Name: 从成年小鼠味干细胞中衍生的语言器官的生成与培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 了解从成年小鼠味蕾干细胞生成舌类器官的标准化方案，使用FACS分选Lgr5阳性细胞并在3D基质胶中培养。该方法为味觉细胞发育和再生研究提供高通量体外模型，适用于药物筛选和味觉功能障碍机制研究。

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作者谨此感谢科罗拉多大学安舒茨医学校区类器官与组织建模共享资源中心的 Peter Dempsey 博士和 Monica Brown，感谢他们提供 WNR 条件培养基以及富有价值的讨论。我们还感谢科罗拉多大学癌症中心细胞技术与流式细胞术共享资源中心，特别是 Dmitry Baturin，在细胞分选方面的专业技术支持。本研究由以下项目资助：NIH/NIDCD R01 DC012383、DC012383-S1、DC012383-S2 以及 NIH/NCI R21 CA236480（资助对象：LAB）；R21DC016131 和 R21DC016131-02S1（资助对象：DG）；以及 F32 DC015958（资助对象：EJG）。

所有动物实验均在获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行，遵循《实验动物照护与使用指南》、《动物福利法》和《公共卫生服务政策》的要求，并经科罗拉多大学安舒茨医学校区机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。本方案中使用的 Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 小鼠来自杰克逊实验室，货号 008875。
注意：为确保本实验方案顺利且及时地进行，应在开始前完成以下步骤：将水浴锅预热至 37 °C，将离心机预冷至 4 °C，使用 10 mg/mL 的 Dispase、Collagenase 和 Elastase 储存液配制注射液和解离酶溶液（见材料表），从 -20 °C 冰箱中取出基质胶（48 孔板约需 750 µL），将试剂瓶浸入冰中至少 3–4 小时以缓慢融化，用未稀释的胎牛血清（FBS）预包被微量离心管，在室温下轻轻摇晃至少 30 分钟（组织收集用 2 个 2 mL 管，解离细胞用 2 个 1.5 mL 管，细胞分选后单细胞收集用 1 个 1.5 mL 管；使用前去除多余 FBS）。
1. CVP 上皮的分离
注意：为了获得足够用于完整48孔板的LGR5+细胞，需将三个Lgr5-EGFP CVP收集至同一管中并同时处理。重要的是，需在另一管中平行收获并处理至少一只野生型同窝小鼠的CVP，用作设门对照以设定FACS参数（见代表性结果）。
<ol>
	<li>使用 CO₂ 处死小鼠2 根据IACUC规定进行窒息处死，随后采用经批准的辅助方法，如双侧开胸、颈椎脱位、断头或放血处死。</li>
	<li>使用大型无菌解剖剪剪开颊部并折断下颌。抬起舌头，剪断舌系带以将舌头与口腔底部分离。取出舌头并置于无菌的冰冷杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）中，含Ca2+ 和 Mg2+.</li>
	<li>用刀片在磨牙间隆起前方稍作切割，移除并弃去舌前部图1A，虚线使用精细的任务擦拭纸清除舌根部的任何毛发和多余液体。</li>
	<li>用1 mL注射器吸取200–300 µL消化酶溶液（终浓度：2 mg/mL I型胶原酶和5 mg/mL Dispase II，溶于Ca²⁺-free缓冲液中）2+/毫克2+含 dPBS 的溶液，从 10 mg/mL 储存液稀释），并在磨牙隆起上方插入一支 30 G × ½ 针头图1B，黑色箭头紧邻前方，但不包括前方&#160;中心静脉压（CVP）图1B，黑箱将酶溶液注射到舌背黏膜下以及上皮与下方组织（固有层、肌肉）之间的CVP侧缘下方。注射时，将注射器从舌部缓慢且连续地撤出。</li>
	<li>将舌头置于无菌的 Ca2+/毫克2+在室温下用无钙镁的 dPBS 孵育恰好 33 分钟。</li>
	<li>在上皮组织双侧且紧靠前方进行小切口&#160;使用超细解剖剪分离CVP，并用精细镊子轻轻提起上皮层将其剥离。当沟状乳头（trench）上皮完全脱离下方结缔组织后，将其置于预先用FBS包被的空的2 mL微量离心管中。上皮修剪步骤可在CVP上皮分离前或分离后进行（图1C，D).</li>
</ol>
2. CVP 上皮的解离
注意：CVP 上皮的分离与接种在图2中有图示说明。
<ol>
	<li>向含有剥离的 CVP 上皮组织的离心管中加入消化酶混合液（终浓度：2 mg/mL I型胶原酶、2 mg/mL 弹性蛋白酶和 5 mg/mL Dispase II，溶于含 Ca2+/Mg2+ 的 dPBS 中，由 10 mg/mL 储存液稀释而成）（每 CVP 加 200 µL）。将样品置于 37 °C 水浴中孵育 45 分钟，每 15 分钟短暂涡旋一次。 
