Name: 海洋样品中总脂质和脂质类别的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 59 s
Description: 学习从海水和生物样本中提取、分离和分析海洋脂质的完整方法。本方案利用薄层色谱-火焰离子化检测技术快速定量脂质类别，支持海洋生态与生物地球化学研究。

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本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）资助，项目编号105379，授予C.C. Parrish。纪念大学核心科研设备 &amp;#38; 仪器培训（CREAIT）网络为本出版物提供了资助。

注意：用于脂质分析的玻璃器皿、仪器和滤膜，需先用甲醇清洗3次，再用氯仿清洗3次，或在450°C下加热至少8小时以进行清洁。
1. 海水中溶解态和颗粒态脂质的过滤步骤
注意：所关注的特定组分由过滤操作步骤进行操作性定义。本实验中，滤膜孔径为 1.2 µm。
<ol>
	<li>设置过滤装置，不使用滤膜，先用过滤后的海水冲洗整个装置。</li>
	<li>使用洁净的镊子将已清洗过的47 mm玻璃纤维（GF/C）滤膜放入洁净的过滤系统中。</li>
	<li>取样品并轻轻旋转摇匀，以重新悬浮可能已沉降到采样容器底部的物质。准确量取已知体积的样品（本例中为1 L），并通过滤膜进行过滤。 
	注意：取样体积取决于样品中颗粒物的含量，通常根据季节和地点不同，介于250 mL至5 L之间。</li>
	<li>量取样品后，先用过滤后的海水轻轻润湿滤膜。缓慢将全部样品加入过滤装置中，并用过滤后的海水冲洗量筒，确保所有颗粒物均转移至滤膜上。同时沿装置侧壁冲洗，确保所有颗粒物均被冲洗到滤膜表面。
	<ol>
		<li>让所有海水通过滤膜，但不要让滤膜完全干燥，以免破坏滤膜上的细胞；当最后的水即将滤尽时，停止抽吸。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用洁净的镊子和洁净的移液器，先将滤膜对折，再三等分折叠，然后沿长度方向对折，卷成管状。将其放入洁净并已标记的10 mL玻璃小瓶中。</li>
	<li>向滤膜中加入2 mL氯仿。用氮气填充顶空部分，并用聚四氟乙烯（PTFE）密封带密封。将小瓶置于-20 °C冰箱中的试管架上。样品在此温度下可稳定保存长达一年。 
	注意：为将脂质浓度与总质量浓度相关联，还需进行干重测定。该过程包括将一个预先称重的24 mm滤膜放入干重过滤装置中，搅拌样品后取少量子样品，过滤至该小滤膜上。当滤膜接近干燥时，向滤膜上加入约10 mL的3.5%甲酸铵溶液。将滤膜对折后放回已标记的培养皿中，并置于冰箱中保存。</li>
</ol>
2. 海水或液体样品的液-液萃取
<ol>
	<li>样品预处理
	<ol>
		<li>量取已知体积的滤液至洁净的玻璃量筒中。将该样品转移至一个洁净的1 L分液漏斗中，然后向样品中加入20 mL氯仿，振荡2分钟，期间频繁排气。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第一次分离后收集提取液并加酸
	<ol>
		<li>用铝箔包裹分液漏斗，静置5至10分钟以使两相分层。掀开铝箔底部观察两层界面，通过活塞小心收集下层有机相至洁净的圆底烧瓶中，注意避免混入上层水相。在氮气氛围下密封圆底烧瓶，并置于冷冻冰箱中保存。</li>
		<li>向分液漏斗中的样品中加入浓H2SO4，每升样品加0.25 mL，然后轻轻振荡分液漏斗。</li>
		<li>加入10 mL氯仿，剧烈振荡2分钟，期间频繁排气。静置使其充分分层。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第二次和第三次分离
	<ol>
		<li>等待分层完成后，将下层有机相加入至圆底烧瓶中。</li>
		<li>再加入第三份10 mL氯仿，再次振荡2分钟，期间频繁排气。分层后，将下层有机相并入圆底烧瓶中。</li>
		<li>将圆底烧瓶中的提取液转移至旋转蒸发仪，蒸发浓缩后转移至2 mL样品瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 固体样品的提取方案（改良Folch等3提取法）
