Name: 使用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群的神经元树化延时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 了解利用稀疏腺相关病毒标记结合共聚焦显微镜对小鼠视网膜神经元树突进行高分辨率活体成像的方法。该技术可实现发育中神经元树突动态的三维延时可视化，为神经形态发生研究提供重要工具。

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我们感谢Madison Gray在我束手无策时伸出援手。本研究得到了加拿大自然科学与工程研究委员会发现基金（RGPIN-2016-06128）、斯隆神经科学研究员项目以及加拿大研究主席二级讲席（授予J.L.L.）的支持。S. Ing-Esteves获得了视觉科学研究项目及加拿大自然科学与工程研究委员会研究生奖学金-博士阶段的支持。

作者无任何披露事项。

本视频展示了一种实验流程，该流程利用现有的遗传工具，通过共聚焦活体成像技术对发育中视网膜神经元的树突动态进行成像。同时演示了向新生小鼠眼内注射编码膜靶向荧光蛋白的Cre依赖型腺相关病毒（AAV）。在基因靶向的细胞群体中，单个细胞可在注射后4-5天（dpi）即被显著标记。制备视网膜平铺标本以适用于标准成像腔室，进行活细胞共聚焦成像。该方法可生成单个细胞及其细微突起的高分辨率延时视频。利用开源软件（包括ImageJ、Vaa3D和ShuTu）以及Imaris和MBF Bioscience提供的授权软件中的去卷积和后期处理算法，可对细小突起进行分辨与定量分析。由于该流程具有模块化特性，每个实验步骤均可根据研究目标进行调整。以下将讨论这些模块化要素，包括：1）Cre品系的选择，2）荧光蛋白与病毒载体的选择，3）基因递送方法，以及4）成像方法。
该技术利用Cre转基因小鼠品系实现对视网膜细胞亚群的遗传学操控。为提高病毒感染和细胞标记的概率，Cre需在出生后具有活性，并在注射时于目标细胞群体中广泛表达。在本研究中，采用ChAT-Cre靶向星形无长突细胞，Vglut2-Cre品系用于靶向发育中的视...

