Name: 新西兰白兔产妇免疫研究中的内在免疫和牛奶收集 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: 了解新西兰白兔母体免疫研究中的鼻内免疫接种与乳汁采集技术。该方法利用与人类相似的胎盘结构和抗体转移机制，为评估母体抗体经胎盘和乳汁向幼崽的传递提供了可重复的实验方案。

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作者谨向杜克大学实验动物资源部及其饲养团队致以诚挚谢意，感谢他们为实验动物提供的协助与悉心照料。此外，作者还感谢病理学系PhotoPath团队在稿件音频和视频部分提供的帮助。本研究得到了斯塔茨实验室自主研究经费的支持。

所有操作均经杜克大学动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并遵循其相关政策进行。
注意：所需材料见材料表。
1. 家兔的镇静与麻醉
<ol>
	<li>通过肌肉注射（IM）给予雌性兔（性成熟；约5-30月龄）每千克体重1 mg的乙酰丙嗪进行镇静。根据动物体型，使用1 mL或3 mL注射器配25 G针头。背侧肌群是肌肉注射的首选部位。 
	注意：乙酰丙嗪也可皮下注射，但本实验室更倾向于肌肉注射，因其起效更快，并可减少皮肤病变的发生。</li>
	<li>等待10-15分钟，使乙酰丙嗪充分发挥作用。</li>
	<li>将连接好的鼻罩置于兔鼻部，使用异氟烷对其进行麻醉。调节挥发器，使异氟烷浓度最高达4%，并配合最高4升/分钟的氧气。兔对异氟烷具有较强抗拒性，因此在实施面罩麻醉时需妥善固定动物。</li>
	<li>当通过耳廓、足底和/或眼睑反射评估确认兔已完全麻醉后，向每只眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥及继发性角膜溃疡。</li>
	<li>在麻醉期间持续监测反射和呼吸情况，一旦达到适当的麻醉深度，即将异氟烷浓度下调至1-2%。</li>
</ol>
2. 鼻内免疫
<ol>
	<li>在处理动物前，准备好免疫用溶液。</li>
	<li>按照上述方法对兔子进行镇静。</li>
	<li>当实验人员准备接种疫苗且兔子已达到适当的麻醉深度时，关闭异氟烷和氧气，取下鼻罩。</li>
	<li>将兔子置于仰卧位，并将其颈部和头部支撑在约45°角的位置，以便实验人员能够方便地接触并清晰观察两侧鼻孔。</li>
	<li>用移液器吸取不超过100 µL的疫苗溶液，迅速将溶液分别滴入两侧鼻孔。移液器应保持约45°角，朝向鼻腔内侧方向。 
	注意：免疫的目的是使溶液接触鼻腔黏膜，因此移液器尖端不应插入鼻孔内部，以免造成黏膜组织擦伤或刺激，进而可能影响鼻腔接种疫苗的免疫原性。疫苗应快速给予，并以相同方式在另一侧鼻孔重复操作。</li>
	<li>两侧鼻腔给药后，保持兔子仰卧位30秒，以尽量减少疫苗溶液外漏。 
	注意：实验室通常每次每侧鼻孔给予不超过100 µL。若需给予更大体积（总量最多500 µL），可分次给予，每次100 µL，两次免疫之间间隔30秒，并重复此过程，每次给药后休息30秒，直至完成全部疫苗剂量的接种。</li>
	<li>免疫完成后，将兔子置于俯卧位以促进恢复，并密切监测动物状态，直至其能够维持胸卧位。</li>
</ol>
3. 乳汁采集
<ol>
	<li>按照上述方法使哺乳期兔只镇静。</li>
	<li>用酒精棉签/擦拭垫清洁耳缘静脉处的皮肤。</li>
	<li>使用1 mL注射器和25 g针头，通过耳缘静脉注射约1-2 IU催产素，以诱导泌乳。 
	注意：由于平滑肌松弛，兔只在注射催产素后常会出现排尿或排便现象。</li>
	<li>注射催产素后，用纱布按压注射部位。</li>
	<li>保持麻醉面罩覆盖兔只鼻部的同时，将兔只后肢抬起支撑，使其臀部着地直立。 
	注意：也可在动物侧卧位时进行乳汁采集，但本实验室发现，由助手扶持兔只使其臀部着地直立并同时维持麻醉面罩时，采集操作更为方便。</li>
	<li>打开无菌管以准备乳汁采集，定位乳腺组织及其相应的乳头。乳头周围通常因近期哺乳而被湿润的毛发包围，当乳腺充满乳汁时，乳腺组织可轻易触及。</li>
	<li>用拇指和食指夹住与乳头相连的乳腺组织，朝乳头方向对腺体组织施加轻柔的按摩压力。将收集管置于乳头上，以收集挤出的乳汁。 
	注意：催产素起效有时需要数分钟，且不同乳腺之间的泌乳量可能存在差异。若某一乳头未能成功挤出乳汁，可等待数分钟，或转向其他乳腺尝试。所有乳头采集的乳汁可收集于同一管中。通常，从一只哺乳期母兔可轻松采集数毫升乳汁。</li>
	<li>乳汁采集完成后，关闭异氟烷和氧气，让兔只在密切监护下恢复，直至动物能够维持胸卧位。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

