从成年小鼠味干细胞中衍生的语言器官的生成与培养

该协议提出了一种培养和处理从成年小鼠后味分离出的味觉干细胞中提取的语言器官的方法。

器官是用于药物筛选和理解生物过程的强大的体外技术。因此，生成模拟舌头的器官对于研究味觉细胞发育和再生至关重要。传统的体内味觉研究可能既昂贵又费时。

此器官协议提供了一个标准化的、可重复的替代方案，可最大限度地减少这些挑战，同时允许更高的吞吐量实验。对成年老鼠实施安乐死后，使用大无菌解剖剪刀割断脸颊并打断下颚。然后，抬起舌头，切开语言，将舌头从口腔的地板上分离。

切掉舌头，用钙和镁在无菌的冰冷 dPBS 中收集。在解剖显微镜下，只需用剃须刀刀片切割前部的异常显赫，就取出并丢弃前舌。然后使用精细的任务擦拭，以去除任何头发和多余的液体从后舌。

接下来，用 200 至 300 微升注射酶溶液填充一毫升注射器，并在麦芽管显赫上方插入一根 30 米半的针头，直到环状的前部或 CVP 。将酶溶液注射到上皮和底层组织之间的 CVP 的横向边缘。当溶液被注射时，缓慢而连续地从舌头中取出注射器。

在室温下孵育舌头和无菌无镁钙 dPBS 精确 33 分钟。使用超细解剖剪刀，在上皮上进行双边小切口，并仅对 CVP 前部进行切割。然后用细钳将其抬起来轻轻剥去上皮。

一旦沟渠上皮没有底层结缔组织，将其放入两毫升微中心管中，预先涂上FBS。将分离酶鸡尾酒加入含有去皮CVP的管子中，在37摄氏度的水浴中孵育45分钟，每15分钟短暂旋转一次。在最后15分钟的孵化中，预热0.25%的特里普辛-EDTA在水浴中。

孵化后，用玻璃巴斯德移液器将管子旋转一分钟。组织片落定后，将含有第一批分离细胞的超高分子移液器放入新的FBS涂层的1.5毫升微中心管中。在370倍G和4摄氏度的高温下旋转超高分子5分钟，使细胞颗粒化。

取出产生的超高纳特，然后将细胞颗粒重新悬浮在FACS缓冲器中，并将其保留在冰上。要分离原始两毫升微中心管中剩余的组织片段，请添加预热 0.25% 的 Trypsin-EDTA，在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，每 10 分钟短暂涡流一次。然后，用玻璃巴斯德移液器将纸巾碎片搅乱一分钟。

组织片落定后，将超纳特移入含有以前收集的FACS缓冲器中分离细胞的1.5毫升微中心管中。旋转管与分离的细胞。取出超高分子后，将细胞颗粒重新存放在FACS缓冲器中，并将其留在冰上。

然后，使用文本手稿中描述的绿色荧光蛋白通道，通过 FACS 分离 Lgr5-GFP 阳性细胞。将Lgr5阳性悬浮细胞的预期数量转移到新的微中心管中。在370倍G和4摄氏度下旋转管子5分钟，使细胞颗粒化。

取出超高线，将管子放在冰上。用温和的管道轻轻将细胞颗粒重新用适量的基质凝胶重新喷出。然后将微中心管放在冰上，放在50毫升圆锥管中，以防止基质凝胶凝胶凝胶凝胶。

在 48 井板的每个井的中心加入 15 微升基质凝胶的细胞混合物。为了确保细胞的均匀分布，在每三口井电镀后上下管道混合基质凝胶和细胞混合物。将板放在37摄氏度、5%二氧化碳和95%湿度的孵化器中10分钟，以允许基质凝胶凝胶。

然后，在每个井中加入300微升室温WENRAS介质，辅以岩石抑制剂Y27632，并将板返回孵化器。电镀两天后，使用一毫升移液器或真空吸气器从每口井中取出介质，确保条件之间不会交叉污染。在井边添加 300 微升 WENRAS 介质，注意不要破坏基质凝胶，并将板返回到孵化器中。

当语言器官使用WENR介质培养时，它们不会有效生长。然而，在添加了 TGF-beta 信号抑制剂 A 83-01 和 SB202190 之后，P-38 地图激酶信号抑制剂，观察到强劲增长。有趣的是，在六天后从介质中去除这些抑制剂会导致一般味觉受体细胞标记 Kcnq1 表达率更高，这表明 A 83-01 和 SB-202190 阻碍味觉细胞分化。

因此，从第 0 天到第 6 天，WENRAS 媒体中的培养器官，从第 6 天到第 12 天，WENR 媒体的培养器官，可以获得最佳的生长和分化。成熟的器官都含有以角蛋白-8为标志的味觉细胞和以角蛋白-13标记的非味上皮细胞。此外，角蛋白-13的表达水平高于所有三种味觉受体细胞标记，表明器官主要由非味上皮细胞组成。

器官表达所有味觉受体细胞类型。以 Entpd2 标记的一型细胞和以 Gnat3 标记的苦涩型 2 细胞在味觉器官中表达得非常强烈，而以 Car4 标记的酸感应型三细胞则不太常见。味觉受体细胞随机分布在器官中，而不是在体内观察到的离散味蕾结构中。

在从口腔中解剖舌头时，请务必将一些组织后遗入 CVP。此外，确保两个战壕弹出，并在剥皮时获得。