评估交配蜜蜂女王的农用化学品风险

该协议的制定是为了加强对农用化学品如何影响蜜蜂（Apis mellifera）繁殖的理解，方法是建立方法，在受控的实验室环境中将蜜蜂及其工人看护人暴露于农用化学品中，并仔细监测它们的相关反应。

农用化学品暴露会对蜜蜂群落的所有成员产生重大影响，包括最重要的成员，蜂王。但直到最近，很少有工具可用于研究这些影响。这种技术使研究人员能够在受控条件下将蜂王暴露在农用化学品中，模拟它们在田间可能经历的条件。

很容易干扰蜜蜂女王的产卵行为，因此在实验之前和实验期间处理工人和蜂王时要小心。展示这些程序的将是Amy Floyd和Eliza Litsey，他们是蜜蜂研究实验室入侵物种和传粉媒介健康研究部门的实验室技术人员。首先，通过插入门板来组装蜂王监测笼或QMC，然后将蜂王排除器插入喂食室上方的喂食室门中，以防止蜂王进入和接触经过处理的饮食。

插入单个电子学习产品。在将工人添加到笼子之前，不要添加喂料管，并暂时用实验室级胶带覆盖四个喂料器孔。在收集并孵育含有蜜蜂群落的有盖工人育雏的蜡梳架后，将封闭的蜜蜂刷到衬有防虫涂料的开放式容器中，以防止蜜蜂爬出。

将至少50只按重量计蜜蜂加入每个QMC的产卵室中。为了确保引入多样化的基因库，请从至少三个菌落中获得相似数量的工蜂，并允许它们在将蜜蜂添加到QMC之前进行混合。

使用在收到后48小时内从商业育种者处购买的女王。当女王仍在运输笼内时，将其放入透明塑料袋中。然后将塑料管的一端连接到袋内的二氧化碳气体罐，并轻轻打开罐阀，让二氧化碳气体流动。

当袋子被气体充气时，同时关闭罐阀并保持袋子关闭以将气体捕获在内部。保持袋子关闭30秒或直到蜂王停止移动。一旦观察到蚁后失去知觉，通过打开装运笼子来移除蚁后。

部分打开产卵室的门，轻轻地将失去知觉的女王放在里面并合上盖子。将第二个电子学习产品添加到每个 QMC。在两个电子学习产品的顶部放置一块实验室胶带，以防止它们与QMC框架分离，并防止工人离开笼子。

将笼子置于环境条件稳定在34至35摄氏度和相对湿度为50-70%的黑暗培养箱中。为了施用掺有农用化学品的日粮，请在适当的溶剂（如丙酮）中制备农用化学品的储备溶液，其浓度可以添加到日粮中以达到感兴趣的农用化学品的所需最终浓度。在蔗糖溶液，商业花粉补充剂或两者中施用农用化学品处理。

准备实验性饮食以在同一天使用，通过加入适量的储备溶液到冷藏或室温，50%蔗糖溶液中。通过中速涡旋彻底混合。对于花粉补充剂，将计算量的农用化学品储备溶液添加到蔗糖溶液中，并在将其添加到粉末补充剂之前彻底涡旋。

将饲料添加到喂料管中，并在将其放入QMC之前记录喂食器重量。要量化产卵，首先从孵化器中取出QMC。检查透明电子学习产品背面，如果存在鸡蛋，请取下感兴趣板前的门板。

从电子学习产品上取下胶带，并在电子学习产品与QMC内的蜜蜂之间滑动门板。将门板安装到位后，取出ELP并计数并记录ELP细胞内的卵子数量。通过在坚硬的表面上敲击ELP开孔侧的边缘来去除卵子。

一旦卵落出，在QMC中更换空的ELP。轻轻地卸下并更换QMC外部ELP后面的门板。根据需要对第二个 ELP 重复上述步骤，完成后在 QMC 上更换磁带。

为了监测食物的消耗，每两天用新鲜烹制的饮食代替食物。准备新的育肥管并在开始产蛋监测活动之前称重。将旧管换成新管，并在处理旧管子之前称量旧管子。

将喂食管和未消耗饮食的最终重量与同一管子的重量进行比较，以估计饮食消耗。每天检查一次，以确保进纸器永远不会是空的。如果喂食管是空的或接近空的，请将其取出，重新填充，记录试管前后的重量，并将差额添加到QMC的两天饮食消耗总量中。

在QMC实验的选定时间点，如前所述，从QMC中取出含有新鲜产卵的电子学习产品，但不要将鸡蛋从电子学习产品中移走。首先用PCR板密封覆盖ELP，然后用通用微孔板盖住ELP，并将其放入具有饱和硫酸钾溶液的干燥器内。从QMC移除电子学习产品后约78小时评估孵化率。

细胞底部的C形幼虫表明孵化事件成功。如果QMC中充满了多余的工人，请在实验过程中的选定时间点对工蜂进行采样，以评估治疗引起的生理变化。在取样之前，在电子学习产品与QMC内部之间放置一块门板，然后取下电子学习用品。

小心地将门板从笼子的底部抬起约0.5厘米，然后使用羽量级镊子从QMC内部取出一只工蜂。对于基因表达分析，将蜜蜂快速冷冻在液氮中，并将其储存在80摄氏度。保存收集的蜜蜂进行后续分析，并重复此过程，直到收集到所需数量的样品。

通过实施泊松对数线性广义估计方程和自回归相关矩阵，评估日产卵计数中与膳食吡虫啉治疗相关的变化。鉴于花粉补充剂和蔗糖含有50十亿分之一的吡虫啉，QMC的每日产卵量显着降低。在蔗糖和花粉补充剂中施用吡虫啉治疗的每个QMC中产生的卵总数上观察到剂量依赖性效应。

QMC中观察到的减少量最大，喂养了50十亿分之五的吡虫啉，其次是十亿分之10的花粉补充剂和蔗糖。在对照组和仅喂食十亿分之10吡虫啉和花粉补充剂的QMC之间没有观察到总产卵的差异。花粉补充剂，水和蔗糖的消耗量每48小时记录一次，持续10或12天。

随着实验的进展，蔗糖的每日消费率显着增加，但花粉补充剂的消费率下降。当仅在花粉补充剂中施用十亿分之10吡虫啉时，观察到花粉消耗率较高。当10或50个十亿分之一的花粉补充剂和蔗糖溶液一起施用时，该比率降低。

使用日龄蜜蜂对于确保女王的接受度和减少工人过度重新激活至关重要。同样关键的是，要小心处理蜂王，并将笼子保持在稳定的环境中。