视网膜神经元的树突形成复杂而特异的形态模式，影响其在神经环路中的功能。在脊椎动物视网膜中，多种类型的视网膜神经节细胞（RGCs）和无长突细胞中间神经元具有独特的树突形态，其树突丛的大小、位置、分支长度和密度各不相同1。在出生后发育过程中，RGCs和无长突细胞将丰富的树突突起延伸至一个称为内丛状层（IPL）的神经网状区域，在此处接收由双极细胞传递的光感受器信号2。通过延时成像技术对鸡或斑马鱼幼体中荧光标记的视网膜细胞群体进行观察，发现树突形态发生过程高度动态3,4,5。在数天内，树突丛迅速扩展、重塑并分支，最终局限于IPL的特定亚层，并与特定的突触伙伴形成连接。在发育过程中，树突丛表现出不同的结构动态特征，包括分支新增、回缩和稳定化的相对速率发生变化。无长突细胞和RGC的树突也表现出不同的生长和重塑行为，这可能反映了细胞类型特异性的树突分支模式。然而，这些研究主要追踪的是广泛的无长突细胞或RGC群体，并聚焦于层状靶向，而层状分布仅是形态学的一个方面。
目前对产生视网膜不同亚型之间广泛形态多样性的机制仍知之甚少。本研究团队的目标是建立一种方法，用于捕获小鼠特定视网膜亚型中树突动态及其树突分支重塑的过程。要鉴定细胞类型特异性的树突模式形成机制，需要具备可视化并量化目标细胞树突行为的方法。小鼠视网膜的器官型培养适用于使用共聚焦显微镜或双光子显微镜进行活细胞成像研究。发育中的视网膜可被解剖并制备成扁平状外植体，可在记录室中持续成像数小时，或在数天的培养过程中保持神经环路基本不受影响6,7。活体视网膜神经元可通过多种技术进行标记，包括电极染料填充、电穿孔、通过基因枪将包裹脂溶性染料或编码荧光蛋白的质粒的微粒进行弹道式递送，以及使用遗传编码的细胞标记物7,8,9,10。然而，这些方法在成像特定视网膜亚型的树突动态方面效率较低。例如，染料填充法通量低，且需要电生理设备以及额外的遗传标记，才能可靠地靶向目标细胞。此外，胞体中强烈的荧光信号可能遮蔽邻近的树突结构。
基因枪递送方法可同时标记数十个细胞，但涉及高压颗粒递送及离体视网膜过夜孵育的步骤可能损害细胞生理状态及树突的生长。本文提出，在满足以下实验条件的前提下，可利用近期发展的遗传学工具，在细胞类型和结构分辨率水平上捕捉早期树突动态。首先，为解析在发育过程中占主导地位的细小分支和丝状伪足，该方法应使用明亮且能完整填充整个树突结构的荧光蛋白对神经元进行标记。在成像期间，荧光标记不应因光漂白而减弱。目前已开发并比较了多种荧光蛋白变体，根据其亮度和光稳定性，评估其适用于活体/离体&#160;成像的效果11。其次，荧光蛋白（XFPs）必须在树突形态发生的最早阶段即达到足够高的表达水平，以避免错过短暂的发育窗口。在对小鼠视网膜静态时间点的分析中发现，树突发育发生在出生后第一周，包括生长、重塑和稳定等阶段10,12,13,14,15。第三，该方法应实现对目标神经元亚群的选择性标记，或显著提高其标记概率。&#160;第四，目标亚群的标记必须足够稀疏，以便识别并追踪完整的神经元树突结构。&#160;尽管RGC和无长突细胞亚型可通过其成熟的形态特征及内丛状层（IPL）的分层模式加以区分16,17,18,19,20，但挑战在于如何基于未成熟的结构在发育过程中识别这些亚型。随着转基因工具的发展，可在发育过程中特异性地标记特定视网膜细胞类型，从而促进了这一任务的实现。
利用基因调控元件决定荧光蛋白或 Cre 在细胞内和时间上的表达模式，转基因和基因敲入小鼠品系被广泛用于研究视网膜细胞类型13,21,22,23。关于树突发育的亚型特异性模式的关键发现，主要来自在静态时间点对转基因小鼠视网膜的研究10,14,24,25。特别是 Cre-Lox 系统，能够利用多种依赖重组酶的报告基因、传感器和光遗传学激活工具，实现对亚型的精细基因操作和监测。这些工具促进了对视网膜环路组装过程中起关键作用的亚型特异性分子程序和功能特性的发现26,27,28,29,30。然而，这些方法尚未被用于研究小鼠视网膜中树突动态的亚型特异性特征。通过将 Cre 小鼠品系与电穿孔或重组腺相关病毒（AAV）导入的转基因相结合，可实现低密度标记。若有条件，也可使用他莫昔芬诱导型 Cre 品系或交叉遗传策略。最后，应以最小侵入性的方式对细胞进行标记，并采用不影响组织状态或干扰树突形态发生所需细胞功能的成像参数进行观察。
本文介绍了一种利用转基因工具和共聚焦显微镜研究活体小鼠视网膜外植体中树突动态的方法。将Cre转基因小鼠品系与在Cre重组后表达荧光蛋白的AAV载体相结合，可实现对特定视网膜细胞的稀疏标记。 commercially available AAVs通过玻璃体内注射递送至新生小鼠视网膜。本文证明，AAVs在感染后4天（4 dpi）即可产生显著高水平且细胞类型特异性的荧光表达，从而可研究出生后的时间点。为展示该方法，将Brainbow AAV递送至表达胆碱乙酰转移酶（ChAT）-内部核糖体进入位点（IRES）-Cre转基因的新生小鼠，以标记胆碱能“&#34;星爆&#34;”无长突细胞，该转基因在出生后早期视网膜中具有活性31,32。星爆无长突细胞发育出典型且呈放射状的树突分支形态，该形态由成簇原钙黏蛋白介导的树突自我回避机制塑造33,34。本文表明，通过在XFPs上添加经历法尼基化的CAAX基序（如Brainbow AAV所用），将荧光蛋白靶向细胞膜，可显著提高对星爆细胞树突及丝状伪足的分辨率31。最后，已确定时间序列成像及后期图像处理方案&#160;，可获得高质量图像，适用于树突重建与形态计量学量化分析。该方案可用于鉴定调控树突发育的因素，并在完整视网膜中捕捉多种细胞行为。

