由人多能干细胞定向诱导视网膜类器官

这是一种视网膜疾病的模型，可模拟体内视网膜。在一定程度上，它可替代动物实验。该方案针对视网膜类器官中光感受器前体细胞的数量和质量进行了优化，而光感受器是多种不可逆致盲疾病的关键所在。

首先，在无饲养层条件下培养人胚胎干细胞（hESCs）。具体操作如下：用1毫升浓度为100微克/毫升的试剂A包被六孔板中的一个孔，于37°C孵育至少30分钟。解冻一份含一百万个hESCs的冻存细胞，以200 ×g离心5分钟。

吸除上清液后，将细胞接种至预先包被的培养板中，并加入2毫升试剂B。细胞在约四天达到约80%融合度时进行传代。达到融合状态后，用预热的DPBS洗涤细胞，然后将其转移至500微升新鲜配制的试剂中。随后，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育3.5分钟。

轻轻敲击培养板的侧面和底部数秒钟，使细胞脱落，并加入500微升的预配培养基。将脱落的细胞收集至新的1.5毫升离心管中，用移液器反复吹打细胞悬液。进行细胞计数时，将100微升细胞悬液加入900微升DPBS中。

将剩余的900微升细胞悬液用培养基一稀释，使细胞浓度达到每毫升9×10⁴个细胞。取100微升稀释后的细胞悬液加入至无黏附性V型底96孔板的每个孔中。将板子在低速摇床上轻轻离心5分钟，随后在37°C和5%二氧化碳条件下培养至第2天。

第2天，在96孔板的每个孔中加入20微升1%试剂A，用移液器在孔中央吹吸两次以分散死细胞。在将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下继续培养至第6天之前，先清洁板底。第6天时，将每孔中的58微升培养基更换为60微升新鲜培养基一，随后继续培养。

第12天，从96孔板中收集细胞团块至15毫升锥形管中，在室温下静置5分钟，使团块自然沉降。待团块沉降后，小心移除上清液，避免扰动类器官，将细胞聚集体转移至含有18毫升添加试剂A的培养基二的10厘米悬浮培养皿中。将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养至第18天。第18天时，在培养皿中确认半透明视泡结构的形成，并使用显微外科刀切割生成的类器官。

将所有切碎的细胞团块聚集至培养皿中央，随后将细胞收集至一个15毫升圆锥形Falcon管中。待细胞沉淀后，小心吸除上清液，并将细胞团块重悬于两块10厘米的培养皿中，每皿加入18毫升培养基，共三皿。

轻柔地将培养皿转移至培养箱中，以避免细胞聚集。继续培养细胞，并每周更换培养基。在第45天至第120天期间分析CRX的表达情况。

在此代表性分析中，展示了人类视网膜发育的各个阶段。第6天时，类器官表现为直径约600微米的明亮边缘内密集连接的细胞团。第12天时，开始形成类似视泡的结构。

在第18天将类器官转移至培养皿培养前，剔除那些不具备典型囊泡样结构的类器官。至培养第30天时，囊泡样结构变得更加明显，低质量的视网膜类器官可被轻易识别并去除。从第45天开始，类器官开始表达多种光感受器前体细胞的标志物，如CRX、RCVRN和OTX2。

通过切割上方的视网膜类器官，分化效率显著提高，可从96孔板中收获超过100个上方类器官。