	注意：在酶混合液孵育的最后 15 分钟内，将 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 预热至 37 °C 水浴中。</li>
	<li>孵育结束后，涡旋振荡（三次脉冲）并用玻璃巴斯德吸管吹打 1 分钟。待组织碎片沉降后，将含有首次解离细胞的上清液转移至对应基因型的 FBS 包被的 1.5 mL 微量离心管中。剩余组织碎片按以下步骤 2.3 进行进一步处理。
	<ol>
		<li>将上清液在 370 ×g、4 °C 条件下离心 5 分钟，以收集细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液中（含 1 mM EDTA、25 mM HEPES（pH 7.0）和 1% FBS 的无 Ca2+/Mg2+ PBS，每 CVP 加 50 µL），置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在执行步骤 2.2.1 和 2.2.2 的同时，向原始 2 mL 微量离心管中的剩余组织碎片加入预热的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA（每 CVP 200 µL），并在 37 °C 水浴中孵育 30 分钟，每 10 分钟短暂涡旋一次。</li>
	<li>孵育结束后，涡旋振荡含有组织碎片的离心管（三次脉冲），再用玻璃巴斯德吸管吹打 1 分钟。待组织碎片沉降后，将上清液转移至含有步骤 2.2.2 所得细胞的 1.5 mL 微量离心管中。弃去含有剩余组织碎片的离心管。
	<ol>
		<li>将含有解离细胞的离心管在 370 ×g、4 °C 条件下离心 5 分钟，以收集细胞沉淀。</li>
		<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 FACS 缓冲液中（每 CVP 100 µL），置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞通过 30 µm 尼龙滤网过滤，并在进行 FACS 前向细胞悬液中加入 DAPI（λemission = 450 nm）。利用绿色荧光蛋白通道（λexcitation = 488 nm；λemission = 530 nm）通过 FACS 分离 Lgr5-GFP+ 细胞。使用 100 µm 喷嘴将细胞分选至含有 300 µL 无 Ca2+/Mg2+ dPBS 的新鲜 FBS 包被的 1.5 mL 微量离心管中。分选后立即将细胞置于冰上，直至接种。</li>
</ol>
3. Lgr5-EGFP 细胞的铺板
<ol>
	<li>确定从流式细胞仪接收到的LGR5+细胞悬液的体积。</li>
	<li>根据分选仪获得的细胞数量，计算每微升（µL）中的细胞数。然后确定接种所需细胞数量对应的悬液体积（我们采用每孔48孔板接种200个细胞），并将该总体积的细胞悬液转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>在370 ×g、4 °C条件下离心5分钟，以沉淀细胞（沉淀可能不可见）。吸除上清液，并将离心管置于冰上。</li>
	<li>用适量基质胶轻柔重悬细胞沉淀（48孔板每孔15 µL）；轻轻吹打混匀，使细胞在基质胶中充分分散。将15 µL基质胶/细胞混合物置于每孔中央。在接种过程中，将微量离心管置于50 mL锥形管内并保持在冰上，以防止基质胶提前凝固。在整个接种过程中，每接种三个孔后通过上下吹打混匀一次基质胶/细胞混合物，以确保各孔间细胞分布均匀。</li>
	<li>将培养板放入培养箱（37 °C、5% CO2、约95%湿度）中孵育10分钟，使基质胶凝固。随后向每孔加入300 µL室温的WENRAS + Y27632培养基，并将培养板放回培养箱继续培养。</li>
</ol>
4. 类器官的维持
注意：类器官在常规类器官培养基（WENR）中培养，该培养基包含重组EGF以及含有Wnt3a、Noggin和R-spondin的50%条件培养基23。在培养的前6天加入药物A8301和SB202190以优化生长（WENRAS培养基）（图5），随后去除以促进分化（WENR培养基）20。培养初期前2天加入Y27632以提高存活率。培养基条件与培养时间线的关系见图4。
<ol>
	<li>铺板后两天，使用1 mL移液器从每个孔中移除WENRAS + Y27632培养基，确保无交叉污染。沿孔壁加入300 µL WENRAS培养基，以避免扰动基质凝胶。将培养板放回培养箱中。</li>
	<li>每2天更换一次培养基，根据培养阶段使用相应的培养基（图4）。持续培养类器官至第12天，此时类器官已准备好进行收获。</li>
</ol>
5. RNA 加工
<ol>
	<li>用于RNA提取的类器官收获
	<ol>
		<li>将&#160;48孔板置于冰上30分钟，以解聚基质胶。</li>
		<li>使用1 mL移液器吸取类器官培养基；在将培养基返回孔中的同时，用移液器吸头刮擦并进一步打碎基质胶。将内容物转移至1.5 mL微量离心管中，每管合并三个孔的内容物。在室温下以300 × g 离心5分钟。</li>
