的消化缓冲液在37 °C下消化8分钟，将类器官解离为单细胞。然后加入等体积含10% FBS和0.05 mg/mL试剂D的DPBS以终止反应。</li>
		<li>轻轻重悬并分散细胞，随后使用100 µm细胞筛过滤，并使用荧光激活细胞分选（FACS）系统在561 nm激发激光线和780/60滤光片条件下分析CRX-tdTomato阳性信号。 
		注意：CRX在第45天开始表达，并随着类器官的成熟而增加。每次时间点每个样本检测一万个细胞，至少完成三次重复实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜类器官荧光强度定量
	<ol>
		<li>随机选取存活良好的类器官进行成像。 
		注意：设定参数时，所有荧光强度检测均需使用相同的滤光片和参数设置。</li>
		<li>采集图像，并使用合适的软件（例如ImageJ）分析平均荧光强度。</li>
		<li>导入图像后，通过图像 | 类型将其转换为8位图像。</li>
		<li>通过图像 | 调整 | 阈值使用默认参数调整阈值。</li>
		<li>确定测量区域后，使用分析 | 测量评估灰度值。 
		注意：结果面板中的平均值即为所测区域的平均荧光强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247(2020).</li>
<li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li>
<li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li>
<li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP%2C+TGFbeta+and+Wnt+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li>
<li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).</li>
<li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).</li>
<li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li>
<li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286(2015).</li>
</ol>

视网膜类器官分化是一种理想的、可大量生成功能性视网膜细胞的方法。视网膜类器官（RO）是由多能干细胞向神经视网膜分化而形成的复合结构，包含多种视网膜细胞，如神经节细胞、双极细胞和光感受器细胞4,5,8,9。尽管可以收获融合生长的视网膜类器官，但该过程耗时较长，可能需要长达180天的培养周期。然而，在进行光感受器细胞移植或研究锥-杆细胞或杆-锥细胞营养不良时，能够在三维培养系统中获得相对较高比例的光感受器细胞将具有显著优势10。
在不干扰类器官正常发育过程的前提下，监测其发育进程也具有挑战性。因此，我们选用CRX（锥杆同源盒蛋白）作为目标基因，用于追踪光感受器前体细胞在三维分化过程中的发育轨迹。CRX主要在光感受器前体细胞中表达。利用tdTomato系统，可通过红色荧光对表达CRX的细...

多能干细胞（PSCs）具有自我更新能力，并能分化为各种体细胞。因此，源自多能干细胞的类器官已成为再生医学研究的重要资源。视网膜变性疾病的特征是感光细胞（视杆细胞和视锥细胞）以及视网膜色素上皮细胞的丧失，而视网膜细胞替代治疗可能为该疾病带来希望。然而，获取人源视网膜组织用于疾病研究和治疗并不可行。因此，源自多能干细胞的视网膜类器官（ROs）能够有效且成功地模拟多层天然视网膜细胞，对基础研究和转化研究均具有重要意义1,2,3。本研究聚焦于视网膜类器官的分化，旨在为视网膜变性研究提供充足且高质量的细胞资源4。
用于类器官（ROs）分化的技术方法不断涌现，其中三维（3D）悬浮分化技术由Sasai实验室于2012年首次建立5。我们在人胚胎干细胞（hESCs）中引入了CRX-tdTomato标记，以特异性追踪光感受器前体细胞，并在原有方法基础上添加了COCO——一种针对Wnt、TGF-β和BMP信号通路的多功能拮抗因子6。研究表明，COCO可显著提高光感受器前体细胞及视锥细胞的分化效率6,7。
通过改进经典分化方法，我们建立了一种简便的方案，可从人类视网膜类器官中大量获取光感受器前体细胞和视锥细胞，用于在实验室研究中分析与光感受器相关的视网膜疾病，并进一步应用于临床治疗或细胞移植。