<ol>
	<li>准备 
	注意：提取操作需要使用装有冰的隔热容器。所用溶剂包括甲醇、氯仿提取水以及 2:1 的氯仿:甲醇混合液。所有溶剂均应置于冰上冷却，确保在开始提取时已处于低温状态。样品也需放置于冰上，以保持整个操作过程的低温。
	<ol>
		<li>用甲醇将所有离心管和聚四氟乙烯（PTFE）内衬瓶盖冲洗 3 次，再用氯仿冲洗 3 次。每次提取需准备一个离心管和一个带盖的 15 mL 离心管。</li>
		<li>将样品放入含有 2 mL 氯仿的离心管中。样品量取决于其中脂质的含量，通常以含有约 5 至 10 mg 脂质为宜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>研磨与提取
	<ol>
		<li>加入约 1 mL 冰冷的甲醇，使用洁净的匀浆器或聚四氟乙烯/金属头玻璃棒迅速将样品研磨成浆状。</li>
		<li>用约 1 mL 冰冷的 2:1 氯仿:甲醇混合液冲洗玻璃棒并将其内容物洗入离心管，随后用 1/2 mL 冰冷的氯仿提取水冲洗。如有必要，可使用洁净的镊子将残留颗粒推回离心管后再进行冲洗。盖紧管盖，将混合物在超声水浴（35–42 kHz）中超声处理 4 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>双层移液法：将样品在 1800 × g 条件下离心 2 分钟。使用双层移液技术收集全部有机层（下层），该方法为：将一个 5 ¾" 移液管轻轻插入两层液体中，松松地连接吸球并轻轻挤压，使气泡逸出。
	<ol>
		<li>当移液管到达第二层底部时，用拇指将吸球取下，但不吸取有机层。将一根 9" 移液管插入 5 ¾" 移液管内部，通过 5 ¾" 移液管吸取下层液体。</li>
		<li>将提取液转移至洁净的离心管中。持续吸取下层液体，直至完全移除。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冲洗移液管：使用 1.5 mL 冰冷的氯仿冲洗 9" 移液管外壁，并将其冲洗液加入含有有机层的离心管中；再用另外 1.5 mL 氯仿冲洗内壁。冲洗过程中应轻轻转动移液管，确保所有氯仿均沿管壁流入离心管。
	<ol>
		<li>以相同方式，用溶剂将 5 ¾" 移液管冲洗至含有水相层的离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对样品进行超声和离心处理，待分层后使用双层移液法分离，每次均使用新的移液管。重复该过程至少三次，并将所有有机层合并。第三次移除有机层后，将两根移液管的冲洗液均加入含有有机层的离心管中。</li>
	<li>使用温和的氮气流将提取液浓缩至一定体积，然后用聚四氟乙烯（PTFE）胶带密封，并存放在冷冻箱中。</li>
</ol>
4. 建立用于海洋脂质类别棒状薄层色谱分离的系统与步骤
<ol>
	<li>为薄层色谱准备棒状板
	<ol>
		<li>在自动FID扫描仪中对棒材进行三次空白扫描</li>
		<li>点样：用注射器将样品和标准品加样至棒上，位置在原点处或略低于原点。 dispensing 0.5 &#181;L 并将液滴接触棒体。待干燥后，再在同一位置滴加下一滴。将所有样品以直线形式点样于棒上。</li>
		<li>聚焦于丙酮：用70 mL丙酮对样品进行两次聚焦（若样品浓度较高，则进行三次）。观察溶剂前沿沿棒上升的过程，直至斑点底部与顶部合并。取出棒，干燥约5秒，然后重复该步骤，以在棒底部形成一条狭窄的脂质材料条带。</li>
		<li>在恒湿箱中将棒材干燥并调节状态5分钟。恒湿箱是指在平板下方放置有氯化钙饱和溶液的干燥器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从第一个色谱图（烃类到酮类）开始的序列
	<ol>
		<li>第一展开系统：第一种展开体系为正己烷：二乙醚：甲酸，98.95:1:0.05。使用注射器加入甲酸，但需先用该溶剂冲洗注射器3次&#215; 用甲酸冲洗，然后将甲酸洗去&#160;用氯仿立即冲洗注射器。取30 mL混合液润湿滤纸并冲洗层析缸，弃去冲洗液，将剩余的70 mL加入层析缸中。
		<ol>
