Name: 使用 D1S80 轨迹在实验室类中应用 DNA 指纹 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学习使用D1S80位点进行DNA指纹分析的完整实验流程，包括口腔上皮细胞DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及片段分析。该方法专为本科分子生物学教学设计，操作简便且成本低廉，可在单个工作日内完成全部步骤。

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作者感谢 Kevin Graham 提供的画外音，以及所有为本研究提供样本的参与者。

注意：仅当学生或其法定监护人同意进行本实验方案时方可使用，因为基因型分析结果可揭示遗传关系。DNA指纹分析是一种常见的分子生物学方法，主要应用于群体研究和法医学领域。因此，应特别注意尽可能降低污染风险。为避免样本受到外源DNA或脱氧核糖核酸酶（DNases）的污染，操作时应佩戴手套，仪器应彻底清洗或灭菌，溶液在使用前应经过滤除菌或高压灭菌处理。
1. 收集颊黏膜上皮细胞
警告：处理唾液和上皮细胞可能导致传染性疾病的传播。因此，应采取标准预防措施和基于传播途径的预防措施（例如，使用适当个人防护装备）。
注意：需包含一个由指导教师提供的阳性对照（例如，由指导教师提取的 DNA），并将其纳入后续的处理步骤中。
<ol>
	<li>在采集样本前，至少等待进食或刷牙后1小时。</li>
	<li>标记一个空的无菌2.0 mL微量离心管。</li>
	<li>从包装中取出一根无菌口腔拭子，在脸颊内侧用力擦拭30至40次或持续30至40秒，以收集口腔黏膜上皮细胞。</li>
	<li>将采集拭子的尖端放入先前标记好的无菌微量离心管中，并用手或无菌剪刀将伸出管口外的塑料杆折断。</li>
	<li>将管盖牢固地盖紧，确保采集拭子密封在管内。</li>
</ol>
2. 从人类细胞中提取基因组DNA
<ol>
	<li>提取前，将热混仪或加热块预热至 65 °C，用于样品裂解。 
	警告：所用部分化学品属于危险品。操作前请仔细阅读安全数据表，并采取适当的安全防护措施。
	<ol>
		<li>制备所有所需缓冲液和溶液（裂解液、8 M 乙酸钾、2-丙醇、70% 乙醇和洗脱缓冲液），并通过过滤或高压灭菌进行灭菌。 
		注意：除非特别说明，所有离心步骤均应在室温（20–30 °C）下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向口腔拭子中加入 500 μL 裂解液（50 mM Tris/HCl，pH 8.0；10 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）；2% 十二烷基硫酸钠（SDS）），确保样品完全浸没于裂解液中。
	<ol>
		<li>剧烈涡旋振荡至少 5 秒。</li>
		<li>将样品置于热混仪中，65 °C 孵育 10 分钟。</li>
		<li>孵育期间，通过短时脉冲式涡旋振荡 3–4 次，每次 5 秒，充分混匀样品。</li>
		<li>从裂解缓冲液中取出拭子，将拭子在管壁内侧挤压，以最大限度回收样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向裂解后的细胞中加入 100 μL 8 M 乙酸钾。
	<ol>
		<li>通过反复倒置试管充分混匀，直至出现白色沉淀。</li>
		<li>室温孵育 5 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 18,000 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>将 450 μL 上清液转移至一支洁净且无菌的 1.5 mL 微量离心管中。</li>
	<li>加入 450 μL 2-丙醇，通过反复倒置试管充分混匀（使 DNA 沉淀）。</li>
	<li>室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>在 18,000 x g 条件下离心 5 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将离心管倒置于洁净的纸巾上，使沉淀干燥，避免交叉污染。</li>
	<li>将 DNA 置于加热块中 65 °C 孵育 5 分钟，以彻底干燥沉淀。</li>
	<li>为洗涤 DNA，加入 500 μL 70% 乙醇。</li>
	<li>在 18,000 x g 条件下离心 1 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将离心管倒置于洁净的纸巾上，使沉淀干燥。</li>
	<li>向沉淀中加入 30 μL 重悬缓冲液（10 mM Tris/HCl，pH 8.0，1 mM EDTA）。</li>
	<li>将 DNA 置于加热块中 65 °C 孵育 10 分钟，以灭活 DNase。</li>
</ol>
3. 使用 PCR 扩增 D1S80 VNTR 位点
注意：记录将要使用的样本数量，并在收集必要的塑料器皿和其他材料之前，准备好包含所需试剂及其体积的工作表。用样本编号标记将用于 PCR 的无菌管/条板/板。记得设置一个阴性对照，使用 H2O 代替 DNA，以及一个阳性对照（例如，&#160;使用教师提供的 DNA），以验证 PCR 的有效性。
