使用稀疏腺相关病毒标记遗传靶向视网膜细胞群的神经元树化延时成像

需要单细胞标记和树突或轴突乔木的可视化来研究神经元形态发生。通过以微创方式标记发育中的心轴，视网膜组织保持健康，适合长时间共聚焦活体成像。该方法的主要优点是能够在注射后四天内可视化具有多色荧光蛋白的单个心轴。

这使得研究新生儿乔木形态学成为可能。该注射成像和分析方案可用于研究整个中枢神经系统的神经元形态。必须确定适当的Cre选择和注射位置以靶向感兴趣的细胞群。

首先选择Cre小鼠线来标记感兴趣的视网膜细胞群。获得编码荧光蛋白的重组酶依赖性AAV病毒。为了对精细过程进行最佳标记，请选择表达靶向质膜的修饰荧光蛋白的载体。

对于冰上的AAV等分试样，并使用无菌盐水或PBS制备一到四个AAV稀释液。为了可视化注射，通过每15微升AAV稀释液添加约一微升0.02%快速绿色FCF染料溶液，将溶液染成蓝色。用70%乙醇灭菌注射区域。

使用微量注射器用AAV稀释液回填微量移液器。在体视显微镜下，用30号针头打破微量移液器尖端以解封尖端。麻醉新生小鼠后，使用30号针头用纹身墨水纹身爪垫以识别动物。

收集尾部剪报以进行DNA分离和基因分型。用70%乙醇擦拭覆盖眼睛的皮肤。使用30号针打开融合的眼睑，同时用手指轻轻按压以睁开眼睛。

在角膜巩膜交界处的角膜上戳一个小孔。将玻璃微量移液器插入孔中，然后按压微型喷油器脚踏板两到四次，将AAV注入玻璃体内空间。慢慢取出微量移液管，并通过可视化瞳孔中的蓝色染料来确认AAV注射。

按照文本手稿中所述制备视网膜aCSF后，通过用碳水化合物冒泡至少15分钟来氧化视网膜aCSF，然后将pH值调节至7.4。将直径为60毫米的培养皿嵌入冰盘中，并用含氧视网膜aCSF填充。将装满的培养皿置于体视显微镜下。

接下来，切开安乐死小鼠的眼睑瓣以暴露眼睛。使用钝镊子对眼睛进行去核，并将其转移到置于体视显微镜下的冷视网膜aCSF中。在立体显微镜下，使用Dumont五号镊子扣住视神经来稳定眼睛，并用30号针头在角膜中心戳一个洞，然后将微型剪刀的一个尖端插入孔中，从孔到角膜末端做一个切口。

重复此步骤，在基本方向上制作四个切片，形成四个襟翼。抓住并拉开两个相邻的皮瓣，轻轻地将巩膜从视网膜上剥离所有角膜皮瓣。然后使用镊子从视网膜杯中取出晶状体。

最后，使用微型剪刀从视网膜边缘向视神经做四个桡向切口，形成四个相等的花瓣。如果使用大直径灰色MCE膜过滤器进行安装，请将圆盘切成大约一厘米宽的象限，然后将MCE圆盘放在较大的白色滤纸的中心。使用两个尺寸的三乘零油漆刷，将一个视网膜杯翻转到油漆刷上，视网膜神经节细胞面朝下。

轻轻地将视网膜从aCSF中抬起，确保水张力不会撕裂视网膜。在仍然拿着带有视网膜的画笔的同时，将含有acSF的培养皿移开，并将带有MCE膜的白色滤纸放在立体镜下。使用转移移液器，将一滴aCSF滴放在MCE滤纸的中心。

将视网膜漂浮到由表面张力和带电的MCE膜产生的aCSF液滴中。使用画笔将视网膜定位在液滴内，视网膜神经节细胞朝上，然后展开四片花瓣。定位后，在画笔和白色滤纸之间形成一个水桥，以打破液滴的表面张力。

组装活体成像孵育室，并用含氧的aCSF填充。打开泵和温度控制器，确保温度不会上升到34摄氏度以上。腔室温度可能需要长达一个小时才能稳定下来。

建议在开始视网膜解剖之前设置孵育室。稳定的腔室温度有助于减少样品漂移。要将视网膜扁平丘转移到灌注室中，请停止泵并取出腔室中的aCSF。

然后将带有视网膜扁平支架的MCE盘放入孵育室。预润湿样品砝码以破坏表面张力，然后将其放在平坦的支架上，确保将样品砝码放在MCE纸上以减少样品漂移。用加热的aCSF重新填充腔室，并以每分钟约一毫升的速度循环aCSF。

将物镜转换器与25次浸水物镜一起放入成像室中。使用落射荧光筛选感兴趣的标记细胞，并调整成像体积以捕获感兴趣的树突状特征。使用识别过饱和和和不足像素的查找表，调整激光功率，使没有像素过饱和。

采集 3D 成像体积并以所需的帧速率重复采集。可以在每个时间点之间调整成像体积，以补偿样品漂移。导入图像系列，按时间拆分图像。

手动保存所有时间点或通过运行宏插件。通过单击 Defraction PSF 3D 使用 ImageJ 插件创建理论点扩散函数，需要镜头数值孔径、荧光团发射波长、像素大小和 Z 间距才能创建准确的 PSF。选择插件、宏并运行以使用提供的宏对所有时间点执行批量并行迭代反卷积。

通过单击文件，导入和图像序列，将所有非卷积时间点作为堆栈导入。通过单击图像，超堆栈，然后将堆栈转换为超堆栈，将堆栈转换为超堆栈。添加 Z 切片和时间帧的数量，然后使用正确的 3D 漂移插件更正 3D 漂移。

保存 3D 漂移校正超堆栈，并通过单击图像、超堆栈、超堆栈到堆栈将图像转换回常规堆栈，然后通过单击图像、堆栈、工具和堆栈拆分器来拆分时间点。对于要拆分的子堆栈数，请输入时间点数。使用批处理为所有时间点创建最大投影。

通过单击文件、导入和图像序列来导入延时图像序列。并使用传统的ImageJ工具对解卷积和后处理的二维视频进行所需的分析，获取，解卷并校正3D漂移的高分辨率3D视频， 以发展星爆细胞树突。制作了Z平面最大投影以制作用于分析的2D视频，显示树突细化区域和树突生长区域。

每个时间点的3D反卷积提高了ImageJ反卷积前后单个P6星爆阱膜细胞的精细丝状突起的分辨率。延长的AAV感染期并不一定导致荧光信号增加，如注射后5天和11天蛋白质表达水平相似所示。减少成像过程中的样品漂移非常重要。

通过保持一致的成像温度和在样品上适当定位重量，可以最大限度地减少漂移。如果发生漂移，手动采集时间序列允许在帧之间调整成像体积。这可确保感兴趣的功能保留在帧中。

该协议可生成开发神经突起的高分辨率、反卷积和漂移校正 3D 视频。这些视频可以更好地理解神经元布线，并且是推进3D形态发生计算分析方法所必需的。需要更好的自动跟踪和跟踪软件来实现神经突起开发的高通量分析。