			<li>将架子轻轻放入槽中。观察直至溶剂前沿到达样品位置&#160;点样后立即启动计时器。25分钟后，将棒从展开室中取出，在恒湿室中干燥5分钟，再用相同溶液重新展开20分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在自动FID扫描仪中将棒干燥5分钟，然后使用25的PPS扫描至酮峰后方的最低点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从三酰甘油到二酰甘油的色谱序列：
	<ol>
		<li>在恒湿室中对 rods 进行 5 分钟的预处理。</li>
		<li>第二种展开系统：第二种展开体系为正己烷:乙醚:甲酸，79:20:1。加入约30 mL至展开槽中润湿滤纸并清洗展开槽，随后弃去，再在剩余的70 mL展开剂中展开40分钟。为获得最佳的三酰甘油（饱和）与三酰甘油（多不饱和）峰之间的分离效果，应使用79.9:20:0.1的混合比例；而为分离固醇酯（ST）与二酰甘油（DAG）峰，则应使用79:20:1的混合比例。</li>
		<li>使用 PPS 扫描 11，在第二次部分扫描中干燥并扫描至双酰甘油峰后方的最低点。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第三张色谱图（丙酮可移动极性脂质与磷脂）的分离流程
	<ol>
		<li>在恒湿培养箱中对 rods 进行 5 分钟的预处理。</li>
		<li>将棒条在70 mL丙酮中连续展开两次，每次15分钟。每次展开之间，将棒条在空气中干燥约30秒。</li>
		<li>在恒湿室中对 rods 进行 5 分钟的预处理。</li>
		<li>第三套开发系统第三种展开系统由氯仿、甲醇和经氯仿提取的水按50:40:10的比例混合而成。在70 mL该混合液中，将棒状薄层板展开两次，每次10分钟。每次展开之间，将棒状薄层板在空气中干燥约30秒。</li>
		<li>干燥并扫描杆的整个长度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 使用 H2SO4 甲醇溶液进行 FAME 衍生化
<ol>
	<li>配制 Hilditch 试剂
	<ol>
		<li>准备甲醇：将 100 mL 甲醇置于洁净的容量瓶中，然后轻轻撒入无水 NaSO4，直至瓶底被完全覆盖。覆盖后，将容量瓶倒置两次，使甲醇中的水分被 NaSO4 吸收。倒置并摇动后，静置至少 5 分钟。</li>
		<li>加入酸：将甲醇缓慢倾入玻璃瓶中（此时 NaSO4 已在容量瓶底部形成坚硬的块状物），然后加入 H2SO4。使用移液器缓慢向甲醇中加入 1.5 mL 硫酸，每次加入几滴。待所有酸加入后，盖上瓶盖并轻轻搅拌使其混合均匀。该溶液现已可用于制备衍生物，但需每周新鲜配制。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备衍生物
	<ol>
		<li>从已定容至已知体积的提取小瓶中转移约 200 µg 脂质至一个洁净的 15 mL 小瓶中，并在氮气下吹干。所取脂质量取决于 TLC/FID 分析所得样品的浓度。使用洁净的移液器取样。</li>
		<li>样品干燥后，加入 1.5 mL 二氯甲烷和 3 mL 新鲜配制的 Hilditch 试剂。</li>
		<li>涡旋混匀样品，然后在超声水浴中处理 4 分钟，以去除附着在玻璃小瓶内壁的脂质。用氮气充满小瓶，盖上瓶盖，并用聚四氟乙烯（PTFE）密封带密封，于 100°C 加热 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>终止反应
	<ol>
		<li>将样品从烘箱中取出后，室温下完全冷却 10 分钟，然后小心打开小瓶。</li>
		<li>缓慢加入约 0.5 mL 饱和碳酸氢钠溶液（9 g/100 mL 经氯仿提取的水），再加入 1.5 mL 正己烷。振荡或涡旋小瓶，然后静置使其分层为两相。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集脂肪酸甲酯（FAME）
	<ol>
		<li>移除上层：待衍生化反应停止且两相清晰分离后，移取上层有机相，转移至一个洁净的 2 mL 脂质专用小瓶中。</li>
		<li>将 2 mL 小瓶中的溶剂在氮气下吹干，再用正己烷重新定容至约 0.5 mL。</li>
