A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Ziyi Hu; Tingting Zhou; Fangrong Wu; Fan Lin

doi:10.3791/62312

Journal

/

癌症研究

/

快速筛选工作流程，利用患者衍生胶质瘤干细胞确定GBM的潜在组合疗法

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

JoVE 杂志
癌症研究

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

JoVE 杂志癌症研究

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

快速筛选工作流程，利用患者衍生胶质瘤干细胞确定GBM的潜在组合疗法

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

2,744 Views

•

05:29 min

•

March 28, 2021

DOI:

10.3791/62312-v

DOI:

10.3791/62312-v

•

05:29 min

March 28, 2021

•

1 Views

Ziyi Hu*¹, Tingting Zhou*¹, Fangrong Wu¹, Fan Lin^1,2

¹Department of Cell Biology, School of Basic Medical Sciences,Nanjing Medical University, ²Institute for Brain Tumors & Key Laboratory of Rare Metabolic Diseases,Nanjing Medical University; Nanjing Medical University Affiliated Cancer Hospital; Key Laboratory of Human Functional Genomics of Jiangsu Province

成績單

胶质瘤干细胞是胶质瘤细胞的亚种群，通常对化疗和放射治疗有抵抗力。在这里，我们描述了快速识别组合疗法的方法，针对胶质瘤干细胞，而不是分化胶质瘤细胞。与其他方法相比，这可能是一个费力和复杂的。

此协议是一个相对简单和快速的，以识别潜在的有用的药物组合。首先从培养介质中收集胶质瘤干细胞或GCS，并在室温下以70倍G离心三分钟。去除超高分子后，在37摄氏度下用吸血剂消化细胞4分钟。

使用 200 微升尖端，反复移液细胞分离，并重新悬念细胞颗粒。将密度为20万细胞的GSC加入1毫升培养介质中，加入到12个井培养板的每口井中，并在一夜之间孵育它们。哦，第二天，在盘子的每一口井里加入 30 微升的葡萄糖 – egfp 病毒超高剂。

将细胞以1000G为离心，在25摄氏度下进行两个小时的离心，并在一夜之间孵育它们。第二天，通过收集 GSC、离心、取出超高分子、将超高介质重新用介质重新镀层并重新镀上水井中的介质来更换油井中的介质。再培养细胞48小时。

在荧光显微镜下观察板，确认GFP阳性细胞的外观。使用流细胞分拣器对高荧光的 GSC 进行排序和收集，并进一步培养它们。大衣，96井光学底板与细胞外基质混合物，如母体，并孵育他们一个小时在37摄氏度。

取出多余的混合物，用PBS轻轻冲洗一次板，然后在培养介质的100微升中以1000个细胞的密度播种XG387-Luc细胞，并放入每口涂层板井中，并在一夜之间培养它们。第二天，在显微镜下观察细胞，以确认它们与板块的附着。接下来，在培养基中准备 200 种微摩尔特莫佐洛米德溶液和两种目标剂的微摩尔溶液。

对于组合药物筛选，去除空白介质，将含有 200 种微摩尔特莫佐洛米德或两种微摩尔靶向剂或两种药物组合的介质添加到每个井中，每次治疗可进行三次技术复制。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育板三天。使用 IVIS 频谱成像系统拍摄板中的细胞生物发光图像。

使用内置软件，创建感兴趣的区域的多个圆形区域，并量化细胞生物发光。为了确定可能增强特莫佐洛米德抗胶质母细胞瘤作用的潜在候选者，通过药物组合筛选分析了20种靶向选择性小分子抑制剂。13个目标代理的敏感指数值高于零，其中5个高于0.1。

前两种候选药物UMY-77和A 83-01的敏感指数高于0.25，表明它们有可能与特莫佐洛米德协同作用。在六乘六剂量的针点基质中，使用抗增殖测定法对特莫佐洛米德和UMY-77的综合治疗进行了评估。组合指数值小于一个。

对于不同浓度的特莫佐洛米德和 UMI-77 的大多数组合，高单剂值大于零。建议在 XG387 和 XG328 GSC 中全面协同作用的特莫佐洛米德和 UMI-77。该协议还可用于使用粘附癌细胞寻找药物组合，只需去除板涂层步骤。

Summary

胶质瘤干细胞（GSC）是癌症细胞的一小部分，在肿瘤启动、血管生成和胶质母细胞瘤（GBM）中的耐药性方面起着至关重要的作用，胶质母细胞瘤（GBM）是最普遍和最具破坏性的原发性脑肿瘤。GSC 的存在使 GBM 对大多数单个目标制剂非常耐火，因此需要高通量筛查方法来识别潜在的有效组合治疗。该协议描述了一个简单的工作流程，使潜在的组合疗法与协同相互作用的快速筛选。此工作流程的一般步骤包括建立带有葡萄糖标记的 GSC、准备母体涂层板、组合药物筛选、分析和验证结果。