<table><tbody><tr><td>Addgene 病毒制备品 #45185-AAV9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Addgene 病毒制备品 #45186-AAV9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;解剖工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纤维素滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001-070</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 精细镊子</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>视网膜显微解剖需要两把 Dumont #5 镊子</td></tr><tr><td>Dumont 镊子</td><td>VWR</td><td>82027-426</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>混合纤维素酯膜（MCE）滤纸，亲水性，0.45 &amp;micro;m 孔径</td><td>Millipore</td><td>HABG01 300</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，50 &amp;times; 15 mm</td><td>VWR</td><td>470313-352</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯一次性移液管</td><td>VWR</td><td>470225-034</td><td></td></tr><tr><td>圆头画笔，3/0 号</td><td>普通美术用品商店</td><td></td><td>视网膜平铺需要两支 3/0 号（或更小）画笔</td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>FST</td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪刀 - 2.5 mm 刃口</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;活细胞成像培养系统&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>腔室聚乙烯管，PE-160 10'</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0755</td><td></td></tr><tr><td>双通道加热控制器，型号 TC-344C</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2401</td><td></td></tr><tr><td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR 浸入式物镜</td><td>Leica</td><td>15506374</td><td></td></tr><tr><td>加热控制器电缆</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td></td></tr><tr><td>带切片支撑的大浴槽培养室</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td></td></tr><tr><td>MPII Mini-Peristaltic 泵</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>PM-6D 磁性加热平台（培养室加热器）</td><td>Warner Instruments</td><td>PM-6D</td><td></td></tr><tr><td>MPII Mini-Peristaltic 泵泵头管件</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-4148</td><td></td></tr><tr><td>样品固定锚（Harps）</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0260</td><td>样品固定锚必须与培养室兼容</td></tr><tr><td>Sloflo 在线溶液加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;新生期注射&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 微量注射器系列 700，可拆卸针头</td><td>Hamilton Company</td><td>80314</td><td></td></tr><tr><td>30 G 皮下注射针头（0.5 英寸）</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>4 英寸无芯薄壁玻璃毛细管（外径 1.0 mm / 内径 0.75 mm）&amp;nbsp;</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 99.8%（用双蒸水 [ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O] 稀释至 70%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV2453</td><td>Addgene 质粒 #45185&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP&lt;br/&gt; 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV2454</td><td>Addgene 质粒 #45186</td></tr><tr><td>ChAT-IRES-Cre 基因敲入转基因小鼠品系</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>快绿 FCF 染料含量 &amp;ge;85 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown 微电极拉制仪，型号 P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>绿色纹身膏</td><td>Ketchum MFG Co</td><td>329A</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4，液体，经无菌过滤，适用于细胞培养</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>气动 PicoPump</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>PV-820</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;含氧人工脑脊液（aCSF）试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>碳酰气（5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>AirGas</td><td>X02OX95C2003102</td><td>供应商可能因地区而异</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES，游离酸</td><td>Bio Basic</td><td>HB0264</td><td></td></tr><tr><td>盐酸溶液，1 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>pH 测试试纸（6.0–7.7）</td><td>VWR</td><td>BDH35317.604</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Bio Basic</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠（NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD007</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;软件&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>美国国立卫生研究院（NIH）</td><td>开源</td><td></td></tr></tbody></table>