		<li>用氮气充满小瓶顶部空间，盖上瓶盖并用聚四氟乙烯（PTFE）密封带密封，再超声处理 4 分钟以重新悬浮脂肪酸，随后即可用于气相色谱（GC）分析。 
		注：若需测定全部脂肪酸浓度，必须用正己烷对水相洗涤三次，并将所有有机相合并至 2 mL 小瓶中。具体操作为：每次加入 2 mL 正己烷，涡旋混匀，离心，移取有机相，重复此过程共三次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者不存在相互竞争的经济利益。

TLC-FID 系统能够从小样品中快速提供全面的脂质类别信息，这使其成为在进行更复杂的分析程序之前筛选海洋样品的有效工具。此类分析通常需要从脂质提取物中释放组分化合物，并在进行气相色谱分析时通过衍生化提高其挥发性。TLC-FID 与 GC-FID 相结合，已被证明是分析海产品及其他食品提取物的有力组合14。要成功进行海洋脂质分析，关键在于在整个过程中保护样品免受降解和污染，并在将样品点样到石英棒时格外小心。一种方法是使用微毛细管移液器将整个海洋样品直接点样到石英棒上15；在海洋样品类型方面的创新则是将海水表面微层和气溶胶样品与海水样品结合分析16。
自动扫描仪中的FID系统可快速进行微克级定量，且无需衍生化或净化步骤；然而，其灵敏度、精确度和线性范围不及气相色谱仪。这意味着必须建立校准曲线，并且有时需要以两种不同的进样量分析样品，以确保较小和较大的脂质类别峰均在校准范围之内。
利用FI...

本文所述方法涉及在操作上被定义为海洋脂质的物质。该定义基于这些物质可被非极性有机溶剂进行液-液萃取的特性，从而为从水体基质中的其他物质中分离这些成分提供了一种便捷的方法。由于其疏水性质，这些物质易于从海水或生物样本中分离，同时也便于富集，并去除其中的盐类和蛋白质。
几十年来，海洋生物中脂质含量及其组成的测定在食物网生态学、水产养殖营养学和食品科学领域一直备受关注。脂质是生物体中普遍存在的组分，作为细胞膜中的必需分子、生物可利用能量的主要来源，提供热绝缘和浮力，并充当信号分子。尽管其他领域中脂质测定的方法已有详尽描述，但在海洋样品中的应用通常需要进行修改，以适应野外条件以及样品类型1。
对于海水样品，第一步通常需要通过过滤（方案步骤1）将其分离为操作定义上的“溶解态”和“颗粒态”组分。颗粒态组分即为滤膜截留的部分，而滤膜孔径大小对于界定截留阈值至关重要2。在采集颗粒物样品时，我们通常希望将脂质浓度与总质量浓度相关联，此时需另取一份较小体积的独立样品（例如10 mL）用于该目的（方案步骤1，注释）。为获得准确的质量测定结果，过滤结束时需加入甲酸铵（35 g/L）。
根据样品类型的不同，较大样品的海水滤液应达到250 mL至1 L之间，并在分液漏斗中进行液-液萃取（实验方案步骤2）。由于脂质具有疏水性，因此可通过非极性溶剂（如氯仿）萃取将其与其他化合物分离。该方法形成两层体系，脂质分配进入有机相，而水溶性组分则保留在水相中。
将滤膜上的颗粒物样品或生物样本采用改良的 Folch 等人提取法3进行提取，该方法同样涉及氯仿（实验步骤 3）。在此过程中，形成有机相/水相体系，使脂质进入有机相，水溶性分子保留在水相中，蛋白质则发生沉淀。事实上，对于固体样品，大多数实验室均采用 Folch 等人3提出的、基于氯仿和甲醇的提取方法的某种变体。对于滤膜样品，第一步是将其在 2 mL 氯仿和 1 mL 甲醇中进行匀浆处理。
在提取过程中，应采取措施防止脂质发生化学或酶促修饰，将样品和溶剂保持在冰上以减少酯键水解或碳-碳双键的氧化。组织和细胞中的脂质通常由天然抗氧化剂和区室化作用提供良好保护4；然而，在样品均质化后，细胞内容物混合，导致脂质更易发生化学或酶促改变。某些脂质（如大多数甾醇）非常稳定，而另一些含有多不饱和脂肪酸的脂质则更易发生化学氧化。此外，含有共轭双键的甾醇类脂质易受光催化氧化的影响5。提取后的脂质对化学氧化更为敏感，样品应保存在氮气等惰性气体环境中。也可使用温和的氮气流对提取物进行浓缩。
浓缩后，脂质通常会被整体定量，因为它们是海洋生态系统中的重要组分，能够提供高浓度的能量，每克所含千焦数超过碳水化合物和蛋白质的两倍以上。随后， invariably 会进一步对脂质的各个组分进行定量：脂质的全面分析通常需要根据其化学性质将其分离为更简单的类别。因此，完整的分析包括总脂质、脂质类别以及单个化合物的测定。