尽管上述方案中未作描述，但成功繁殖兔子对于该母体模型的建立以及乳汁采集至关重要。在科研环境中，兔子可通过自然交配方式进行繁殖。建议将母兔转移到公兔的笼子中进行交配，因为若将公兔放入母兔笼中，母兔可能表现出领地性并具有攻击性。如果母兔在15分钟后仍不接受交配（表现为逃跑、咬人或发出叫声），应将其放回自己的笼子。目前网上可查阅到多个关于兔子繁殖的详细视频和教程29，通常在交配完成后，公兔会侧身倒下，并可能发出叫声。一旦观察到此现象，即可将母兔送回其笼中。公兔每天可交配2–3次，且精子数量不会明显下降30。根据我们经IACUC批准的实验方案，公兔每周最多交配10–12只母兔，并保证每周至少休息两天，因为文献指出，一只公兔通常足以配种10–15只母兔31。我们团队建议从供应商处购买已有繁殖记录的种兔，以提高繁殖成功率。由于兔子属于诱导排卵动物，排卵通常发生在交配后10–13小时31，我们发现母兔在早晨交配一次、下午再交配一次，或在该10–13小时窗口期内交...

母体免疫及抗体转移的研究具有诸多重要价值，因为这是新生儿和婴儿获得免疫力并继而抵御病原体和疾病侵害的最初途径。通过在这一脆弱时期降低特定病原体相关的发病率和死亡率，母体免疫有望在全球范围内对母亲及婴儿/儿童健康产生积极影响1。该策略的主要目标是在整个妊娠期间提高母体特异性抗体的水平，使这些抗体能够以足够的浓度转移给新生儿和婴儿，从而在婴儿自身免疫系统尚未发育成熟、无法有效应对病原体挑战的阶段提供保护1,2,3。既往研究表明，出生时较高的抗体滴度与多种新生儿感染性疾病的完全保护、发病延迟或病情减轻相关，这些疾病包括破伤风、百日咳、呼吸道合胞病毒（RSV）感染、流感以及B族链球菌感染1,2,3。
在人类中，母体抗体通过胎盘被动转移，也可通过哺乳经母乳传递。先前的研究表明，感染该病毒的母亲其母乳中抗 HIV 特异性 IgA 水平与产后病毒传播减少相关，提示母乳中抗 HIV IgA 具有保护作用4。在非人灵长类动物中的研究表明，针对 HIV 的免疫接种可在母乳中诱导显著的抗体反应；尽管系统性免疫与黏膜免疫均可诱导相似的血清 IgG 反应，但黏膜免疫在母乳中诱导的 IgA 反应显著更高5,6。
在为这些研究选择具有转化适用性的动物模型时，应考虑胎盘类型、被动抗体转移机制以及通过乳汁转移抗体的情况。哺乳动物的胎盘类型根据母胎界面的组织类型和层次可分为三种主要类型：血绒毛膜胎盘（灵长类、啮齿类和兔）、内皮绒毛膜胎盘（食肉动物）和上皮绒毛膜胎盘（马、猪和反刍动物）。其中血绒毛膜胎盘侵入性最强，可使母体血液与绒毛膜（最外层的胎儿膜）直接接触。根据滋养层细胞层数的不同，血绒毛膜胎盘又可分为多种亚型，包括灵长类中的单层血绒毛膜胎盘（hemomonochorial placenta）、兔中的双层血绒毛膜胎盘（hemodichorial placenta），以及大鼠和小鼠中所见的三层血绒毛膜胎盘（hemotrichorial placenta）。7母体血液供应与绒毛膜之间的这种直接接触，使得抗体在妊娠期间能够通过胎盘进行被动转移。IgG 是唯一一种能够显著穿过人类胎盘的抗体类别。8，而IgA是人乳中主要的免疫球蛋白类别9在具有科学意义的模型中，仅有灵长类动物（包括人类）、兔子和豚鼠能够转移IgG 在子宫内 以及乳汁中的IgA10,11因此，兔模型包含了与人类相似的影响IgG胎盘转移和IgA哺乳转移的因素。
除了作为母体免疫和疫苗开发的优秀模型外，兔与人类鼻腔结构的相似性也使其成为鼻内免疫的合适模型。基于相对体质量，兔鼻腔的容积比啮齿类动物模型更接近人类12。此外，Casteleyn 等人12的研究表明，兔的鼻相关淋巴组织（NALT）比啮齿类动物更为发达。在兔中，NALT 主要位于下鼻甲的腹侧和腹内侧区域，以及鼻咽道的外侧和背外侧区域；而在啮齿类动物中，淋巴组织仅存在于鼻咽道的腹侧区域12。兔的上皮内淋巴细胞、固有层淋巴细胞以及孤立淋巴滤泡的结构和位置与人类相似12。