利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

揭示树突分支模式的机制需要能够在发育过程中对树突进行可视化、成像和分析的方法。小鼠视网膜是研究神经元形态发生和连接性中细胞类型特异性机制的有力模型系统。视网膜亚型的组织结构和组成已明确界定，并且已有遗传工具可用于在发育过程中靶向特定细胞类型。许多视网膜细胞类型的树突和/或轴突被限制在狭窄的层内，这有利于进行活体延时成像。小鼠视网膜外植体培养适用于使用共聚焦或双光子显微镜进行活细胞成像，但目前尚缺乏在时间和空间分辨率上均优化的树突动态成像方法。本文介绍了一种利用Cre-Lox系统稀疏标记并成像特定视网膜细胞群发育过程的方法。所使用的商业化腺相关病毒（AAV）以Cre依赖的方式表达膜定位的荧光蛋白。在新生小鼠眼内注射AAV后4-5天即可实现靶向细胞类型的荧光标记。通过共聚焦成像可检测到膜上的荧光信号，并能分辨出精细的分支结构及其动态变化。通过对灌流含氧人工脑脊液（aCSF）的视网膜平铺标本进行成像，可获得持续2-4小时的高质量视频。同时提供了一套图像后期处理流程，用于去卷积和三维（3D）漂移校正。该方案可用于在完整视网膜中捕捉多种细胞行为，并鉴定调控神经突形态发生的 novel 因子。在视网膜中获得的许多发育策略将有助于理解中枢神经系统其他部位神经回路的形成过程。

采用上述方案，获得了星形细胞树突发育过程的高分辨率三维视频，并进行了去卷积及三维漂移校正。通过生成Z平面最大投影，制作了用于分析的二维视频补充视频 1, 图 5A）。对每个时间点进行三维去卷积处理，提高了细小丝状伪足突起的分辨率（图5B，C）。细小的丝状伪足突起是发育中视网膜树突的一个特征36 在成像过程中应能清晰观察到标记细胞。AAV转染会导致细胞标记密度和荧光强度存在变异性。因此，需对标记组织进行筛选，选择荧光信号强的细胞用于成像并获取高质量视频。不建议通过提高激光功率来检测荧光较弱的细胞，因为这可能导致快速光漂白，并使噪声水平显著高于信号强度。足够明亮的细胞在注射后5天（dpi）即可清晰可见。至12 dpi及之后，延长AAV感染时间并不一定会增强标记细胞的荧光强度。图5D).
过强的荧...

本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜研究出生后小鼠视网膜外植体中神经突形态发生的方法。我们描述了一种稀疏标记和获取视网膜细胞类型及其细微突起的技术，该技术采用表达膜定位荧光蛋白的重组腺相关病毒载体，并以Cre依赖的方式实现特异性标记。