总脂质含量可通过色谱法分离后分别测定各类脂质并求和得到6。海洋脂质提取物可能含有来自生物源和人为源的十余种类脂质。由于脂质结构种类繁多，通过分析各类结构的组成可获得大量信息。单独或按特定组合分析脂质类别，已被用于指示某些类型生物的存在及其生理状态和活性2。此外，脂质类别还被用作有机物质来源的指标，包括溶解性有机质（DOM）以及疏水性污染物。
甘油三酯、磷脂和甾醇是几类较为重要的生物脂质。前两类在生化上具有相关性，因其均以甘油为骨架，其上酯化有两个或三个脂肪酸（图1）。甘油三酯与蜡酯是重要的储能物质，而其他含脂肪酸的脂质类别，如二酰基甘油、游离脂肪酸和单酰基甘油，通常仅占少量。游离脂肪酸在生物体内的浓度较低，因为不饱和脂肪酸可能具有毒性7。游离态及酯化态的甾醇和脂肪醇也属于极性较低的脂质，而糖脂和磷脂则为极性脂质。极性脂质含有亲水基团，可形成细胞膜中的脂双层结构。游离甾醇也是膜的结构组分，其与甘油三酯的比值（TAG : ST）可作为衡量生理状态或营养状况的指标，已被广泛应用8。甾醇与磷脂的比值（ST : PL）可用于反映植物对盐胁迫的敏感性：比值较高时有助于维持膜结构的完整性并降低膜通透性9。该比值的倒数（PL : ST）在双壳类组织的温度适应过程中也已被研究10。
海洋脂质类别可通过硅胶涂层棒上的薄层色谱法（TLC）进行分离（方案步骤4），随后由自动FID扫描仪中的火焰离子化检测器（FID）进行检测和定量。TLC/FID已常规用于海洋样品分析，因其能够从小量样品中快速获得综合性的脂质类别数据，并通过所有类别的总和得出总脂质含量。TLC/FID方法已通过质量保证（QA）评估，结果表明其符合一致的外部校准、低空白值以及精确重复分析所需的标准11。其变异系数（CV）或相对标准偏差约为10%，FID扫描仪测得的总脂质数据通常约为重量法及其他方法所得结果的90%2。重量法测得的总脂质较高，可能是因为FID扫描仪仅测定非挥发性化合物，同时也可能由于重量法测定中混入了非脂质物质所致。
脂类类别分析所提供的信息，若与单个脂肪酸、甾醇或两者联合测定的结果相结合，将尤为有用。这些分析的第一步是释放脂质提取物中的所有组分脂肪酸以及甾醇（方案步骤5）。由于脂质结构和功能具有高度多样性，因此在评估生态系统健康状况及其受人为和陆源输入影响程度的生态学与生物地球化学研究中得到了广泛应用。脂质分析可用于测定对海洋动物具有营养价值的物质的生物合成情况，也可用于指示水样的质量。对沉积物岩心样品中的脂质进行测定，有助于揭示沉积物对陆海交界区域人类土地利用变化的敏感性。
传统上，用于鉴定和定量单个脂质化合物的主要工具是配备火焰离子化检测器（FID）的气相色谱法（GC）。然而，在分析之前，这些化合物需通过衍生化处理以提高其挥发性。在酸性催化剂（H2SO4）存在下，脂肪酸从酰基脂质类别中被释放出来（图1）。在有机化学中，酰基（R-C=O）通常来源于羧酸（R-COOH）。随后，它们被重新酯化为脂肪酸甲酯（FAME），从而在GC色谱柱上实现更佳的分离效果（方案步骤5）。

<table><tbody><tr><td>15 ml 小瓶</td><td>VWR</td><td>66009-560</td><td></td></tr><tr><td>1-十六醇</td><td>Sigma</td><td>258741-1G</td><td></td></tr><tr><td>1-单棕榈酰消旋甘油</td><td>Sigma</td><td>M1640-1g</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 小瓶</td><td>VWR</td><td>46610-722</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 玻璃纤维滤膜</td><td>Fisher</td><td>09 874 32A</td><td></td></tr><tr><td>2ml 移液球</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>47 mm 玻璃纤维滤膜</td><td>Fisher</td><td>09 874 32</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4&quot; 移液管</td><td>Fisher</td><td>1367820A</td><td></td></tr><tr><td>9&quot; 