使用家兔作为母体免疫和黏膜免疫模型的其他优势包括其高繁殖力和相对较短的妊娠期。较大的耳部血管便于多次采集较大量的血液。可收集多种黏膜样本用于抗原特异性抗体反应检测，包括乳汁13（哺乳期间）、黏膜分泌物或冲洗液（例如口腔14,15,16、支气管肺泡灌洗液13,17,18,19、阴道分泌物20,21,22）以及粪便20,23,24,25。在哺乳期可轻松采集乳汁样本，以评估抗原特异性抗体反应的存在情况。尽管针对家兔的实验试剂不如人类和小鼠丰富，但仍存在大量适用于家兔特异性研究和检测的试剂。本文中，我们将描述并演示新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）的鼻内免疫接种和乳汁采集方法。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;鼻内免疫接种&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>麻醉机/蒸发器</td><td>Vet Equip</td><td>901807</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射针头（25 g）</td><td>Terumo</td><td>07-806-7584</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（250 mL 瓶装）</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>2-4%</td></tr><tr><td>鲁尔锁扣注射器（1 mL）</td><td>Air-Tite</td><td>07-892-7410</td><td></td></tr><tr><td>黏膜疫苗</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>实验性疫苗</td></tr><tr><td>鼻罩</td><td>McCulloch Medical</td><td>07891-1097</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头</td><td>VWR</td><td>53503-290</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>VWR</td><td>89079-962</td><td></td></tr><tr><td>PromAce（马来酸乙酰丙嗪）</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>07-893-5734</td><td>1mg/kg 肌内注射</td></tr><tr><td>Puralube 无菌眼用软膏</td><td>Dechra</td><td>07-888-2572</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;乳汁采集&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酒精消毒片（双层）</td><td>Covidien</td><td>07-839-8871</td><td></td></tr><tr><td>麻醉机/蒸发器</td><td>Vet Equip</td><td>901807</td><td></td></tr><tr><td>皮下注射针头（25 g）</td><td>Terumo</td><td>07-806-7584</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷（250 mL 瓶装）</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>2-4%</td></tr><tr><td>鲁尔锁扣注射器（1 mL）</td><td>Air-Tite</td><td>07-892-7410</td><td></td></tr><tr><td>无纺布海绵（4x4）</td><td>Covidien</td><td>07-891-5815</td><td></td></tr><tr><td>鼻罩</td><td>McCulloch Medical</td><td>07891-1097</td><td></td></tr><tr><td>PromAce（马来酸乙酰丙嗪）</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>07-893-5734</td><td>1mg/kg 肌内注射</td></tr><tr><td>Puralube 无菌眼用软膏</td><td>Dechra</td><td>07-888-2572</td><td></td></tr><tr><td>无菌锥形瓶（15 mL）</td><td>Falcon</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr></tbody></table>