发现调控树突分支模式的机制需要在发育过程中对树突进行可视化、成像和分析的方法。小鼠视网膜是一种……

研究神经元形态发生需要对单个细胞的树突或轴突进行标记和可视化。通过以最小侵入性方式标记正在发育的树突或轴突，视网膜组织可保持健康状态，适合长时间共聚焦活体成像。该方法的主要优势在于，注射后四天内即可利用多种荧光蛋白对单个树突或轴突进行可视化观察。这使得研究新生期神经元树突形态成为可能。该注射成像与分析方案可用于研究中枢神经系统中各类神经元的形态结构。必须根据目标细胞群体选择合适的Cre工具小鼠品系及注射位点。首先选择一种Cre小鼠品系，以标记目标视网膜细胞群体。获取编码荧光蛋白的重组酶依赖型AAV病毒。为了实现对细微突起的最优标记，应选择表达靶向细胞膜的修饰型荧光蛋白的载体。将AAV分装样品置于冰上，并使用无菌生理盐水或PBS制备1至4倍的AAV稀释液。为便于观察注射过程，可在每15微升AAV稀释液中加入约1微升0.02%的快绿FCF（Fast Green FCF）染料溶液，使溶液呈现蓝色。用70%乙醇对注射区域进行消毒。使用微量注射器将 AAV 稀释液回填至微量移液管中。在体视显微镜下，用 30 号针头轻折微量移液管尖端以打开封口。麻醉新生小鼠后，用 30 号针头将纹身墨水注入其足垫进行个体标记。采集尾部组织样本用于DNA提取和基因分型。用70%乙醇擦拭覆盖眼睛的皮肤。使用30号针头切开融合的眼睑，同时用手指轻轻按压以打开眼睛。在角膜与巩膜交界处的角膜上刺一个小孔。将玻璃微量移液管插入孔中，并踩下微注射仪脚踏开关两到四次，将AAV注入玻璃体腔。缓慢取出微量移液管，并通过观察瞳孔内的蓝色染料确认AAV注射成功。按照文稿中所述方法配制视网膜 aCSF 后，使用碳氧混合气体（carbogen）鼓泡至少 15 分钟以对其进行氧合，然后将 pH 值调节至 7.4。将一个直径为 60 毫米的培养皿嵌入冰盘中，并加入氧合后的视网膜 aCSF。将盛有溶液的培养皿置于体视显微镜下。 接下来，剪开已处死小鼠的眼睑瓣以暴露眼球。用钝头镊子摘除眼球，并将其转移至体视显微镜下盛有冷视网膜aCSF的容器中。在体视显微镜下，用Dumont #5镊子夹住视神经固定眼球，然后用30号针头在角膜中央刺一个小孔，再将显微剪的一侧刀尖插入小孔，从孔处沿角膜剪至角膜边缘。重复操作，在四个正方向上制作四个切口，形成四个瓣膜。用镊子夹住并拉开两个相邻的瓣膜，轻轻将巩膜从视网膜上剥离，完成所有角膜瓣的分离。然后用镊子从视网膜杯中取出晶状体。最后，使用显微剪刀从视网膜边缘向视神经方向做四个放射状切口，形成四个相等的瓣片。如果使用大直径的灰色MCE膜滤器进行封片，将圆盘切成大约一厘米宽的四个象限，然后将MCE圆盘置于较大白色滤纸的中央。使用两把3/0号画笔，将一个视网膜杯用画笔翻转，使视网膜神经节细胞侧朝下。轻轻将视网膜从aCSF中提起，确保表面张力不会撕裂视网膜。在仍用画笔夹持视网膜的同时，移开盛有aCSF的培养皿，将带有MCE膜的白色滤纸置于体视显微镜下。使用移液器，在MCE滤纸中央滴加一滴aCSF。利用表面张力和带电的MCE膜形成的aCSF液滴使视网膜漂浮其中。使用画笔将视网膜调整至液滴内，确保视网膜神经节细胞侧朝上，然后展开四个瓣膜。定位完成后，用画笔与白色滤纸之间形成水桥，以打破液滴的表面张力。组装活体成像培养室，并加入充氧的人工脑脊液（aCSF）。打开泵和温度控制器，确保温度不超过34摄氏度。培养室温度可能需要长达一小时才能稳定。建议在开始视网膜分离之前先设置好孵育腔。稳定的腔体温度有助于减少样本漂移。将视网膜平铺组织转移至灌流腔时，应停止泵液并移除腔内的 aCSF。然后将带有视网膜平铺片的MCE圆盘放入孵育 chamber 中。用液体预湿样品压片以破坏表面张力，随后将其放置在平铺样本上，确保样品压片置于MCE滤纸上，以减少样本漂移。重新向 chamber 中加入预热的aCSF，并以约1毫升/分钟的速度循环灌注aCSF。将物镜转至25倍水浸物镜位置，插入成像室。使用落射荧光光源筛选标记的目标细胞，并调节成像范围以捕获感兴趣的目标树突结构。利用可识别过饱和与欠饱和像素的查找表，调节激光功率，确保无任何像素过饱和。获取三维成像体积，并以所需的帧率重复采集。可在每个时间点之间调整成像体积，以补偿样品漂移。导入图像序列，并按时间对图像进行分割。手动保存所有时间点，或通过运行宏插件进行保存。使用 ImageJ 插件创建理论点扩散函数：单击“Defraction PSF 3D”，需要输入物镜数值孔径、荧光染料发射波长、像素大小和 Z 轴间距，以生成准确的点扩散函数。选择插件、宏，然后运行所提供的宏，对所有时间点执行批量并行迭代去卷积。通过点击文件、导入，然后选择图像序列，将所有去卷积后的时间点作为图像栈导入。通过点击图像、超栈，然后选择图像栈转超栈，将图像栈转换为超栈。输入Z切片数和时间帧数，然后使用校正3D漂移插件校正三维漂移。保存经三维漂移校正的超堆栈，并通过点击图像、超堆栈、超堆栈转堆栈，将图像转换回普通堆栈，然后通过点击图像、堆栈、工具和堆栈拆分器来拆分时间点。在“要拆分的子堆栈数量”中输入时间点的数量。使用批处理为所有时间点创建最大强度投影。通过点击文件、导入，然后选择图像序列，来导入延时图像序列。使用常规的 ImageJ 工具对去卷积并后处理后的二维视频进行所需的分析。获取了发育中星爆细胞树突的高分辨率三维视频，并对其进行去卷积处理以及三维漂移校正。生成了Z平面最大投影，以制作用于分析的二维视频，显示树突精细化区域和树突向外生长区域。每个时间点的3D去卷积处理提高了单个P6星形无长突细胞在去卷积前后的细小丝状伪足突起的分辨率，该处理使用ImageJ完成。延长AAV感染时间并不一定会增强荧光信号，因为在注射后5天和11天时蛋白质表达水平相似。在成像过程中减少样品漂移非常重要。通过保持成像温度恒定以及在样品上适当放置配重，可最大限度减少漂移。如果发生漂移，可通过手动采集时间序列，在各帧之间调整成像体积，从而确保目标特征始终保持在视野范围内。本方案可生成高分辨率、去卷积且漂移校正的神经突起发育三维视频。此类视频有助于更好地理解神经元的连接方式，并且对于推进三维形态发生计算分析方法至关重要。要实现对神经突起发育的高通量分析，需要更优的自动追踪和跟踪软件。

