Name: 使用支撑浮块在透射电子显微镜中制备样品支撑膜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 学习使用支撑浮块制备冷冻电镜样品支撑膜的方法，该方法可保护样品免受气液界面损伤，无需昂贵的亲水化处理即可快速制备石墨烯氧化物网格，提高样品完整性并简化操作流程。

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作者谨向结构学部所有成员表示感谢 &amp;#38; 伦敦帝国理工学院合成生物学中心的各位同仁，他们协助测试了这些技术，以及帝国理工学院高级创客空间的 Harry Barnett 和结构生物学中心的 Paul Simpson。CHSA 获得惠康信托基金与英国皇家学会联合资助的亨利·戴尔爵士研究员项目（206212/Z/17/Z）支持。

1. 透射电镜载网预支撑转移的一般制备
<ol>
	<li>使用一对洁净的精细镊子，依次将透射电镜（TEM）载网浸入双蒸水（ddH2O）或超纯水中 10–15 秒，随后浸入乙酸乙酯中 10–15 秒。 
	注：此处使用了反向操作、斜尖镊子。</li>
	<li>将仍夹持着载网的镊子移至一侧，静置晾干约 5 分钟。</li>
	<li>对载网进行等离子清洗，以去除在空气暴露或洗涤过程中吸附的表面污染物。 
	注：此处采用射频功率为 25 W 的空气等离子清洗，处理时间为 10–15 秒。</li>
</ol>
2. 试剂溶液的常规配制
<ol>
	<li>醋酸铀酰（UAc）溶液（2% w/v）
	<ol>
		<li>用铝箔包裹一个50 mL离心管，加入50 mL超纯水，并加入1 g UAc粉末。 
		注意：UAc对光敏感，长时间暴露会析出沉淀。由于UAc具有放射性和毒性，操作时需保持高度清洁。最主要的危险来自吸入或摄入，因此应格外小心以防止吸入任何细小颗粒。操作或称量铀盐时必须始终佩戴手套。建议佩戴口罩和护目镜。铀盐的处置必须符合所在地区针对放射性危害的法律法规。</li>
		<li>将溶液搅拌1小时，确保所有UAc完全溶解。储存于4°C。</li>
		<li>使用前，用0.22 µm滤膜将1 mL染色液过滤至小瓶中，以去除残留的醋酸盐晶体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>氧化石墨烯（GrOx）悬浮液
	<ol>
		<li>将2.5 µL GrOx移入1.5 mL离心管中（终浓度1%）。再加入2.5 µL 10% (w/v) n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM）去垢剂至GrOx中，轻轻混匀（终浓度0.1% (w/v)）。</li>
		<li>向GrOx-DDM混合液中加入245 µL超纯水，立即剧烈涡旋振荡5分钟。制备后1小时内使用，使用前需剧烈涡旋振荡至少1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三氯化铁（FeCl3）溶液（10% w/v）
	<ol>
		<li>在称量纸上小心称取5 g FeCl3，转移至含有35 mL ddH2O和磁力搅拌子的100 mL量筒中。</li>
		<li>置于磁力搅拌器上，搅拌溶解FeCl3，并用ddH2O定容至50 mL。将FeCl3溶液通过0.8 µm注射器滤膜过滤至洁净瓶中储存。 
		注意：FeCl3具有腐蚀性并可引起刺激；在进食、饮水或吸烟前以及离开工作场所时，应用温和的肥皂和水清洗手部及其他暴露部位。操作区域应保持良好通风，防止蒸气形成。避免吸入雾气、蒸气或喷雾。操作或称量该盐时必须始终佩戴手套。使用过程中强烈建议佩戴口罩和护目镜。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用支持漂浮块对云母上的碳支持膜进行缓冲液置换，以制备负染样品
<ol>
	<li>清洗并用等离子体清洁透射电镜载网。 
	注意：此处使用的是如上文第1节所述的300目铜支持的带孔碳膜载网。</li>
	<li>将10–12 µL样品移入浮载装置的缓冲液交换孔（带小通道）中，同时将10–12 µL的2%醋酸铀（UAc）溶液（见第2.1节）加入相邻的非缓冲液交换孔中用于负染。 
	注意：该孔体积为10 µL；但应调整样品体积，使液面形成凸形弯月面，以利于薄膜正常漂浮。样品体积过低可能导致薄膜破裂。</li>