<ol>
	<li>配制1x PCR预混液，其中包含10 μL的5x PCR反应缓冲液（含15 mM MgCl2）、1 μL脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）（10 mM）、各5 μL（10 pmol）引物pMCT118-f和pMCT118-r（正向引物：5'-GAAACTGGCCTCCAAACACTGCCCGCCG-3'，反向引物：5'-GTCTTGTTGGAGATGCACGTGCCCCTTGC-3'），参照Kasai等人的方法2，加入23.8 μL超纯H2O和0.2 μL Taq DNA聚合酶（5 U/µL）。 
	注：引物pMCT118-f/pMCT118-r设计于D1S80 VNTR区域侧翼序列，用于扩增整个基因座。</li>
	<li>用待测样本编号标记PCR管/条带或PCR板。</li>
	<li>将45 μL预混液分装至每个已标记的PCR样本管或孔中。</li>
	<li>向每管/孔中的预混液加入5 μL DNA模板，使总体积达到50 µL。每次加不同DNA样本时均需更换移液器吸头，以避免交叉污染。</li>
	<li>设置无模板对照（NTC），以超纯H2O代替DNA模板。</li>
	<li>盖紧PCR管/条带或密封PCR板，并混匀内容物。</li>
	<li>使用台式离心机对PCR管/条带/板离心20秒。 
	注：本方案中提供的PCR条件已针对所使用的DNA聚合酶和PCR热循环仪进行了优化。通常情况下，PCR条件需根据所用DNA聚合酶进行调整。Taq DNA聚合酶的标准延伸时间为1 min/kb。</li>
	<li>将样本管/条带或板放入热循环仪中，按以下程序进行扩增反应（基于DNA聚合酶的延伸时间）：95 °C预变性2分钟，1个循环；随后进行25个循环：94 °C变性15秒，60 °C退火15秒，72 °C延伸30秒；最后72 °C终延伸10分钟，1个循环。</li>
	<li>程序结束后，从热循环仪中取出产物，于4 °C过夜保存或置于-20 °C保存直至进行电泳分析。</li>
</ol>
4. PCR产物的琼脂糖凝胶电泳
<ol>
	<li>制备1.5%琼脂糖凝胶。
	<ol>
		<li>取1.5 g琼脂糖粉末，加入100 mL 1×Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液于烧瓶中混合。</li>
		<li>在微波炉（600 W）中加热约1.5–2分钟。若琼脂糖未完全溶解，轻轻摇动烧瓶并再次加热，直至完全溶解。稍作冷却后，向琼脂糖溶液中加入2 μL PeqGreen。</li>
		<li>将凝胶倒入模具中，使用带有足够孔数的梳子，确保可容纳所有样品，并至少加入一个分子量标记物。 
		警告：可能发生暴沸现象。重新悬浮未完全溶解的琼脂糖时，请小心摇动烧瓶。 
		注：PeqGreen是一种用于核酸检测的无毒染料，适用于双链DNA（dsDNA）、单链DNA（ssDNA）以及RNA的染色，其灵敏度与溴化乙锭相当。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从4 °C取出PCR产物，离心约10秒。</li>
	<li>每孔加入10 μL样品，避免过载。 
	注：DNA聚合酶缓冲液中含有可增加样品密度的成分，因此样品可直接上样至凝胶，无需额外添加上样染料。这有助于样品沉入加样孔，而染料则可用于追踪DNA样品的迁移距离。
	<ol>
		<li>在两侧边缘孔中加入分子量标准品（建议使用50 bp分子量标准品）。 
		注：将剩余的PCR样品保存于-20 °C，以备琼脂糖凝胶电泳需要重复时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在1×TAE电泳缓冲液中，以150 V（恒定电压）电泳约40分钟，或直至迁移速度相当于约50 bp的下部黄色染料前沿到达凝胶底部。</li>
	<li>在蓝光或紫外光（UV）照射下成像凝胶，并记录图像用于片段长度分析。 
	警告：紫外光可能损伤眼睛和皮肤。使用紫外灯箱时，请务必穿戴防护服并佩戴防紫外眼镜。</li>
	<li>根据机构的危险材料处理政策处置凝胶。</li>
</ol>
5. 片段长度结果分析
注意：使用线性回归分析来估算片段的长度。
<ol>
	<li>为了测定 D1S80 PCR 片段的大小，将标尺放置在凝胶照片的 50 bp 分子量标准泳道上，使标尺顶端与样品加样孔底部对齐（图 1）。 
	注意：计算分子量标准（50 bp 分子量标准）的线性回归方程时使用了电子表格程序。</li>
	<li>使用电子表格程序记录 50 bp 分子量标准每个条带距加样孔的距离（例如，以 cm 为单位），并填入表格中（图 2）。</li>
	<li>计算 50 bp 分子量标准各片段大小的对数值（例如，以 10 为底），并将对数值填入表格中（图 2）。</li>
	<li>绘制散点图，以条带大小的对数值为纵轴（y 轴），以分子量标准各条带从凝胶顶部到条带的迁移距离为横轴（x 轴），将每个数据点标在图上（图 3）。</li>
	<li>拟合趋势线（线性回归线），并在图上显示回归方程（y = ax + b）和 R2 值（图 4）。</li>
	<li>测量每个 D1S80 扩增子&#160;的迁移距离（例如，以 cm 为单位）（图 5）。</li>