在新西兰白兔（oryctolagus cuniculus）母体免疫研究中的鼻内免疫与乳汁采集

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

由于兔子在胎盘结构和抗体转移方面与人类具有相似性，因此是研究母体免疫化的理想模型。该研究模型的其他优势还包括易于繁殖和采集样本、妊娠期相对较短以及每窝产仔数较多。常见的免疫接种途径包括皮下注射、肌肉注射、鼻内注射和皮内注射。为了按时间序列检测对这些免疫接种产生的免疫学反应，需进行非终末性样本采集，包括从母兔及其仔兔采集血液，以及从哺乳期母兔采集乳汁。本文将介绍本实验室在新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）母体免疫化研究中所采用的技术，包括鼻内免疫接种和乳汁采集方法。

典型的母体鼻内免疫研究设计概览如图1所示，包括免疫接种、配种、分娩、哺乳及抗体转移过程。尽管图中未显示，建议在首次免疫接种前采集血液样本以获取基线数据，并在后续研究过程中定期采集。通过中央耳动脉采血操作简便，仅需轻度镇静和局部镇痛剂（例如2.5%利多卡因和2.5%丙胺卡因乳膏）。可在这些样本中检测抗原特异性IgG水平。雌性家兔通过鼻内途径进行免疫接种，具体方法如本方案所述并由视频演示。根据研究需要，疫苗可能需要加强免疫，或通过其他途径（如肌内或皮下注射）给予。研究开始后对家兔进行配种；我们建议从供应商处购买已验证具有繁殖能力的种兔，以确保较高的妊娠率。根据免疫时间安排，家兔在妊娠期间可能需接受额外的免疫接种。抗原特异性IgG可通过胎盘转移至仔兔，配种后约30-32天，妊娠母兔将分娩。建议在出生后的最初几天尽量减少对仔兔的干预，以降低母兔排斥的风险。可采集仔兔血液样本，以评估经胎盘转移的抗原特异性IgG水平（图3）。除多种营养物质外，哺乳期母兔在哺乳过程中还会向仔兔提供IgA。仔兔通常在4-8周龄断奶，但在断奶前可按视频...

本文介绍并演示了鼻内疫苗的给药方法以及从哺乳期兔子（Oryctolagus cuniculus）采集乳汁的操作，以此作为在母体免疫转化研究模型中评估黏膜免疫反应的手段。