	<li>小心切割两小片表面已预先沉积碳膜的云母片。确保云母碎片的宽度足以放入孔中（3.4 mm宽），且长度超过孔的长度（3.45 mm），以便碎片能架在孔上，使碳膜漂浮，并留有足够的空间便于用镊子操作。 
	注意：操作碳膜时应使用平头负压长尖镊子。切割云母碎片时应采用单次动作切割，以保持碳膜完整性。</li>
	<li>以约45°角将云母片浸入孔中，直至云母片落在孔的斜坡上，并在液体样品表面观察到一层碳膜。</li>
	<li>初始孵育样品后（通常为20秒至20分钟，具体时间取决于样品的附着性；应根据实验需求优化此时间），非常缓慢地提起云母片，以回收碳膜并尽量减少黏性残留样品的附着。</li>
	<li>用滤纸轻触云母片下表面（无碳一侧）小心吸去多余液体，随后将带有样品的碳膜转移至负染液中，即将其浸入相对的另一孔中（即，如步骤3.4所述浸入含有2% UAc溶液的孔中）。 
	注意：此时应可在染色液表面观察到漂浮的碳膜层。</li>
	<li>用已清洗并经等离子体处理的电镜载网的带孔碳膜面回收漂浮的碳膜层。将载网静置风干，待在透射电镜下成像。理想情况下，干燥过程中应覆盖载网以避免空气中的污染。</li>
</ol>
4. 应用支撑漂浮块制备氧化石墨烯包被的透射电镜载网
<ol>
	<li>使用300目带孔碳膜铜网，按照上述第1节所述方法清洗并进行等离子清洗。</li>
	<li>将10–12 µL的GrOx悬浮液（见第2.2节）移入浮力块上的4个非缓冲液交换孔中。将10–12 µL的ddH2O或超纯水加入块中其余4个缓冲液交换孔中。 
	注意：此体积的水应足以形成略微凸起的弯月面，高于浮力块的高度。</li>
	<li>将4个载网轻轻滴加到每个孔中的GrOx悬浮液上，保持1分钟，确保带孔碳膜的一面与溶液接触。1分钟后，通过将镊子滑入非缓冲液交换孔的镊子槽中，小心回收每个载网。</li>
	<li>非常轻柔且短暂地将每个载网的铜面（无碳膜面）接触相邻孔中的ddH2O。然后，小心而轻柔地将载网朝下（水滴面朝下）贴附在一片滤纸上。 
	注意：通过毛细作用，吸除水分会将GrOx悬浮液拉过载网。必须避免将载网浸入ddH2O中，因此接触时间应极短。当提起载网时，应有一小滴水附着在载网底面。注意不要在滤纸上移动载网，以免干扰GrOx片层的沉降。</li>
	<li>将载网保留在镊子中，于空气中干燥，直至进行样品制备。理想情况下，在干燥过程中应覆盖载网，以避免空气中的污染。</li>
</ol>
5. 单层石墨烯薄膜样品制备中支撑浮力块的应用
<ol>
	<li>按照上述步骤（第1节）清洗透射电镜载网，但省略等离子清洗。 
	注意：此处使用的是300目带孔碳膜的金载网，但其他非铜载网或铜合金载网也可适用。</li>
	<li>为在载网上沉积石墨烯，可直接将生长在铜基底上的石墨烯（Cu-石墨烯）转移至冷冻电镜载网，具体方法如前所述25。
	<ol>
		<li>将四个已清洗的载网放置在沉积于玻璃载片上的Cu-石墨烯片（10 mm × 10 mm）表面，并在每个载网上滴加一滴异丙醇（5–10 µL），以确保单层石墨烯与载网之间充分接触。 
		注意：请确保将载网带有孔状碳膜的一侧与石墨烯片接触。</li>
		<li>待异丙醇完全挥发后（通常约2小时），将附有载网的Cu-石墨烯片漂浮于玻璃培养皿中的10%（w/v）FeCl3溶液（见第2.3节）上，室温下静置过夜进行蚀刻。盖上培养皿以避免空气污染。 
		注意：蚀刻完成后，仅剩单层石墨烯漂浮在FeCl3溶液表面——在适当光照下肉眼可见。</li>
		<li>使用直径大于透射电镜载网的环形工具捞取漂浮在单层石墨烯上的载网，并小心转移至盛有ddH2O的玻璃培养皿中进行洗涤。 
		注意：捞取载网时需格外小心，避免触碰培养皿壁，以防石墨烯薄膜破裂或弯曲。</li>
		<li>通过捞取并转移至盛有新鲜ddH2O的洁净培养皿中，再用水清洗两次，以彻底去除残留的FeCl3。最后将载网转移至盛有样品缓冲液的培养皿中，直至进行样品制备和快速冷冻。 
		&#8203;注意：载网上覆盖石墨烯的一侧必须始终保持湿润，以防止暴露于空气污染物中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品（10–12 µL）移取至浮力块的非缓冲液交换孔中。当样品就位后，用洁净镊子从缓冲液中取出一个石墨烯包被的载网，并将其放置于含有样品的孔表面。</li>
	<li>经过适当的孵育时间（1–5分钟，根据样品而定；可根据实验需求优化）后，用洁净的冷冻镊子夹取载网，随后进行滤纸吸除多余液体和玻璃化冷冻操作。</li>
</ol>