	<li>使用回归方程估算每个 D1S80 扩增子&#160;的大小：y = ax + b 
	其中 y = 片段大小的对数值 
	&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;a = 直线的斜率（由第 5 步计算得出） 
	&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;x = 从加样孔起的距离（单位为 cm） 
	&#160; &#160; &#160; &#160; &#160; &#160;b = 回归线与 y 轴的截距（由第 5 步计算得出） 
	&#8203;注意：由于 y 值代表片段大小的对数值，必须计算其反对数（10y）以获得 D1S80 扩增子的片段大小（单位为 bp）。</li>
</ol>
6. 受试个体等位基因中重复单位数目的估算
注意：D1S80 重复单元长度为 16 bp。D1S80 已知最小的等位基因含有 14 个重复。此处描述的扩增子方案所产生的扩增子，其侧翼区域会额外增加 145 bp 的最终长度。
<ol>
	<li>使用表1估算每个PCR片段中包含的重复单位数量。通过线性回归推算出的大小应与任何特定等位基因相差不超过8 bp。</li>
	<li>将每个被测个体的基因型记录为等位基因重复大小数值的组合。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种在本科生实验课程中实施分子指纹图谱分析的简单且成本效益高的方法。
为了筛查 D1S80 位点的遗传变异，需要进行人类生物样本的采集以及DNA提取与分析。在整个过程中，必须确保人类生物样本的使用符合伦理要求。样本管理需遵循全面的监管框架，以确保样本及其相关数据的正确使用18（例如，获取使用人类生物材料的知情同意）。应充分告知参与者其样本的用途、发现遗传关系异常的风险（例如，亲属之间的关系异常）、隐私保护措施，以及生物样本和数据未来储存的计划。所有供体（学生或同事）必须在充分知情的前提下自愿签署同意书，并了解其有权随时撤回同意且无需说明理由。通常情况下，在开展本实验课程之前，必须熟悉有关人类样本管理的相关指南和法规。
在本科实验课程中采集颊黏膜上皮细胞时，必须注意避免操作者DNA或DNase对DNA样本造成污染。建议始终穿戴实验服、手套和防护眼镜，并使用无菌拭子和微量离心管。基于颊拭子的细胞采集方法被认为是一种方便且经济有效的遗传物质收集方式，适用于基于PCR的VNTR分析，因其相对廉价且无创。除颊拭子外，唾液是医学研究中最常见的口腔取样方法。研究表明，与唾液相比，颊拭子含有更高比例的上皮细胞，因此在为基于PCR的D1S80 VNTR分析提供足量且高质量的DNA方面更为可靠19,20。此外，在进行人群多样性研究等应用中，颊拭子可在自采样后邮寄寄送，从而克服地理障碍21。
由于不同公司开发了多种提取试剂盒，DNA 提取已变得相对容易。然而，由于经费有限，这些试剂盒在实验教学中可能并不适用。本文介绍一种无需商业DNA提取试剂盒、从人源样本中提取DNA的简便、快速且成本低廉的方法。该DNA提取方法不使用有机溶剂，而是通过添加8 M醋酸钾溶液提高盐浓度，从而去除细胞中的蛋白质。此方法还可同时处理多个样本，每个样本均可获得足量DNA，满足多次基因型分析的需求。
PCR 是许多分子生物学实验室中常用的技术。尽管该技术通常不会出现问题，但仍存在一些可能导致反应产生虚假结果的陷阱，这些问题在其他地方已有讨论22。本文所采用的 PCR 条件在面对模板 DNA 质量较差的情况下表现出很强的稳健性，但在使用因口腔上皮细胞采集不佳而导致 DNA 浓度极低的模板时，偶尔仍会出现 PCR 扩增失败的情况。本研究中使用的 DNA 引物可从不同的公司订购，例如本文末尾材料表中引用的公司。操作 DNA 引物时必须格外小心，以避免受到操作者来源的 DNase 或 DNA 污染。不使用时，PCR 产物也应保持低温保存。
另一个关键步骤是琼脂糖凝胶电泳。仅相差一个16 bp重复单位的片段可能无法在凝胶电泳中分离，因此会表现为一条单一的条带。在这种情况下，无法准确确定所检测的D1S80等位基因的重复单位数目。因此，应延长凝胶电泳的运行时间，同时降低电压，并可适当提高凝胶浓度，以获得更好的分辨率和单一条带的分离效果。
需要指出的是，并非所有VNTR位点的等位基因都包含完整的重复单位。在大多数VNTR位点，存在包含不完整重复单位的非共识等位基因（微变异体），其大小介于具有完整重复单位的等位基因之间。这些微变异体几乎无法通过琼脂糖凝胶电泳检测到。相比之下，聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳等技术能够分辨仅相差一个或少数几个重复单位或微变异体的等位基因12,23,24,25,26。然而，这些技术由于存在使用危险化合物、制备过程复杂以及设备缺乏等众多缺点，不太适合本科教学实验课程。在进行片段大小测定时，必须仔细测量DNA片段迁移的距离。如果条带过于弥散而难以精确测量，则通过线性回归计算D1S80等位基因片段大小可能会产生错误，导致重复单位数目的估算不准确。在此情况下，建议优化凝胶条件后重新进行琼脂糖凝胶电泳，如Lorenz及其同事此前所述22。
从口腔上皮细胞采集到片段长度分析的整个 D1S80 VNTR 分析流程可在单个工作日内完成。本方案是一种稳定、经济且易于操作的方法，适用于本科生实验课程。