<table><tbody><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>COCO</td><td>R&amp;D Systems</td><td>3047-CC-050</td><td>BMP拮抗剂DAN结构域家族</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS），适用于人胚胎干细胞</td><td>Biological Industry</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut血清替代物-多物种</td><td>Gibco</td><td>A3181502</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）</td><td>sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Primesurface 96 V-板</td><td>Sbio</td><td>MS9096SZ</td><td>1.2.7步骤中的细胞聚集</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>试剂A</td><td>BD</td><td>356231</td><td>1.1.1步骤中的Matrigel</td></tr><tr><td>试剂B</td><td>StemCell</td><td>5990</td><td>1.1.2步骤中的mTeSR-E8，PSC基础培养基</td></tr><tr><td>试剂C</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>1.2步骤中的TrypLE Express</td></tr><tr><td>试剂D</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td>1.2步骤中的DNase I</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625-100MG</td><td></td></tr><tr><td>SAG</td><td>Enzo Life Science</td><td>ALX-270-426-M001</td><td></td></tr><tr><td>补充剂1</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2补充剂（100倍浓缩），液体，用于III号培养基</td></tr><tr><td>牛磺酸</td><td>Sigma</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>2.1.3步骤中的类器官解离</td></tr><tr><td>Wnt拮抗剂I，IWR-1-endo - Calbiochem</td><td>Sigma</td><td>681669</td><td>Wnt抑制剂</td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

视网膜细胞移植是一种前景广阔的治疗策略，有望重建退化视网膜的结构，并稳定甚至改善其视觉功能。然而，目前细胞替代疗法的发展仍面临挑战，其中之一是需要一种即用型、高质量且标准化的人类视网膜来源。因此，实验亟需一种简便且稳定的方案。本文中，我们开发了一种优化的方案，该方案基于自组织方法，结合外源性分子和试剂A的使用，并辅以人工切除，以生成三维人视网膜类器官（RO）。由人多能干细胞（PSCs）衍生的视网膜类器官表达光感受器特异性标志物。通过添加多功能拮抗剂COCO，光感受器前体细胞及视锥细胞的分化效率显著提高。该系统兼具细胞系与原代细胞的优势，同时避免了原代细胞来源受限的问题，可高效产生融合的视网膜细胞，尤其是光感受器细胞。因此，PSCs向视网膜类器官的分化提供了一个理想且具有生物学相关性的平台，可用于疾病建模、药物筛选以及细胞移植研究。

示意图展示了通过COCO提高前体细胞的分化方案（图1）。从PSC到ROs的过程中，许多细节都可能导致结果差异。建议记录每一步操作，甚至每种培养基的目录号和批号，以便追踪整个实验流程。
本研究提供了第6、12、18和45天的明场图像（图2）。在第6天，类器官在96孔板中直径通常约为600 µm，内部结构致密，边缘明亮（图2A）。第12天时，开始出现视泡样结构（图2B）。从第12天到第18天，视泡样结构更加明显，并在第18天后继续生长。缺乏泡状结构的类器官应予以弃用（图2C）。至第30天，泡样结构更为显著，可较容易地区分背侧视杯类器官与腹侧视杯类器官（图2D-E）。失去透明结构的类器官（<stron...