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</ol>

作者们未意识到本研究存在任何利益冲突。

本文介绍了使用样品漂浮块处理非晶碳膜和石墨烯薄膜以进行冷冻电镜样品制备的实验方案27一个用于支撑块的 STL 文件可从公共的 Thingiverse 仓库免费获取 [www.thingiverse.com/thing:3440684]，可使用合适的树脂通过任意适用的立体光刻 3D 打印机进行打印。在透射电镜网格上使用碳膜通常涉及将碳膜漂浮至样品表面28这种方法制备负染电镜载网可最大限度减少支撑膜操作过程中的空气暴露，从而降低污染和蛋白质变性风险。采用在小孔中漂浮碳膜的方法制备载网，有利于获得更大的漂浮表面积， 即在水浴或培养皿中时，碳材料的机械剪切会更容易发生。
由于本出版物发布时的健康与安全法规限制，UAc 可能难以购买。目前已有多种其他常用的非放射性负染试剂可供选择，其制备方案此前已有报道29。尽管本研究中未使用该浮载装置尝试其他染色剂，但除与样品孵育时间的优化（步骤 3.5）外，预计这些染色方案不会存在显著差异，而孵育时间本身已具有样品依赖性。本 GrOx 载网制备方案的关键步骤是步骤 4.4，该步骤特别注明需防止水溶液与 GrOx 溶液在载网边缘接触。水溶液与 GrOx 溶液的不当混合会阻碍 GrOx 片层通过毛细作用单向沉降。若碳膜两侧均附着 GrOx 片层，则会形成较厚的堆积层，从而抵消使用 GrOx 作为近单层支撑的优势，同时片层间会夹带水分，导致可用区域被额外的冰层污染。通过将溶液滴加至柔性聚烯烃薄膜上，可相对容易地制备氧化石墨烯支撑膜。然而，采用该方法时，操作失误更容易意外污染载网的铜面；使用浮载装置可显著降低此类情况的发生概率。
最后，本文提出了一种制备石墨烯覆盖载网的方案，该方法无需对石墨烯进行任何使其亲水化的预处理，从而降低了成本并提高了可及性。在样品制备过程中保持薄膜湿润，并将样品施加于湿润的薄膜上 原位 在冷冻前的载网处理步骤中，只需确保形成适合冷冻电镜观察的冰层，即可实现样品在水-冰界面的均匀分布。总体而言，本文所述的实验方案最大限度地减少了样品与气-液界面的接触，从而降低了样品变性及载网污染的风险。针对这三种支持膜材料，均能在铜网上获得均匀的样品分布，并实现完整且保存良好的单颗粒成像。