		<li>尽可能多地去除上清培养基，避免移除任何类器官；然后再次在室温下以300 × g 离心5分钟。</li>
		<li>去除残留的培养基，并将类器官重悬于350 µL裂解缓冲液 + β-巯基乙醇（βME）（每1 mL裂解缓冲液中加入10 µL βME）。将样品置于冰上，立即进行RNA提取，或储存于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量RT-PCR分析
	<ol>
		<li>通过分光光度计测定RNA浓度。使用cDNA合成试剂盒对RNA进行逆转录。</li>
		<li>将相当于5 ng RNA的cDNA与200 nM预验证的正向和反向引物（表1）以及荧光PCR主混合液混合。进行40个循环的qRT-PCR反应：95 °C 15秒，然后60 °C 60秒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 免疫组织化学
<ol>
	<li>类器官的收获与固定
	<ol>
		<li>将48孔板置于冰上30分钟，以松解基质胶。</li>
		<li>移除类器官培养基，每孔加入400 µL预冷的PBS。随后吸除PBS，每孔加入400 µL预冷的细胞回收溶液，在4 °C轻轻摇动30分钟。</li>
		<li>用含1% BSA的PBS预润洗1 mL移液枪头，轻轻吹打孔内液体以破碎基质胶。将类器官转移至置于冰上的1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>用300 µL PBS + 1% BSA冲洗每个孔，将残留的类器官转移至对应的离心管中。吸除各管中的细胞回收溶液/PBS + BSA，加入400 µL预冷PBS，再用另一份预冷PBS重复冲洗一次。</li>
		<li>吸除PBS，加入300 µL预冷的4%多聚甲醛（溶于0.1 M磷酸缓冲液中）固定类器官20分钟，室温孵育。随后吸除多聚甲醛，用400 µL预冷PBS冲洗类器官。</li>
		<li>吸除PBS，加入400 µL PBS + 1% BSA。于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色
	<ol>
		<li>用500 µL PBS + 1% BSA冲洗类器官。随后将类器官置于封闭液（含5%正常山羊或驴血清、1%牛血清白蛋白、0.3% Triton X-100的1×PBS，pH 7.3）中，室温轻轻摇动孵育2小时。</li>
		<li>加入一抗溶液（用封闭液稀释的一抗），于4 °C轻轻摇动孵育3个夜晚。</li>
		<li>用500 µL PBS + 0.2% Triton在室温轻轻摇动洗涤类器官4次，每次1小时。加入二抗溶液（用封闭液稀释的二抗），于4 °C避光孵育过夜。</li>
		<li>用500 µL PBS + 0.2% Triton在室温避光、轻轻摇动洗涤类器官3次，每次1小时。加入用0.1 M磷酸缓冲液按1:10,000稀释的DAPI溶液，室温避光摇动孵育20分钟。</li>
		<li>用0.1 M磷酸缓冲液在室温避光、轻轻摇动洗涤类器官3次，每次20分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官的载玻片封片用于倒置共聚焦显微镜观察。 
	&#8203;注：载玻片封片过程的分步图示见图7。
	<ol>
		<li>在载玻片上用无毒的塑型黏土制作一个约1 mm厚、22 × 22 mm的方形围栏。</li>
		<li>从微量离心管中移除0.1 M磷酸缓冲液，将类器官轻轻重悬于100 µL所选封片剂中，然后转移至黏土方框中央。</li>
		<li>填充封片剂至接近方框顶部。然后将22 × 22 mm的方形盖玻片覆盖在黏土框上，用力按压盖玻片边缘以密封。根据制造商说明使其固化（此处为室温放置1–2天），并于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文报道了一种高效且易于重复的方法，用于培养、维持和处理源自成年小鼠味觉干细胞的舌部类器官。研究发现，使用8至20周龄Lgr5-EGFP小鼠的三个轮廓乳头（CVP）足以获得约10,000个GFP+细胞用于实验，可将这些细胞以每孔200个的密度接种于48孔板中，共接种50孔。通过向舌上皮注射新配制的Dispase II和I型胶原酶溶液，并进行33分钟孵育，可优化去除CVP沟槽上皮的操作。然而，孵育时间过短、酶液保存过久、不同批次或不同厂家的酶均可能导致沟槽去除不完全。相反，孵育时间过长则会引起组织过度消化，导致味觉组织完整性的丧失。剥离后，通过修剪掉CVP周围上皮进一步富集CVP沟槽。
在解离和收集过程中，所使用的所有微量离心管必须用胎牛血清（FBS）包被，以防止组织和细胞黏附于管壁，否则会显著降低分离细胞的回收率（数据未显示）。使用少量FBS包被，并在使用前去除管内多余液体，可最大限度减少对胰蛋白酶或其他酶可能产生的抑制作用。
已成功从未经过LGR5+细胞预先分选的...