分子指纹技术，也称为DNA指纹技术，由Alec Jeffreys爵士于1984年在莱斯特大学遗传学系工作时首次提出1。该技术基于人类基因组中个体间存在差异的0.1%区域，这部分包含约三百万个变异位点。这些基因型上的独特差异使得个体之间可以被区分，因此可作为遗传指纹，仅同卵双胞胎除外。因此，DNA指纹技术可用于评估不同个体之间的亲缘关系，例如应用于亲子鉴定或群体多样性研究。在我们的实验课程中，旨在传授DNA指纹技术和等位基因频率的概念。本文所述方法通过分析D1S80位点上的可变数目串联重复序列（VNTR），展示了一种可靠且稳健的遗传指纹分析方法。该方法包括从口腔黏膜上皮细胞中提取DNA，随后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增D1S80位点，最后在琼脂糖凝胶上显示片段长度的差异。
的 D1S80 VNTR小卫星位点具有高度变异性，位于1号染色体端粒区域（1p36-p35）。Karsai及其同事于1990年鉴定并描述了该位点，其核心重复单元为16 bp，可实现仅相差一个重复单位的等位基因的分离2此外， D1S80 表现出高度变异，突变率约为 7.77 x 10-5&#160;3. D1S80 具有高度杂合性4,5 （例如，高加索人群的杂合度为80.8%）6 以及非裔美国人高达87%的杂合度7）。此外， D1S80 该位点在大多数群体中具有多态性，通常存在15种以上不同的等位基因，每种含有14至41次重复。其频率为 D1S80 等位基因在不同人群中存在差异。含有24个重复单位的等位基因（等位基因24）在欧洲和亚洲人群中最为常见，而等位基因21在非洲人群中最为普遍。4,7,8,9,10因此，等位基因频率分布对不同人类群体具有诊断意义，在估算亲缘关系（如亲子鉴定）时需予以考虑。
基于PCR扩增D1S80 VNTR位点的方法在法医学、亲子鉴定、疾病分析以及群体多样性研究中一直是一种非常有用的技术11,12,13,14。尽管在当今法医学领域，VNTR的应用已被短串联重复序列所取代，但D1S80 VNTR位点仍被广泛用于分析不同人群之间的起源关系和遗传关联4,8,9,11。此外，该方法常被用于实验教学课程中讲授DNA指纹技术15,16。本文所述方法具有高成功率，且稳健、经济、易于操作，适用于本科生实验课程。本文旨在概述从口腔黏膜上皮细胞中对人类D1S80小卫星位点进行分子分析的工作流程，内容包括已有文献中报道的技术演示、简化实验方案及实用建议2,17。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td>已高压灭菌</td></tr><tr><td>2 mL 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>7,26,95,500</td><td>已高压灭菌</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Fisher Chemical</td><td>PI7508/17</td><td></td></tr><tr><td>5x PCR 缓冲液</td><td>Promega</td><td>M7845</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma/Merck</td><td>A6283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>BioBudget</td><td>10-35-1020</td><td></td></tr><tr><td>口腔拭子</td><td>BioBudget</td><td>57-BS-05-600</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>5430</td></tr><tr><td>梳子</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTPs (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>R0192</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Honeywell</td><td>32221-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>凝胶制备模具</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电泳槽</td><td>BioRad</td><td></td><td>SubCell GT</td></tr><tr><td>凝胶成像系统 Gel Doc XR+</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凝胶托盘</td><td>BioRad</td><td></td><td>SubCell GT</td></tr><tr><td>GeneRuler 50 bp DNA 分子量标准</td><td>Thermo Fisher</td><td>SM0371</td><td></td></tr><tr><td>Go-Taq DNA 聚合酶</td><td>Promega</td><td>M7845</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>Eppendorf</td><td>Thermomixer</td><td>适用于 1.5 mL 和 2 mL 管</td></tr><tr><td>微波炉</td><td>Sharp</td><td></td><td>R-941STW</td></tr><tr><td>peqGreen</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;732-3196&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Gilson</td><td></td><td>1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 2 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Arcos Organics</td><td>217100010</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac 电源</td><td>BioRad</td><td></td><td>100-120/220-240V</td></tr><tr><td>引物</td><td>Sigma/Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Kern</td><td></td><td>PCB 2.5 kg</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Arcos Organics</td><td>218591000</td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td>IKA Labortechnik</td><td></td><td>IKA RH basic</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>myFuge</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>BioRad</td><td></td><td>C100 Touch</td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>103156x</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>LMS</td><td></td><td>VTX-3000L</td></tr></tbody></table>