移液管</td><td>Fisher</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>VWR</td><td>CAAX0116-1</td><td></td></tr><tr><td>Agilent GC-FID 6890</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙 ANHS 500g</td><td>VWR</td><td>CACX0160-1</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 小瓶盖</td><td>VWR</td><td>46610-712</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>VWR</td><td>CACX1054-1</td><td></td></tr><tr><td>棕榈酸胆固醇酯</td><td>Sigma</td><td>C6072-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chromarod S5</td><td>Shell USA</td><td>3252</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>VWR</td><td>CADX0831-1</td><td></td></tr><tr><td>DL-α-磷脂酰胆碱，二棕榈酰</td><td>Sigma</td><td>P5911-1g</td><td></td></tr><tr><td>乙醚，ACS 级无水，4L</td><td>VWR</td><td>CAEX0190-4</td><td></td></tr><tr><td>甘油三棕榈酸酯</td><td>Sigma</td><td>T5888-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton 进样器 702SNR 25&amp;micro;l</td><td>Sigma</td><td>58381</td><td></td></tr><tr><td>氦气</td><td>Air Liquide</td><td>A0492781</td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>VWR</td><td>CAHX0296-1</td><td></td></tr><tr><td>氢气减压阀</td><td>VWR</td><td>55850-484</td><td></td></tr><tr><td>Iatroscan MK6</td><td>Shell USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦拭纸</td><td>Fisher</td><td>066662</td><td></td></tr><tr><td>医用空气</td><td>Air Liquide</td><td>A0464563</td><td></td></tr><tr><td>中号腈手套</td><td>Fisher</td><td>191301597C</td><td></td></tr><tr><td>大号腈手套</td><td>VWR</td><td>CA82013-782</td><td></td></tr><tr><td>氮气</td><td>Air Liquide</td><td>A0464775</td><td></td></tr><tr><td>氮气减压阀</td><td>VWR</td><td>55850-474</td><td></td></tr><tr><td>十九烷</td><td>Sigma</td><td>74158-1G</td><td></td></tr><tr><td>棕榈酸</td><td>Sigma</td><td>P0500-10G</td><td></td></tr><tr><td>重复分配器</td><td>Sigma</td><td>20943</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 