在啮齿类动物中，舌部的味蕾位于舌前部的菌状乳头内，舌后部两侧的叶状乳头内，以及舌背侧后正中线处单个的轮廓乳头（CVP）内1。每个味蕾由50–100个寿命较短且快速更新的味觉感受细胞（TRC）组成，其中包括Ⅰ型类似胶质的支持细胞、感知甜味、苦味和鲜味的Ⅱ型细胞，以及感知酸味的Ⅲ型细胞2,3,4。在小鼠的CVP中，基底膜附近的LGR5+干细胞可产生所有类型的TRC以及非味觉上皮细胞5。在味觉谱系更新过程中，LGR5的子代细胞首先被确定为有丝分裂后的味觉前体细胞（Ⅳ型细胞），这些细胞进入味蕾后，能够分化为三种TRC中的任意一种6。由于TRC更新迅速，味觉系统容易受到放疗和某些药物治疗等医学干预手段的干扰7,8,9,10,11,12,13。因此，在味觉干细胞调控和TRC分化背景下研究味觉系统，对于理解如何减轻或预防味觉功能障碍至关重要。
小鼠是研究的傳統模型 体内 由于其味觉系统的组织方式与人类相似，因此在味觉科学研究中具有重要意义14,15,16然而，小鼠并不适合高通量研究，因为其维持成本高且操作耗时。为克服这一问题， 体外 近年来已开发出类器官培养方法。味觉类器官可由天然的轮廓乳头（CVP）组织生成，该过程涉及将分离的小鼠CVP上皮进行培养，类器官由此出芽形成 离体17这些类器官呈现出与多层上皮一致的结构 体内 味觉系统。一种更高效生成类器官的方法，无需 离体 CVP 培养基由 Ren 等人开发. 2014年18. 采用最初为培养肠道类器官而开发的方法和培养基，他们分离了单个Lgr5-GFP+ 从小鼠CVP中分离祖细胞并接种于基质凝胶中19这些单细胞生成了舌类器官，在培养的前6天内增殖，约在第8天开始分化，到培养结束时包含非味觉上皮细胞及所有三种味觉受体细胞类型。18,20迄今为止，已有多个利用舌类器官模型系统的研究发表17,18,20,21,22；然而，不同文献中用于生成这些类器官的方法和培养条件各不相同（补充表1因此，这些方法在此经过调整和优化，以提供一种源自LGR5的舌体类器官培养的详细标准化方案+ 成年小鼠CVP的前体细胞
舌类器官为研究驱动味觉细胞发育与更新的细胞生物学过程提供了独特的模型。随着舌类器官的应用不断拓展，越来越多的实验室开始采用 体外 类器官模型，该领域应致力于开发并采用标准化方案，以提高可重复性。将舌类器官确立为味觉科学研究中的常规工具，将有助于开展高通量研究，解析单个干细胞如何生成成体味觉系统中的各类分化细胞。此外，舌类器官还可用于快速筛选可能影响味觉稳态的药物，随后可在动物模型中对筛选结果进行更深入的验证。这一策略最终将促进开发改善患者生活质量的治疗方案&#160;未来的药物受体。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 驴抗山羊IgG</td><td>分子探针</td><td>A11056，RRID：AB_142628</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 山羊抗兔 IgG</td><td>分子探针</td><td>A11010，RRID:AB_2534077</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 山羊抗豚鼠 IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11075，RRID:AB_2534119</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 驴抗兔 IgG</td><td>分子探针</td><td>A31573，RRID:AB_2536183</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 山羊抗大鼠 IgG</td><td>分子探针</td><td>A21247，RRID:AB_141778</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>DAPI（用于流式细胞术）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（用于免疫组织化学）</td><td>Invitrogen</td><td>D3571，RRID:AB_2307445</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>山羊抗CAR4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF2414，RRID:AB_2070332</td><td>1:50</td></tr><tr><td>豚鼠抗KRT13</td><td>Acris 抗体</td><td>BP5076，RRID:AB_979608</td><td>1:250</td></tr><tr><td>兔抗GUSTDUCIN多克隆抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-395，RRID:AB_673678</td><td>1:250</td></tr><tr><td>兔抗 NTPDASE2</td><td>CHUQ</td><td>mN2-36LI6，RRID:AB_2800455</td><td>1:300</td></tr><tr><td>抗KRT8大鼠单克隆抗体</td><td>DSHB</td><td>TROMA-IS，RRID: AB_531826</td><td>1:100</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2D摇床</td><td>Benchmark Scientific 公司</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>3D旋转器</td><td>Lab-Line 仪器</td><td>4630</td><td></td></tr><tr><td>大数字计时器/秒表</td><td>Fisher Scientific</td><td>S407992</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>CO2 钢瓶</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>FormaTM Series 3 水套式 CO2 培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4110</td><td>184 升，抛光不锈钢</td></tr><tr><td>Incucyte</td><td>赛多利斯</td><td>模型：S3</td><td>科罗拉多大学安舒茨医学校区癌症中心细胞技术共享资源平台</td></tr><tr><td>MoFlo XDP100</td><td>Cytomation 公司</td><td>型号：S13211997</td><td>&amp;nbsp;科罗拉多大学安舒茨医学校区盖茨中心流式细胞术核心实验室</td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>新不伦瑞克科学公司</td><td>Excella E1</td><td></td></tr><tr><td>实时荧光定量PCR系统</td><td>应用生物系统公司</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>冷藏离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;体视显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>热循环仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>580BR</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>精确度</td><td>51220073</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83 01</td><td>Sigma</td><td>SML0788-5MG</td><td>储备浓度 10 mM，终浓度 500 