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神经科学

使用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群的神经元树化延时成像

在本视频中，提供了多色共聚焦延时成像和靶向细胞消融的技术。延时成像用于监测多种目标细胞类型的行为...

多色延时成像转基因斑马鱼：可视化通过靶向神经元细胞消融激活的视网膜干细胞

本文介绍了在视觉皮层中通过颅内注射腺相关病毒（AAV）载体对神经元和胶质细胞进行荧光标记的方法。...

颅内注射腺相关病毒载体

我们描述了一种在小鼠前脑中进行神经元迁移实时视频成像的实验方案。通过在急性活体脑片中利用宽场荧光成像技术，并以相对较短的时间间隔快速采集图像，记录经病毒标记或移植的神经前体细胞的迁移过程，以研究细胞迁移的不同阶段，包括静止期和迁移期的持续时间以及迁移速度。...

成年小鼠前脑急性脑片中神经母细胞迁移的延时成像

来源：Ing-Esteves, S. &amp;#38; Lefebvre, J. L. 利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群体进行神经元树突发育的延时成像。J. Vis. Exp.

小鼠视网膜外植体中神经元树突动态的延时共聚焦成像

为了研究视网膜疾病动物模型中血-视网膜屏障的通透性以及内界膜的完整性，我们使用了多种腺相关病毒（AAV）变体作为标记视网膜神经元和胶质细胞的工具。随后利用病毒介导的报告基因表达作为视网膜屏障通透性的指标。...

利用腺相关病毒作为工具研究疾病中的视网膜屏障

本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠压后皮层神经元的长期成像 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠中进行双光子显微成像，并结合向背侧海马注射表达 mCherry...

双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

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经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

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清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

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胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

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利用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向的视网膜细胞群体进行神经元分支的延时成像

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