使用 d1s80 位点进行dna指纹分析在实验课程中的应用

Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

在生物科学中，DNA指纹技术已广泛应用于亲子鉴定、法医学以及系统发育研究。本文介绍了一种在本科实验课程背景下，通过串联重复序列数量可变区（VNTR）分析对个体进行基因分型的可靠且稳健的方法。本实验方案采用人类D1S80 VNTR位点作为高度多态性的标记，其多态性基于重复序列拷贝数的差异。
本实验方案为教师在实践性实验课程中开展DNA指纹分析提供了有用的信息。在本实验中，通过DNA提取和PCR扩增，检测D1S80 VNTR位点的遗传变异。利用琼脂糖凝胶电泳显示PCR产物片段大小的差异。根据DNA分子量标准的片段大小与迁移距离之间的线性回归关系，计算出片段大小及重复次数。
通过本指南，学生应能够：
•  采集并提取口腔黏膜上皮细胞中的DNA 
•  进行PCR实验，理解各种反应组分的功能 
•  通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并解读实验结果 
•  理解可变数目串联重复序列（VNTRs）在DNA指纹图谱中的应用及其在生命科学中的意义

采用所述方案，对通过拭子采样获取的口腔黏膜上皮细胞中提取的人类基因组DNA进行了D1S80 VNTR位点分析（图6）。PCR扩增后，图1展示了含有D1S80扩增产物的琼脂糖凝胶电泳的典型结果。第1泳道为50 bp的分子量标准。紧邻分子量标准的为8个学生样本的PCR产物。第10泳道为阴性对照（NTC），其中以水代替模板DNA。大多数被分析的样本均清晰显示两条条带，代表在D1S80位点为杂合子的个体。第2泳道和第9泳道显示单一条带，代表在D1S80位点为纯合子的个体。第5泳道显示一条模糊且明显宽于其他条带的单一条带，这可能是由于两个D1S80等位基因之间仅相差一个重复单位所致。在后续分析中，第5泳道的样本将被视为单一条带，代表一个纯合子个体。
对已验证的 PCR 产物进行下游凝胶电泳片段分析，用于测定不同学生样本中D1S80 VNTR 位点的片段大小。PCR 分析所得扩增片段大小的解读依赖于所使用的分子量标准。测量并记录每个分子量标准条带距加样孔的距离（图 1）（图 2）。根据条带大小及其迁移距离，可通过线性回归分析计算出各样本条带的大小。确定学生样本中各条带的对数值（以 10 为底）（图 5），其相应的反对数值即代表每个扩增片段的碱基对（bp）数目。根据所获得的扩增片段大小，可计算出重复单位的数目（Table 2）。
针对每个学生样本，通过线性回归计算扩增片段大小，每条条带均可明确分配至特定等位基因，如表2所示。D1S80等位基因大小的信息可用于确定本科学生小群体中各等位基因的频率。在学生群体中，28次重复等位基因频率最高，因其存在两个该重复等位基因的纯合个体（个体1和4）。第二常见等位基因为18次重复等位基因，由纯合个体8和杂合个体6携带。低频等位基因包括21次、26次和30次重复等位基因，分别仅在个体6、5和3中各出现一次。D1S80 VNTR位点在该小规模学生群体中的等位基因频率分布可进一步与更大人群的等位基因频率进行比较，例如来自不同大陆的人群4，7，8，9，10。
在这些学生中，2号和3号个体共享24次重复等位基因，2号和7号个体共享20次重复等位基因，5号和7号个体共享23次重复等位基因。有趣的是，这两个 D1S80 纯合个体（个体1和4）共享28次重复等位基因。两个个体之间等位基因的匹配可能提示潜在的亲缘关系，但等位基因的共享也可能随机发生。因此，确定两个个体间等位基因匹配的概率至关重要。该概率取决于该等位基因在总体人群中的频率，应采用统计学方法（如贝叶斯方法）为VNTR标记分析赋予统计权重。综上所述，所介绍的指纹图谱方法可用于教学实践课程，帮助学生掌握VNTR在DNA指纹图谱中的应用及其在生命科学中的实际用途。
<img alt="DNA电泳结果；凝胶条带；DNA大小标记；泳道分析；分子生物学实验" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 1"> 
图 1：将D1S80扩增产物进行电泳后琼脂糖凝胶的图示，其中50 bp分子量标准泳道旁放置了标尺。 第1泳道为50 bp分子量标准，第2–9泳道为PCR反应产物，第10泳道为无模板对照（NTC）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA片段大小与迁移距离关系图；公式 log10(bp)；Excel 数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：50 bp 分子量标准中 DNA 片段迁移距离及其片段大小对数的测定。记录 50 bp 分子量标准每个条带距加样孔的距离（单位：cm），并计算每个片段大小的以 10 为底的对数（log）。将数值输入电子表格程序生成表格。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="表示DNA片段分离分析的碱基对与迁移距离的对数图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：以分子量标准物的DNA片段迁移距离为横轴，以其片段大小的对数值（以10为底）为纵轴绘制的散点图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="静力平衡；线性回归图；log10(碱基对) 与距离的关系；方程 y=-0.2255x+3.9013。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 4"> 
图 4：利用数据的线性回归线、回归方程以及 R2 值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="遗传数据电子表格，等位基因距离分析，公式：10^(-0.2255*D10)+3.9013，纯合子与杂合子。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 5"> 
图 5：D1S80 扩增片段大小的确定。每个片段从加样孔迁移的距离代入回归方程中。y 值的反对数即为片段的大小（单位：bp）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="DNA提取和PCR步骤示意图：基因组DNA、热循环仪、凝胶电泳分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig6v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图6"> 
图6：D1S80 VNTR分析建议的时间线与工作流程。本文所述的D1S80 VNTR分析全过程，从口腔上皮细胞采集到片段长度评估，可在单个工作日内完成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig6v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>等位基因大小（bp）</td>