在新西兰白兔（Oryctolagus cuniculus）母体免疫研究中的鼻内免疫与乳汁采集

由于兔子在胎盘结构和抗体转移方面与人类具有相似性，因此是研究母体免疫化的理想模型。该模型的其他优势包括……

母体免疫及抗体转移的研究具有多重重要意义，因为这是新生儿和婴儿获得免疫保护、抵御病原体和疾病的第一条途径。由于兔子在胎盘结构和抗体转移方面与人类具有相似性，因此是研究母体免疫的优良模型。在本视频文章中，我们展示了实验室在新西兰白兔母体免疫研究中所采用的技术，包括经鼻免疫和乳汁采集。我们将首先描述一项在新西兰白兔中进行的黏膜母体免疫研究的示例时间线及事件序列。雌性兔子通过鼻内途径进行免疫，如本视频所示。根据具体研究设计，疫苗可能需要加强免疫，或需通过其他途径给予，例如肌肉注射免疫。尽管图中未展示，但应在首次免疫前采集血液，用于基线测量，并在后续研究过程中定期采集。通过中央耳动脉，在轻度镇静和局部镇痛剂作用下可轻松获取血液。这些样本可用于检测抗原特异性IgG水平。随后进行兔子的繁殖。为了确保这些研究具有较高的妊娠率，我们更倾向于从供应商处购买经过验证的种兔用于繁殖。根据免疫时间表的不同，兔子在妊娠期间可能需要接受额外的免疫接种。抗原特异性的IgG会通过胎盘转移给幼兔。母兔在配种后约30至32天将分娩产仔。我们建议在幼兔出生后的最初几天内尽量减少对其的抓取操作，以降低母兔排斥幼兔的风险。可从幼崽采集血液样本，以评估经胎盘转移的抗原特异性IgG水平。也可在出生时或出生前后从少量幼崽采集血液样本，以评估早期抗原特异性抗体水平。除了多种营养物质外，幼崽在哺乳期间还可从泌乳母羊获得抗原特异性IgA。幼崽通常在4至8周龄时断奶。在断奶前，可按照本视频所示方法，从哺乳期母羊中轻松采集乳汁。随后对采集的乳汁样本进行处理，以检测抗原特异性IgA。根据研究需要，可在幼兔出生后很早的阶段通过外侧隐静脉对其进行疫苗接种和加强免疫，并采集系列血样。接下来，我们将演示新西兰白兔的鼻内免疫接种及乳汁采集方案。所有操作均经杜克大学机构动物照护与使用委员会批准，并遵循其相关政策执行。鼻内免疫。所需材料：乙酰丙嗪（Acepromazine）、注射器和针头、眼用润滑剂、异氟烷（Isoflurane）、鼻罩、移液器及移液器吸头、黏膜疫苗。在处理动物前配制免疫溶液。使用乙酰丙嗪按每公斤体重1毫克的剂量进行肌肉注射使兔子镇静，并通过鼻罩使用异氟烷进行麻醉。当通过眼睑反射评估确认兔子已完全麻醉后，向每只眼睛滴加眼科润滑剂，以防止眼睛干燥及继发性角膜溃疡。当实验室人员准备接种疫苗且兔子已达到适当的麻醉深度时，关闭异氟烷和氧气，移除鼻罩。将兔子置于仰卧位，将其颈部和头部支撑在约45度角的位置，以便实验人员能够方便地接触并清晰观察两侧鼻翼。用移液器吸取不超过100 µL的疫苗溶液，迅速将溶液滴入一侧鼻孔，然后重复操作滴入另一侧鼻孔。移液器应保持约45度角。将针头朝向鼻腔内侧。免疫接种的目的是使溶液接触到鼻孔的黏膜组织，因此针头不应插入鼻孔内部，以免造成黏膜组织的擦伤或刺激，并可能影响经鼻接种疫苗的免疫原性。疫苗应快速接种，并以相同方式接种另一侧鼻孔。两侧鼻腔接种完成后，将兔子保持仰卧位30秒，以尽量减少疫苗溶液外漏。实验室通常每次每侧鼻孔接种量不超过100 µL。若需给予较大体积的疫苗，且总体积最大为500微升，可将疫苗分为每份100微升的等分试样，每次免疫之间间隔30秒。随后重复给予额外剂量的疫苗，每次给药之间保持30秒的休息间隔，直至完成全部疫苗体积的接种。免疫后，将兔子置于腹部体位以促进恢复，并密切监测动物状态，直至其能够维持胸骨卧位。在某些情况下，疫苗制剂可能未完全递送至鼻腔，部分疫苗制剂可能残留在鼻孔外部。此时，由于无法明确已准确递送至鼻腔的疫苗体积，不建议重新施用额外的疫苗材料，因为这会为实验引入一个未定义的变量。