一种用于研究调控体节发生信号振荡功能的微流控方法

调控多细胞系统的信号通路具有动态性。要理解这些动态过程的功能，关键在于能够在不影响整体信号活性的前提下，对这些动态进行精细调控。本方案采用一种微流控系统，可在发育中的小鼠胚胎中对信号振荡进行功能性解析。

已在包括成年组织在内的多种组织中发现信号动态。微流控是一种多功能工具，可针对多种模型系统进行调整，包括细胞、组织和类器官培养。首先，通过将单体与催化剂按九比一的比例混合，制备所需量的聚二甲基硅氧烷（PDMS），以引发聚合反应。

使用一次性工具，并确保充分混合。将PDMS混合物放入真空干燥器中，抽真空约30分钟以去除空气。向芯片模具中倒入约三至五毫米厚的PDMS层，然后再次放入真空干燥器中约30分钟。

将模具置于烘箱中，在65摄氏度或更低温度下过夜固化，具体温度取决于模具材料。使用解剖刀从模具中切下芯片。从微流控腔室内部开始，使用1毫米活检打孔器打出入孔和出孔。

用压缩空气清洁载玻片。为将芯片与载玻片键合，将芯片和载玻片放入等离子体烤箱中，使待键合面朝上。根据所用仪器的特定程序产生等离子体，然后通过将活化表面相互贴合并均匀施加压力，将芯片键合到载玻片上。

为实验准备管路和芯片，将管路以45度角剪切，并在每根管路上连接一根针头。将带针头的管路、芯片和塞子放入培养皿中，通过暴露于紫外光下约15分钟进行灭菌。为用纤连蛋白包被芯片，将芯片置于含有PBS加1%青霉素或链霉素的烧杯中，在室温下孵育。

使用 P200 移液器用 PBS 冲洗芯片以去除空气。为芯片的每个腔室装载一个 3 毫升注射器。将针头连接至含有纤连蛋白的注射器，并将注射器连接到注射泵上。

手动冲洗管路以排除空气。将出口管路连接到芯片的出口。确保将管路完全推到底部，并设置较低的流速以润湿芯片。

让注射泵运行至少两小时或过夜。运行结束后，停止泵并立即在针头后切断管路。准备装有培养基的注射器用于实验，并在 PBS 中对培养基和芯片进行脱气处理。

尽量将芯片中的大部分气泡冲洗或吸出，然后在泵上安装注射器，并将进样管路连接到注射器。要将组织加载到芯片上，需解剖尾部最末端的尖端。用含有25 µM HEPES的培养基冲洗芯片，以去除PBS。

使用P200移液器将组织加载到芯片中。每次组织加载步骤后，使用一段填充了PDMS的管路封闭相应的组织加载入口。组装微流控装置时，将管路连接至微流控芯片，注意避免内部产生气泡。

为此，请确保管路末端附有一滴培养基。待所有管路连接至芯片后，将其从烧杯中取出，并放入含有湿润纸巾的培养皿中。将培养皿及约1.5米长的进样管路一同置于培养箱中过夜培养。

保持高湿度以防止培养过程中产生气泡。或者，将芯片外表面干燥后放入显微镜载物台，并将载物台及约1.5米长的进样管一并置于倒置显微镜的培养箱内，用于活细胞成像实验。在持续流动至少20分钟后，开始按计划进行实验所需的泵液操作。

为了在分节的小鼠胚胎中同步化Notch信号，使用泵送程序：每100分钟更换培养基，随后30分钟给予药物脉冲，重复此循环直至实验结束，通常持续24小时。进行实时成像时，应在至少30分钟后开始成像。为确认信号振荡的同步化效果，需通过药物脉冲的时间点对多个实验进行时间对齐，并利用Cascade Blue染料进行可视化观察。

可以对量化后的振荡进行去趋势处理，并以均值和标准差的形式展示，或计算振荡的相位。可分析独立的胚胎后部培养物之间振荡的相位关系，以及它们与外部药物脉冲之间的相位关系。为验证同步性，例如可使用基于 Python 的程序 pyBOAT 确定内源性信号振荡的周期。

当施加周期为130分钟的脉冲时，Notch信号振荡也表现出130分钟的周期。在微流控实验中必须防止液体蒸发，否则芯片内将形成干扰培养基流动的气泡。

为防止此情况发生，需对培养基和芯片进行脱气处理，并确保培养箱内的湿度足够高。利用该方法，可调控信号动态，并通过荧光报告分子的实时成像、免疫染色或原位杂交来分析其效应。此外，也可将组织从芯片中取出，用于进一步分析。

可以利用该方法研究信号振荡在胚胎发育中的功能。该方法已被用于证明两个振荡信号通路之间相位差对于小鼠胚胎体节形成的重要性。更广泛地，该方法现在可用于解析多细胞系统中动态信号编码的机制。