			<td>重复次数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>369</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>385</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>401</td>
			<td>16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>417</td>
			<td>17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>433</td>
			<td>18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>449</td>
			<td>19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>465</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>481</td>
			<td>21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>497</td>
			<td>22</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>513</td>
			<td>23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>529</td>
			<td>24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>545</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561</td>
			<td>26</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>577</td>
			<td>27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593</td>
			<td>28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>609</td>
			<td>29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>625</td>
			<td>30</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>641</td>
			<td>31</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>657</td>
			<td>32</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>673</td>
			<td>33</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>689</td>
			<td>34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>705</td>
			<td>35</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>721</td>
			<td>36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>737</td>
			<td>37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>753</td>
			<td>38</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>769</td>
			<td>39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>785</td>
			<td>40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>801</td>
			<td>41</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：每个 D1S80 VNTR 位点的扩增子大小。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>个体</td>
			<td>等位基因</td>
			<td>距离（厘米）</td>
			<td>大小（bp）</td>
			<td>重复单元数目</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>纯合子</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>杂合子</td>
			<td>5.2 ; 5.5</td>
			<td>535, 458</td>
			<td>24, 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>杂合子</td>
			<td>4.9 ; 5.2</td>
			<td>626, 535</td>
			<td>30, 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>纯合子</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>28</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>杂合子</td>
			<td>5.1 ; 5.3</td>
			<td>564, 508</td>
			<td>26, 23</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>杂合子</td>
			<td>5.4 ; 5.6</td>
			<td>483, 435</td>
			<td>21, 18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>杂合子</td>
			<td>5.3 ; 5.5</td>
			<td>508, 458</td>
			<td>23, 20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>纯合子</td>
			<td>5.6</td>
			<td>435</td>
			<td>18</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：所检测不同个体的等位基因组成。 重复单位的数量可通过线性回归分析获得的扩增子大小进行估算。