nM</td></tr><tr><td>高级DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>储备液浓度50X，终浓度1X</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>储存液浓度1000X，终浓度1X</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>储存液浓度100X，终浓度1X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>储存液浓度100X，终浓度1X</td></tr><tr><td>小鼠 EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09-1MG</td><td>储备浓度 500 &amp;micro;g/mL，终浓度为 50 ng/mL</td></tr><tr><td>小鼠Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>储备浓度 50 &amp;micro;g/mL，终浓度为 25 ng/mL</td></tr><tr><td>N-乙酰-L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>储备浓度 0.5 M，终浓度 1 mM</td></tr><tr><td>烟酰胺</td><td>Sigma</td><td>N0636-100g</td><td>储备浓度 1 M，终浓度 1 mM</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>储存液浓度100X，终浓度1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>储备液浓度500X，终浓度1X</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1264</td><td>储备浓度 10 mM，终浓度 0.4 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>WRN 条件培养基</td><td></td><td></td><td>来自Dempsey实验室（AMC类器官与组织建模共享资源）。源自L-WRN（ATCC&amp;reg; CRL-3276&amp;trade;) 细胞</td></tr><tr><td>Y27632 二盐酸盐 10 μg</td><td>APExBIO</td><td>A3008-10</td><td>储备浓度 10 mM，终浓度 10 &amp;micro;M</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;其他&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml TB 注射器</td><td>BD 注射器</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇，纯度≥98%</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td></tr><tr><td>2.0 mL 微型离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2700</td><td></td></tr><tr><td>48孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 英寸巴斯德吸管</td><td>Fisherbrand</td><td>12-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma生命科学</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT 裂解缓冲液</td><td>QIAGEN</td><td>1015750</td><td></td></tr><tr><td>细胞回收溶液</td><td>康宁</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>科汉-范纳斯弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>产气荚膜梭菌胶原酶，I型</td><td>Sigma生命科学</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RGF BME，2 型，Pathclear</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>3533-005-02</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Dispase II（中性蛋白酶，II 型）</td><td>Sigma-Aldrich（罗氏）</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>一次性过滤器</td><td>希森美康</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;磷酸盐缓冲液，pH 7.4（1X）（Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;& Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 无（游离）</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;含钙磷酸盐缓冲液&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; &amp;& Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma生命科学</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA，0.5 M（pH 8.0）</td><td>Promega</td><td>V4231</td><td></td></tr><tr><td>弹性蛋白酶 冻干粉</td><td>沃辛顿生物化学</td><td>LS002292</td><td></td></tr><tr><td>超细邦剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 溶液</td><td>Sigma生命科学</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HyClone 胰蛋白酶 0.25% + EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA合成试剂盒</td><td>Bio-Rad</td><td>1706691</td><td></td></tr><tr><td>灰陶土</td><td>萨金特艺术</td><td>22-4084</td><td></td></tr><tr><td>针</td><td>BD 注射器</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;功率&lt;/em&gt;SYBR Green PCR Master Mix</td><td>应用生物系统公司</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>安全锁扣管 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>无水磷酸氢二钠</td><td>Fisher Chemical</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠无水物</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>手术剪 - 锐头</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma生命科学</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VWR 微型盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td>22x22毫米</td></tr></tbody></table>