1kg</td><td>VWR</td><td>CA97062-460</td><td></td></tr><tr><td>无水硫酸钠 ACS 级 500g</td><td>VWR</td><td>CA71008-804</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>VWR</td><td>CASX1244-5</td><td></td></tr><tr><td>聚四氟乙烯生料带</td><td>Fisher</td><td>14610120</td><td></td></tr><tr><td>组织研磨仪 125 115V，配 7mm 匀浆头</td><td>OMNI International</td><td>TM125-115</td><td></td></tr><tr><td>TLC 展开槽</td><td>Shell USA</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>超高纯氢气</td><td>Air Liquide</td><td>A0492788</td><td></td></tr><tr><td>VWR 溶剂重装移液器</td><td>VWR</td><td>82017-766</td><td></td></tr><tr><td>VWR 计时器，双通道闪烁 LED</td><td>VWR</td><td>89140-196</td><td></td></tr><tr><td>Zebron ZB-Wax 气相色谱柱</td><td>Phenomenex</td><td>7HM-G013-11</td><td></td></tr></tbody></table>

海洋样品中总脂质及脂质类别的测定

Determination of Total Lipid and Lipid Classes in Marine Samples

脂质主要由碳和氢组成，因此与海洋中的其他有机大分子相比，能提供更高的比能。由于富含碳和氢，脂质具有疏水性，可作为有机污染物的溶剂和吸收载体，从而成为海洋生态系统中污染物生物累积的驱动因素。其疏水特性有助于从海水或生物样本中分离脂质：海洋脂质分析首先进行采样，然后使用非极性有机溶剂提取，从而方便地将其从水体基质中的其他物质中分离出来。
如果采集了海水样品，第一步通常是通过过滤将样品分离为操作定义上的“溶解态”和“颗粒态”组分。样品经采集后，通常使用氯仿从样品基质中提取真正溶解的物质和胶体，而使用氯仿与甲醇的混合液提取固体和生物样本中的脂类。这些提取物可能包含来自生物源和人为源的多种脂类组分。此时可测定总脂类及脂类类别。总脂类可通过加和各个已测定的脂类类别来获得，而这些类别通常需通过色谱法进行分离。薄层色谱（TLC）结合火焰离子化检测（FID）常用于海洋样品中脂类的定量分析。TLC-FID可提供综合的脂类类别信息，并通过加和各类别得到总脂类含量。
脂质类别信息在与从脂质提取物中释放出的单个组分（如脂肪酸和/或甾醇）的测定结果结合时尤为有用。由于脂质结构和功能具有高度多样性，因此在评估生态系统健康状况以及人为影响程度的生态学和生物地球化学研究中被广泛应用。脂质已被用于测定对海洋动物具有营养价值的物质（如水产饲料和/或猎物），并作为水质的指示指标（如烃类污染物）。

作为发展最快的食品生产领域，水产养殖业正在通过技术创新和适应性调整来满足不断变化的需求。其中之一是减少对源自野生鱼类的鱼粉和鱼油的依赖，后者为许多养殖水生生物提供了饲料原料。陆生植物油正被研究作为水产饲料中鱼油的可持续且经济的替代品，而肝脏是分析的目标组织，因为它是脂质代谢的主要场所12。图2展示了从我们的九组分标准品、一种含7%鱼油和5%菜籽油的配制饲料，以及饲喂该饲料的大西洋鲑肝脏组织中获得的原始薄层色谱-火焰电离检测（TLC-FID）色谱图。表1列出了分析不同饲料重复样本及不同鱼类样品后获得的数据。这些数据是通过使用Peak Simple软件（版本4.54）对扫描仪FID响应建立标准曲线后，定量提取物中各类脂质所得。数据表明，三酰甘油在饲料和肝脏中均占主导地位，同时显示了膜磷脂在肝脏中的重要性。
大陆边缘通常具有极高的生物生产力，在碳循环中尤其重要。在较浅的水域，表层初级生产力向海底的输送更为显著，因此测量从上层混合层沉降到海底食物网的...