本文介绍一种简单的方法，通过扩增上皮细胞DNA中的VNTR位点D1S80来生成DNA指纹图谱。

使用 D1S80 位点进行DNA指纹分析在实验课程中的应用

在生物科学领域，DNA指纹技术已广泛应用于亲子鉴定、法医学以及系统发育研究。本文中，我们描述了一种……

DNA指纹技术是生物科学中常用的一种工具，广泛应用于亲子鉴定以及法医学或系统发育研究。本实验方案旨在为本科生在实验课程中提供DNA指纹技术的基本原理。该方案基于人类D1S80位点，即一个串联重复序列数目可变的区域，其等位基因在不同个体间长度可能存在差异。提取DNA、进行PCR、凝胶电泳及后续分析操作可能较为复杂，尤其是初次操作时。通过所有步骤的可视化演示，观看者可以观察到执行这一高度稳健的实验方案时所需遵循的常规操作、细节要点以及必须采取的预防措施。要从颊黏膜上皮细胞中提取DNA，首先使用无菌口腔拭子采集细胞。使用拭子在口腔内侧用力擦拭 30 至 40 秒。将采集拭子的尖端放入已标记的无菌微量离心管中，并折断超出管口的塑料杆部分，然后盖紧管盖。将加热块预热至 65 摄氏度，并准备好所有所需的缓冲液和溶液。加入500 µL裂解液至拭子中，确保样本完全浸没在裂解液中，并涡旋混匀至少5秒。将样本在65 °C孵育10分钟，期间偶尔涡旋。孵育结束后，通过将拭子在管壁上按压以回收最大量的样本，然后移除拭子。加入100 µL变性缓冲液以裂解细胞，通过反复倒置离心管充分混匀，直至出现白色沉淀。室温孵育5分钟，然后在17,950 ×g条件下离心5分钟。将450 µL上清液转移至一个新的1.5 mL微量离心管中。随后加入450 µL异丙醇，通过反复倒置离心管充分混匀，以沉淀DNA。室温孵育5分钟，然后离心5分钟。弃去上清液，将离心管倒置于干净的纸巾上，使沉淀干燥。用500 µL 70%乙醇洗涤DNA，短暂离心1分钟，弃去上清液。为彻底干燥沉淀，将样品置于加热块中，在65摄氏度下孵育5分钟。最后加入30微升洗脱缓冲液，在65摄氏度下孵育10分钟以灭活DNA sys。通过将绿色PCR缓冲液、dNTPs、引物、水和聚合酶加入微量离心管中来配制预混液。用样本编号标记PCR管，并向每根PCR管中分装45 µL的PCR预混液。接着，加入5 µL DNA；对于无模板对照，则加入水。盖紧PCR管，短暂离心。将试管放入热循环仪中，并启动PCR程序。程序结束后，将样品置于4摄氏度保存，待后续处理。配制1.5%琼脂糖凝胶：称取1.5克琼脂糖粉末，加入100毫升TAE缓冲液于瓶中混合。将琼脂糖混合物小心地放入微波炉中加热，并在加热过程中不时轻轻摇晃，直至琼脂糖完全溶解。注意可能出现暴沸现象。琼脂糖混合物稍作冷却后，加入 2 µL 的 Pec green。倒入凝胶，并使用具有足够加样孔的梳子。琼脂糖凝胶完全聚合后，在每个加样孔中加入10微升PCR样品，并在两侧的加样孔中加入分子量标准品。以150伏电压电泳约40分钟。为了观察PCR产物，使用紫外光成像凝胶。在分析扩增的D1S80等位基因时，将一把尺子放置在分子量标准条带旁，从照片凝胶图像上的加样孔开始对齐。测量每个分子量标准条带的迁移距离，并将长度记录在表格计算程序中。接下来，计算分子量标准中每个片段大小的对数值。使用经对数转换的分子量标准片段大小以及凝胶中测得的迁移距离绘制散点图。拟合趋势线，并显示回归方程和 R 平方值。在新表格中，填入 PCR 扩增片段到加样孔的距离数据。为确定这些扩增片段的大小，使用线性回归所得的回归方程，计算其反对数，从而获得扩增片段的碱基对大小。最后，为每个测定的扩增片段分配 16 个碱基对的重复单位。所有受试个体的DNA提取及D1S80位点的扩增均成功完成，第10泳道的无模板对照未显示任何扩增产物。通过片段长度分析，可将个体分类为纯合子或具有两个等位基因的杂合子。串联重复序列的重复单位数目具有明确的对应关系，现可用于进一步分析。本文介绍了一种在本科生实验课程中实施分子指纹图谱分析的简单且经济有效的方法。整个实验过程可在一天内完成，包括四个不同的步骤。第一步是制备DNA模板。通过拭子采样获取颊部上皮细胞。口腔拭子是一种可靠的工具，可提供足量且高质量的细胞用于DNA提取。此外，该DNA提取方案不使用有机溶剂，这在本科生实验课程中具有优势。第一步可在90分钟或更短时间内完成。在第二步中，通过PCR扩增D1S80位点。此处提供的PCR条件十分稳健，即使DNA模板质量较差也能有效扩增。此步骤可在2个半小时内完成。随后通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。与其他技术相比，琼脂糖凝胶电泳具有多种优势，例如避免使用有害组分以及制备方法简单。该分析可在90分钟内完成。电泳结束后，可通过线性回归分析在90分钟内完成片段长度结果的分析，分析可使用表格计算程序或简单计算器进行。总之，所介绍的指纹图谱方法可用于实践教学，以讲授分子标记的使用及其在生命科学中的应用。