由成年小鼠味觉干细胞衍生的舌类器官的生成与培养

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

味觉由舌头上味蕾介导，味蕾由快速更新的味觉感受细胞（TRC）组成。这种持续的更新由局部前体细胞驱动，使得味觉功能容易受到多种医疗治疗的干扰，进而严重影响生活质量。因此，在药物治疗背景下研究这一过程，对于理解味觉前体细胞功能及TRC生成是否以及如何受到影响至关重要。鉴于人类味觉组织在伦理和可获得性方面的限制，通常采用味觉系统与人类相似的小鼠模型。与耗时、昂贵且难以进行高通量研究的in vivo方法相比，小鼠舌部类器官能够实现快速实验，具有更多重复样本并减少使用小鼠数量。本文改编了先前已发表的实验方案，提出一种标准化方法，用于从成年小鼠轮廓乳头（CVP）中分离的味觉前体细胞生成味觉类器官。CVP中的味觉前体细胞表达LGR5，可通过EGFP荧光激活细胞分选（FACS）从携带Lgr5EGFP-IRES-CreERT2等位基因的小鼠中分离获得。分选后的细胞接种于基于基质凝胶的三维培养系统中，培养12天。类器官在培养前6天通过增殖而扩增，随后进入分化阶段，在此期间生成全部三种味觉细胞类型以及非味觉上皮细胞。类器官可在第12天成熟后收获，或在生长过程中的任意时间点收获，用于RNA表达分析和免疫组织化学分析。标准化成年干细胞来源的舌类器官培养方法将提高实验可重复性，并推动舌类器官成为帮助味觉功能障碍患者治疗研究中强有力的药物筛选工具。