重要的是采用一种能够将疫苗制剂完整且一致地递送至鼻腔的疫苗递送技术。乳汁采集。所需材料：乙酰丙嗪、注射器和针头、酒精棉片、纱布、眼科润滑剂、异氟烷、鼻罩、催产素和采集管。通过肌肉注射每公斤1毫克乙酰丙嗪对家兔进行镇静，并使用鼻罩给予异氟烷进行麻醉。通过眼睑反射评估确认完全麻醉后，向每只眼睛涂抹眼用润滑剂，以防止眼睛干燥及继发性角膜溃疡。使用酒精棉片清洁耳缘静脉部位的皮肤。采用1毫升注射器和25号针头，通过耳缘静脉注射约1至2个国际单位的催产素，以诱导泌乳。 由于平滑肌松弛，给予催产素后兔子常会出现排尿或排便现象。注射催产素后，用一块纱布按压注射部位以达到止血目的。在保持麻醉面罩或鼻罩覆盖兔子鼻部的同时，将兔子后肢抬起，使其臀部垫高。顺便提一下，采集乳汁时也可使动物处于侧卧位，但本实验室发现，当由助手扶住兔子使其臀部着地直立，并用麻醉面罩固定时，采集乳汁更为方便。打开无菌管以准备采集乳汁，找到乳腺组织及相关乳头。兔子通常有四到五对乳腺。乳头周围通常因近期哺乳而有湿润的毛发，且当充满乳汁时，乳腺组织容易触及。用拇指和食指夹住与乳头相连的乳腺组织，沿乳头方向对腺体组织施加轻柔的按摩压力。将收集管置于乳头上，以收集挤出的乳汁。催产素有时需要数分钟才能起效，且不同乳腺的泌乳量可能存在差异。若挤奶不成功，可等待数分钟，或换至另一乳腺继续尝试。所有乳头采集的乳汁可收集于同一管中。通常可以从泌乳期的母羊中轻松收集到数毫升的乳汁。收集到所需体积的乳汁后，关闭异氟烷和氧气，移除兔子的鼻罩，并在密切监测下让兔子恢复，直至动物能够维持胸卧姿势。代表性结果。图一。在母体研究中，尽早确定妊娠状态有助于确认母羊是否需要重新配种。妊娠检测的方法包括触诊、超声检查、X光成像、体重增加监测，以及分子技术，如胰岛素样生长因子和孕酮的检测。足够的孕酮水平对于维持兔子的妊娠至关重要。因此，多项研究也评估了妊娠兔的孕酮水平，并证明与非妊娠兔相比，妊娠兔的孕酮水平升高，尤其是在妊娠中期器官形成阶段更为显著。如图一所示，即使已确认所有母兔均与公兔交配成功，仍可在妊娠兔中检测到较非妊娠兔更高的孕酮水平。使用全自动化学发光法检测血清孕酮水平。图二。通过胎盘在妊娠期间转移的抗原特异性IgG可在子代血清中通过ELISA进行检测。可在出生时或出生前后，从少量仔兔体内采集血液，以评估早期抗原特异性抗体水平。随着仔兔年龄增长、体型增大，连续采血在技术上要容易得多。如图二所示，可测定仔兔体内抗原特异性IgG的血清水平，并与母体水平进行比较。出生时母体传递的IgG水平较高，随后随时间推移逐渐下降。图三。兔奶可按本视频所示方法采集，并通过ELISA检测总抗体及抗原特异性抗体水平。如图所示，IgA 占乳腺乳汁中可被动转移给幼崽的总抗体的很大一部分。IgA 和 IgG 水平均显著高于 IgM。摘要：本视频文章介绍并演示了鼻内疫苗的接种以及从哺乳期兔子中采集乳汁的方法，以此作为在母体免疫的转化性适宜模型中评估黏膜免疫的手段。图示为一项典型的母体鼻内免疫研究设计的汇总图，包括免疫接种、交配、分娩、哺乳及抗体传递等环节。

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科研

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Immunology and Infection

免疫学与感染

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超声引导下将刀豆蛋白A注射至兔下泪腺：一种在兔模型中接种刀豆蛋白A以诱导干眼病的技术

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