采用自组织方法，我们开发了一种通过添加COCO显著提高感光细胞生成的方案。

视网膜细胞移植是一种具有前景的治疗策略，有望恢复视网膜结构，并稳定甚至改善视觉功能。

这是一种视网膜疾病的模型，可模拟体内视网膜。在一定程度上，它可替代动物实验。该方案针对视网膜类器官中光感受器前体细胞的数量和质量进行了优化，而光感受器是多种不可逆致盲疾病的关键所在。首先，在无饲养层条件下培养人胚胎干细胞（hESCs）。具体操作如下：用1毫升浓度为100微克/毫升的试剂A包被六孔板中的一个孔，于37°C孵育至少30分钟。解冻一份含一百万个hESCs的冻存细胞，以200 ×g离心5分钟。吸除上清液后，将细胞接种至预先包被的培养板中，并加入2毫升试剂B。细胞在约四天达到约80%融合度时进行传代。达到融合状态后，用预热的DPBS洗涤细胞，然后将其转移至500微升新鲜配制的试剂中。随后，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育3.5分钟。轻轻敲击培养板的侧面和底部数秒钟，使细胞脱落，并加入500微升的预配培养基。将脱落的细胞收集至新的1.5毫升离心管中，用移液器反复吹打细胞悬液。进行细胞计数时，将100微升细胞悬液加入900微升DPBS中。将剩余的900微升细胞悬液用培养基一稀释，使细胞浓度达到每毫升9×10⁴个细胞。取100微升稀释后的细胞悬液加入至无黏附性V型底96孔板的每个孔中。将板子在低速摇床上轻轻离心5分钟，随后在37°C和5%二氧化碳条件下培养至第2天。第2天，在96孔板的每个孔中加入20微升1%试剂A，用移液器在孔中央吹吸两次以分散死细胞。在将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续培养至第6天之前，先清洁板底。第6天时，将每孔中的58微升培养基更换为60微升新鲜培养基一，随后继续培养。第12天，从96孔板中收集细胞团块至15毫升锥形管中，在室温下静置5分钟，使团块自然沉降。待团块沉降后，小心移除上清液，避免扰动类器官，将细胞聚集体转移至含有18毫升添加试剂A的培养基二的10厘米悬浮培养皿中。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养至第18天。第18天时，在培养皿中确认半透明视泡结构的形成，并使用显微外科刀切割生成的类器官。将所有切碎的细胞团块聚集至培养皿中央，随后将细胞收集至一个15毫升圆锥形Falcon管中。待细胞沉淀后，小心吸除上清液，并将细胞团块重悬于两块10厘米的培养皿中，每皿加入18毫升培养基，共三皿。轻柔地将培养皿转移至培养箱中，以避免细胞聚集。继续培养细胞，并每周更换培养基。在第45天至第120天期间分析CRX的表达情况。在此代表性分析中，展示了人类视网膜发育的各个阶段。第6天时，类器官表现为直径约600微米的明亮边缘内密集连接的细胞团。第12天时，开始形成类似视泡的结构。在第18天将类器官转移至培养皿培养前，剔除那些不具备典型囊泡样结构的类器官。至培养第30天时，囊泡样结构变得更加明显，低质量的视网膜类器官可被轻易识别并去除。从第45天开始，类器官开始表达多种光感受器前体细胞的标志物，如CRX、RCVRN和OTX2。通过切割上方的视网膜类器官，分化效率显著提高，可从96孔板中收获超过100个上方类器官。

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Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

从人多能干细胞中定向诱导视网膜类器官

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。...

高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

本方案描述了如何从多能干细胞诱导生成视网膜色素上皮细胞（RPE）。该方法通过联合使用生长因子和小分子化合物，在14天内将干细胞定向分化为未成熟RPE，并在三个月后获得成熟且具有功能的RPE细胞。...

人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的快速定向分化

关键词：视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞，诱导性多能干细胞，定向分化，干细胞分化，眼发育，细胞治疗

利用多能干细胞生成特化的视网膜细胞是干细胞治疗视网膜疾病发展过程中的一个关键转折点。本文介绍了一种简单的方法，可高效地生成用于基础研究、转化研究和临床研究的视网膜类器官和视网膜色素上皮细胞。...

无饲养层且无异源成分的培养条件用于生成人iPSC来源的视网膜细胞模型

本文介绍了一种优化的视网膜类器官诱导系统，该系统适用于多种人类多能干细胞系，可高效且高重复性地生成视网膜组织。...

人多能干细胞衍生三维视网膜组织的视网膜类器官诱导系统

本方案描述了一种利用简化的培养条件，将人诱导多能干细胞（hiPSCs）高效分化为视泡样细胞簇并生成神经视网膜类器官的方法，该培养过程结合了贴壁培养和悬浮培养体系。在视网膜培养物中成熟的视泡结构内，还可分离出其他眼部细胞类型，如视网膜色素上皮细胞（RPE）和角膜上皮细胞。...

由健康及视网膜疾病特异性人诱导性多能干细胞生成视网膜类器官

本方案描述了一种优化的三维神经视网膜诱导系统，可减少视网膜类器官的黏附与融合，具有高重复性和高效率。...

由人多能干细胞生成神经视网膜

本方案介绍了一种利用人多能干细胞生成血管类器官的方法。...

由人诱导性多能干细胞生成血管类器官

该方案结合光学透明化与免疫标记技术，实现对整体视网膜类器官的全体积共聚焦成像。该方法可保持三维结构，从而实现对关键神经元通路的精细可视化，有助于深入研究视网膜成熟过程、空间组织特征，及其在疾病建模和个体化医学中的潜在应用。...

全胚层视网膜类器官的细胞分辨率成像

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

直接从人体组织中分离癌症干细胞（CSCs）是对其进行生物学表征的必要步骤。本文描述了一种从人体组织中分离前列腺癌症干细胞的方法，同时提供了针对困难步骤的故障排除建议。...

从人前列腺癌样本中分离癌干细胞

了解从人多能干细胞定向诱导视网膜类器官的高效实验方案，优化感光前体细胞的分化效率。该方法为视网膜疾病建模、药物筛选及细胞移植治疗提供可靠的体外研究平台。

由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

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