本方案用于测定海水和生物样品中的脂质。滤液中的脂质采用氯仿提取，对于固体样品则使用氯仿与甲醇的混合溶液进行提取。脂质类别通过棒状薄层色谱结合火焰离子化检测进行测定，各类脂质含量之和即为总脂质含量。

脂质主要由碳和氢组成，因此与海洋中的其他有机大分子相比，能提供更高的单位能量。由于……

本文所述方法涉及可操作性定义为海洋脂质的化合物。该定义的依据是这些化合物易于在非极性有机溶剂中进行液-液萃取，从而可方便地将其从水相体系中的其他化合物中分离出来。由于其疏水性质，这些脂质易于从海水或生物样本中分离，同时也利于其富集以及盐类和蛋白质的去除。对于海水样品，第一步通常包括将其分离为操作定义的溶解态和颗粒态组分，通常通过过滤实现。颗粒态组分被滤膜截留，而滤膜的孔径大小对于界定截留阈值至关重要。使用经脂类清洁处理的镊子，将已灼烧过的47毫米玻璃纤维滤膜置于经脂类清洁处理的过滤装置上。取样品并轻轻涡旋，以重新悬浮可能已沉降的颗粒。量取已知体积，具体体积取决于样品中颗粒物的含量。量取体积后，启动过滤系统的抽吸装置，并用过滤后的海水轻轻润湿滤膜。缓慢将全部样品加入过滤漏斗中，并用海水冲洗量筒，确保所有颗粒物都转移到滤膜上。冲洗装置的漏斗部分，确保所有颗粒物均被冲洗至滤膜上。将所有液体抽滤通过滤膜，但不要让滤膜完全干燥，因为干燥可能导致滤膜上的细胞破裂。取经过脂质清洁处理的镊子，先将滤膜对折，再将其折叠成三等份，最后沿长度方向对折。然后将滤膜放入经过脂质清洁处理的样品瓶中。用 2 ml 氯仿覆盖滤膜，氮气封盖，并用聚四氟乙烯胶带密封。至此，样品可在 -20 °C 条件下稳定保存长达一年。样品制备。取已知体积的滤液，加入经脂质清洁处理的玻璃量筒中。将样品转移至经脂质清洁处理的分液漏斗中，加入约 20 ml 氯仿。充分振荡混合物至少两分钟，期间频繁排气。初次分离后，移除第一次提取物并加入酸。将溶液振荡两分钟，然后用铝箔包裹分液漏斗，静置约五分钟，直至分层完成。等待分层结束后，揭开铝箔底部，观察两层液体。将下层液体收集到经脂质清洁处理的圆底烧瓶中，注意不要混入任何上层液体。在氮气保护下盖紧圆底烧瓶，并置于冷冻器中。回收分液漏斗，并向其中的液体加入硫酸。每升海水加入 0.25 ml。加入硫酸后，轻轻摇动海水，再加入 10 ml 氯仿，边排气边剧烈摇动两分钟。然后静置分层。第二次和第三次萃取。将下层液体再次加入圆底烧瓶中，注意不要混入水分。加入第三份10 ml的氯仿，振荡两分钟，并进行排气。分离后，将氯仿的最后部分放入同一烧瓶中，合并的提取液可通过旋转蒸发仪蒸发，并转移至一个2 ml的小瓶中。装置设置：提取装置需要一个装有冰的隔热容器。所用溶剂包括氯仿、经氯仿提取过的水以及2:1的氯仿-甲醇混合液。每份样品大约需要 1 ml 该溶液，因此请根据样品数量相应配制。所有这些溶剂都应置于冰上，以确保在开始提取时保持低温。样品也需放在冰上，以确保所有材料始终处于低温状态。研磨与提取。样品已保存在两毫升氯仿中并置于冷冻状态，因此加入一毫升冰甲醇或半滴管。添加甲醇时需小心，避免移液管接触离心管内壁。用甲醇清洗并均质三次，再用氯仿清洗并均质三次。研磨时注意不要割伤手中的提取管，以防试

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