中性粒细胞中活性氧物种的实时定量 感染脑膜性 大肠杆菌

大肠杆菌是导致新生儿脑膜炎的最常见克阴性细菌。新生儿细菌性脑膜炎的发生纯粹从细菌血症开始，然后血液中的细菌穿透血脑屏障导致脑膜炎。嗜中性粒细胞是抵御细菌感染的第一道防线。

在细菌入侵期间，活性嗜中性粒细胞释放ROS。ROS代表宿主细胞的主要杀菌机制，以摧毁入侵的病原体。测量中性粒细胞中ROS的产生是细菌-宿主相互作用期间启动宿主防御的有用方法。

用无菌移液器从盘子中取出一个细菌菌落，放入五毫升脑-心脏输液介质中，在凹凸瓶中含有里芬霉素。在 37 摄氏度下孵育细菌培养，在孵化摇床中 90 RPM 17 小时。在 2000 RPM 下将外周血液样本离心五分钟。

离心机后，血液样本分为三层。从下到上，红血球层，白血球层，血浆层。用无菌移液器将白血球层吸到新管中。

添加三倍红血球裂解缓冲器。将混合物彻底混合，在室温下放置五分钟。在 2000 RPM 下将管子离心五分钟。

完全吸气超自然人并丢弃。重复红血球的裂解过程一到两次，直到沉积物变白。通过用两毫升 PBS 重新悬浮沉积物来清洗细胞。

然后在 1000 RPM 下离心管五分钟。用15微升预编码磁细胞分拣缓冲器为1500万个细胞补充沉积物。加入 15 微滑石磁性微珠，彻底混合。

在四摄氏度孵化混合物30分钟。在正常情况下，成年人类每微升血液中约有4到1万个白血球。因此，白血球总成本在5毫升的人类外周血液中，接近5000万。

15微升磁分拣缓冲器中的50微升磁珠就足够了。中性粒细胞的正常百分比为白血球总数的50%至70%。因此，大约1000万嗜中性粒细胞可以从5毫升的血液中获得。

通过在管中加入两个千升磁分拣缓冲器（每 1000 万个细胞）和 4 摄氏度（1200 RPM）的离心机（1200 RPM）10 分钟来清洗细胞。组装磁柱并分离架子。完全丢弃超自然物，用500微升磁分拣缓冲器为多达1亿个细胞补充沉积物。

用三毫升磁分拣缓冲器冲洗柱子。将细胞悬架涂在柱子上，使磁珠标记的嗜中性粒细胞附着在柱子上。每次柱储液池为空后，通过添加三毫升缓冲器三次冲洗掉非特定细胞。

从磁分离器中取出柱子，并将其放入新管中。将五毫升磁分拣缓冲区添加到列中。使用柱塞推出磁性标记单元。

在 1，200 RPM 下将管子离心五分钟。完全吸附超自然物，用一毫升培养介质补充沉积物。使用计数器确定单元格编号。

将含有 DHE 荧光探头的培养介质中的细胞浓度调整为每毫升 200 万。将嗜中性粒细胞放在孵化器中 30 分钟以加载 DHE 探头。将细胞悬架分配给一个96井的黑色微板，每口井200微升。

打开微板读卡器。将温度设置为37摄氏度，选择荧光读取模式、动能读取类型，设置荧光波长。选择板格式。

确定阅读区域。测量荧光强度每五分钟一小时。每次阅读前摇动盘子三秒钟。

从孵化器中取出微板。添加 PMA 或 E44 菌株，重复三次。将板放入微板读卡器中，按下启动按钮立即开始检测。

使用本文中的协议大纲，中性粒细胞从人类外周血液中分离，并装载荧光探针DHE。通过添加PMA，中性粒细胞内的ROS显著增加，从20分钟增加到40分钟，并在60分钟时达到峰值。但我认为E44菌株，ROS生产立即发生，并增加时间依赖。

E44 菌株引起的 ROS 的表达与 PMA 引起的表达相似。在嗜中性粒细胞中检测ROS生产可能有助于进一步研究嗜中性粒细胞的杀菌机制。在此协议中，我们提供了一种更简单的方法，以实时方式检测中性粒细胞中的 ROS 生产。

在宿主-细菌相互作用期间，也可用于监控其他宿主细胞类型的 ROS 生产。