小鼠具有一个位于舌背侧的轮廓乳头（CVP），可从中分离出LGR5+干细胞（图1A，黑色框）。将酶溶液注射至CVP下方及周围区域（图1B），可引起上皮组织轻微肿胀并消化结缔组织。经过33分钟孵育后可达到充分消化效果，从而易于将CVP上皮与下方组织分离。在尝试剥离CVP上皮时，切口应距离CVP足够远，以确保沟槽结构不被破坏或损伤（图1C）。此操作还可使镊子能够夹持上皮组织而不损伤CVP。修剪CVP周围的上皮组织可去除非靶细胞，并通过减少操作组织量提高后续步骤的效率（图1D）。在将CVP上皮加入微量离心管前，必须确认两个沟槽结构（图1C，黑色箭头）仍存在；成功的CVP上皮剥离应包含部分冯·艾布纳腺体及其导管（图1D</...

本方案介绍了一种培养和处理源自成年小鼠后部味觉乳头分离的味觉干细胞的舌类器官的方法。

味觉由舌头上的味蕾介导，味蕾由不断更新的味觉感受细胞（TRCs）组成。这种持续的更新过程是……

类器官是一种强大的体外技术，可用于药物筛选和研究生物学过程。因此，构建模拟舌部的类器官对于研究味觉细胞的发育与再生至关重要。传统的体内味觉研究可能成本高昂且耗时较长。该类器官培养方案提供了一种标准化且可重复的替代方法，可在最大限度减少上述挑战的同时，实现高通量实验。在处死成年小鼠后，使用大型无菌解剖剪剪开颊部并折断下颌。随后抬起舌头，剪断舌系带，以将舌头与口腔底部分离。将舌头剪下，并用含有钙和镁的无菌冰冻 dPBS 收集。在解剖显微镜下，用刀片在间颌隆起前方稍作切割，移除并弃去舌的前部。然后使用精细擦拭纸轻轻去除舌后部的任何毛发和多余液体。接下来，用1毫升注射器吸取200至300微升的注射用酶溶液，在颌间隆起上方紧邻轮廓乳头（CVP）前侧的位置插入30号半英寸针头。将酶溶液注射至CVP下方及其侧缘的上皮与深层组织之间。在注射过程中，缓慢且持续地从舌部撤出注射器。将舌组织与无钙镁的无菌 dPBS 在室温下精确孵育 33 分钟。使用超细解剖剪刀，在轮廓乳头（CVP）前方两侧的上皮组织上做小切口。然后用精细镊子轻轻提起上皮，将其剥离。当沟槽上皮与下方结缔组织完全分离后，将其放入预先用胎牛血清（FBS）包被的2毫升微量离心管中。向装有剥离下来的CVP上皮的管中加入消化酶混合液，于37摄氏度水浴中孵育45分钟，每隔15分钟短暂涡旋振荡一次。在孵育的最后15分钟内，将0.25%胰蛋白酶-EDTA预热至水浴温度。孵育后，用玻璃巴斯德吸管涡旋振荡试管并吹打组织1分钟。待组织块沉降后，将含有首次解离细胞的上清液转移至新的经FBS包被的1.5毫升微量离心管中。在370 ×g、4°C条件下离心5分钟，使细胞沉淀。移除上清液，然后将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中，并置于冰上。为了在原始的两个毫升微量离心管中解离残留的组织块，加入预热的0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度孵育30分钟，每隔10分钟短暂涡旋一次。随后，用玻璃巴斯德吸管吹打组织块1分钟。待组织块沉降后，用移液器将上清液转移至含有先前收集的FACS缓冲液中解离细胞的1.5毫升微量离心管中。离心含有解离细胞的离心管。去除上清液后，将细胞沉淀重悬于FACS缓冲液中，并置于冰上保存。然后，按照文稿中所述，使用绿色荧光蛋白通道通过流式细胞术分离 Lgr5-GFP 阳性细胞。将所需数量的 Lgr5 阳性悬浮细胞转移至新的微量离心管中。在 370 ×g 和 4°C 条件下离心五分钟，使细胞沉淀。移去上清液，将离心管置于冰上。用移液器轻轻吹打，将细胞沉淀在适量基质胶中轻柔重悬。然后将微量离心管放入50毫升锥形管中，置于冰上，以防止基质胶凝固。在48孔板每个孔的中央加入15微升基质胶与细胞的混合物。为确保细胞分布均匀，在每接种三个孔后，通过移液器反复吹打混匀基质胶与细胞混合物。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度的培养箱