application-of-dna-fingerprinting-using-the-d1s80-locus-in-lab-classes

Research

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由Mycobacterium leprae引起的麻风病在许多地区仍呈地方性流行。为了了解麻风病的传播方式和传播途径，确定患者感染的是哪种M.

使用可变数目串联重复序列（VNTR）- 片段长度分析（FLA）对Mycobacterium leprae菌株进行DNA指纹图谱分析

细胞生物学的一个基本研究目标是阐明构成真核细胞的细胞器身份特征背后的机制。本文提出一种利用荧光显微镜和下一代测序技术鉴定植物细胞器形态与功能完整性的相关基因的方法。...

荧光显微镜筛选与高通量测序：鉴定参与细胞器完整性的基因的有用工具

我们描述了一种利用直接标记的荧光探针，通过三维DNA荧光原位杂交（3D DNA...

使用直接标记探针的稳定3D DNA FISH方法

本文介绍了一种优化且高效的去除策略，用于收集“接触DNA”样本中存在的生物微粒，并结合一种增强的扩增方案，该方案涉及一步法5...

简化显微操作从法医“接触DNA”证据中回收单个人源生物微粒的增强型遗传分析

该方案描述了一种对单核苷酸多态性敏感的荧光原位杂交（SNP-FISH）方法，用于区分源自黑腹果蝇（Drosophila...

单核苷酸多态性敏感的FISH检测法用于果蝇（Drosophila melanogaster）位点特异性核糖体RNA转录的检测

在本文中，我们描述了一种用于功能性检测转录过程以及针对细菌转录的抗菌剂抑制活性的实验方案。...

体外 转录实验及其在药物发现中的应用

本文描述了非靶向代谢组学、转录组学及多变量统计分析在葡萄果实转录本和代谢物研究中的应用，旨在深入理解风土（terroir）概念。...

风土概念通过葡萄果实代谢组学与转录组学的解析

果蝇 卵子发生过程在研究线粒体增殖与遗传方面仍然具有极高的应用价值。本文描述了一种用于标记正在复制的线粒体DNA（mtDNA）的详细实验方案。 果蝇...

原位 线粒体DNA复制的标记 果蝇 通过EdU染色标记成年卵巢

学习使用D1S80位点进行DNA指纹分析的完整实验流程，包括口腔上皮细胞DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳及片段分析。该方法专为本科分子生物学教学设计，操作简便且成本低廉，可在单个工作日内完成全部步骤。

使用 D1S80 位点进行DNA指纹分析在实验课程中的应用

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