generation-culture-lingual-organoids-derived-from-adult-mouse-taste

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从成年小鼠味干细胞中衍生的语言器官的生成与培养

我们旨在建立一种可重复的方案，用于分离和长期培养人菌状味蕾细胞。通过活检获取的人菌状乳头细胞在体外培养中成功维持了超过八代（12个月），且细胞活力未见下降。...

分离与培养人 fungiform 味蕾细胞

在本视频中，我们介绍了从小鼠舌头中分离上皮细胞的方法。这些细胞可进一步培养以形成细胞克隆。...

小鼠舌上皮细胞的分离与培养：一种从小鼠模型中分离和培养舌上皮细胞的操作方法

在本视频中，我们介绍了从小鼠舌头上分离轮廓乳头（CVP）上皮的方法。...

从小鼠模型中分离轮廓乳头（CVP）上皮：一种分离小鼠舌部CVP上皮的酶解法

由干细胞衍生的培养物在模拟感染性疾病方面具有巨大潜力。本文介绍了源自成体干细胞的小鼠和人类胃类器官的培养方法。通过显微注射将胃部病原体Helicobacter...

类器官作为感染性疾病的模型：人和小鼠胃类器官的培养及幽门螺杆菌的显微注射

本文介绍了对轮廓乳头、叶状乳头和腭部味蕾进行组织制备、染色及分析的方法，这些方法能够稳定地获得完整且结构完好的全器官味蕾（包括支配味蕾的神经纤维），并维持味蕾内部各结构之间以及味蕾与周围乳头组织之间的空间关系。...

完整组织染色、可视化及味蕾分析：菌状乳头、轮廓乳头与腭部味蕾

我们已开发出一种通用方案，可从胚胎期和成年小鼠舌部的上皮组织及间充质/结缔组织中分离出大量高质量的单细胞。...

从胚胎第12.5天及8周龄小鼠舌上皮与间充质/结缔组织中分离细胞

Trowell型器官培养方法已被用于解析调控牙齿发育的复杂信号网络，最近还被用于研究小鼠不断生长的门齿中干细胞相关的调控机制。荧光报告动物模型和活体成像技术有助于对牙源性干细胞及其特定的微环境生态位进行深入分析。...

使用Trowell型器官培养研究牙源性干细胞的调控

本实验方案描述了从小鼠成年腭部分离和培养口腔角质形成细胞的方法。同时报道了一种使用免疫染色进行评估的方法。...

从小鼠成年腭部分离和培养原代口腔角质形成细胞

本方案描述了通过化学致癌方法诱导生成并表征小鼠口腔-食管三维类器官的关键步骤，这些类器官代表了正常、癌前病变及鳞状细胞癌病灶。...

建立三维类器官模型研究口腔-食管鳞状细胞癌

本文提供了一种可重复的方法，用于通过源自成年斑马鱼全脑或端脑、中脑或小脑区域的神经球实验来检测成年神经发生。此外，我们还描述了在斑马鱼神经球中操控基因表达的操作步骤。...

成年斑马鱼脑源性神经球的分离与培养

了解从成年小鼠味蕾干细胞生成舌类器官的标准化方案，使用FACS分选Lgr5阳性细胞并在3D基质胶中培养。该方法为味觉细胞发育和再生研究提供高通量体外模型，适用于药物筛选和味觉功能障碍机制研究。

由成年小鼠味觉干细胞衍生的舌类器官的生成与培养

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