在过去十年中，主要得益于探测器技术的进步，以及其他技术领域的突破，生物相关体系通过透射电子显微镜（TEM）成像所能达到的分辨率实现了连续显著提升1,2。尽管冷冻电镜（cryo-EM）结合单颗粒分析（SPA）已能够仅用低至50 µg的蛋白质样品解析出高分辨率结构，但冷冻电镜的样品制备和载网处理仍是主要瓶颈3,4,5。SPA样品由大分子在玻璃态冰层中近似随机分布构成。冰层必须尽可能薄，以最大化颗粒与溶剂之间的衬度差异。然而，生物大分子在较厚的冰层中更为稳定（即更不易失去其天然结构），因为其溶剂化状态更佳。此外，通常发现颗粒在远厚于颗粒尺寸的冰层中在整个视域内的分布明显更均匀，且经常根本无法在碳膜的孔洞中找到颗粒6。
此外，较厚的冰层由于具有较高的表面积与体积比，会降低分子靠近气-水界面的可能性。据估计，在冷冻电镜研究中使用标准的浸入式冷冻方法会导致约90%的颗粒吸附到气-水界面7。较厚的冰层会因溶剂内部散射事件增加以及信号随之衰减，产生不理想的高背景噪声6,7。因此，必须尽可能获得薄层的玻璃态冰；理想情况下，冰层厚度应仅略大于颗粒本身。研究人员面临的挑战在于，针对每种不同的样品在载网上制备时，都必须克服这一难题：既要使样品足够薄以实现高对比度成像，同时又要保持颗粒在其样品中的结构完整性。蛋白质吸附至气-水界面通常伴随多种不利影响。
首先，蛋白质与该疏水界面结合时往往会引发蛋白质变性，这一过程发生迅速且通常不可逆8,9。一项利用酵母脂肪酸合酶开展的研究显示，高达90%的吸附颗粒会发生变性10。其次，一项比较在非晶碳膜11上与无支撑膜12条件下收集的80S核糖体取向分布数据的研究表明，气液界面可能导致严重的取向偏好，从而影响三维结构的重构13。减少颗粒与气液界面相互作用的方法包括在冷冻缓冲液中添加表面活性剂（如去垢剂）、使用支撑膜、底物的亲和捕获或支架化，以及缩短 plunge 时间。然而，使用表面活性剂本身也存在一些问题，因为某些蛋白质样品在表面活性剂存在下可能表现出非理想行为；而亲和捕获和支架化底物通常需要设计定制的载网表面及捕获策略。最后，尽管目前已有大量关于快速 plunge 装置开发的研究14,15,16，但这些装置所需的设备通常尚未广泛普及。
尽管生物冷冻电镜的标准透射电镜（TEM）载网已带有穿孔的无定形碳膜17，但仍存在多种可用于制备额外支撑膜并将其转移至TEM载网的实验方案。使用这些支撑膜是一种长期建立的样品稳定方法18。无定形碳支撑膜通常通过在云母晶体片上蒸发沉积制备19，随后可将碳膜漂浮转移至载网上，此前已有报道证实漂浮法制备的支撑膜是有效的工具20。氧化石墨烯片层通常采用改进的Hummers法制备21，因其背景信号较低，并能有效固定和稳定大分子，已被用作优于无定形碳的支撑结构22。近年来，由于石墨烯具有良好的机械稳定性、高导电性、极低的背景噪声干扰23，以及可重复制备大面积单层石墨烯24并将其转移至TEM载网的技术进展25，其作为TEM支撑膜的应用重新受到关注。与无定形碳相比，后者在电子束照射下会产生类似甚至更严重的漂移现象，其程度与无支撑膜的冰层相当或更差11,12,17，而石墨烯在减少冷冻电镜图像中的电子束诱导漂移方面表现出显著优势12。
然而，尽管亲水化石墨烯能够保护脂肪酸合酶免受气液界面变性的影响，但本研究的作者指出，在样品制备过程中石墨烯容易受到污染，这可能是由于大气中的碳氢化合物污染以及用于使载网亲水化的试剂共同导致的10。事实上，尽管石墨烯具有诸多优异特性，但其广泛应用仍受限于为降低其疏水性所需的衍生化处理12，而这种处理在化学上具有挑战性，并需要专用设备。本文报道了使用三维（3D）打印的样品漂浮块27将非晶碳、氧化石墨烯和石墨烯支撑膜直接从生成基底转移至透射电镜（TEM）载网的制备方案（图1）。使用此类装置的一个关键优势在于可实现薄膜的湿态转移，最大限度地减少支撑膜的疏水性污染，从而避免进一步处理，并减少可能造成损伤的手动操作步骤。这些方法实施成本低廉，因此具有广泛的可及性，适用于需要样品支撑膜的冷冻电镜（cryo-EM）研究。

<table><tbody><tr><td>基础等离子清洗机（230 V）</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子 N5A INOX</td><td>Dumont Swissmade</td><td>0302-N5A-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子 NGG INOX</td><td>Dumont Swissmade</td><td>0102-NGG-PO</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270989-250ML</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L 钓鱼环</td><td>VWR</td><td>612-9353</td><td></td></tr><tr><td>氧化石墨烯 2 mg/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>763705-25ML</td><td></td></tr><tr><td>三氯化铁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31232-250MG</td><td></td></tr><tr><td>云母片 75 mm × 25 mm × 0.15 mm</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG250-1</td><td>我们通常在云母上镀一层目标厚度为 2 nm 的碳膜</td></tr><tr><td>铜基单层石墨烯</td><td>Graphenea</td><td>N/A</td><td>10 mm × 10 mm，每包4片</td></tr><tr><td>n-十二烷基-&amp;beta;-D-麦芽糖苷（DDM）</td><td>GLYCON Biochemicals GmbH</td><td>D97002-C</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R1.2/1.3 300目铜网格</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>JBS-X-101-Cu300</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R2/1 300目铜网格</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>JBS-X-102-Cu300</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R2/1 300目金网格</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q350AR1</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT577</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>TAAB Laboratories Equipment</td><td>U001</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸 55 mm</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1441-055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 滤纸 70 mm</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1441-070</td><td></td></tr></tbody></table>

使用支撑漂浮块制备透射电子显微镜样品支撑膜

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

近十年来，冷冻电子显微镜（cryo-EM）结构解析技术迅速发展；然而，样品制备仍然是一个重要的瓶颈。大分子样品理想状态下应直接在薄层玻璃态冰中以随机取向成像。然而，许多样品难以满足这一条件，且蛋白质在气液界面发生变性是常见问题。为克服此类问题，可在载网上使用支撑膜——包括无定形碳膜、石墨烯和氧化石墨烯——为样品提供附着表面，从而降低颗粒暴露于有害气液界面的概率。然而，将这些脆弱的支撑膜应用于载网时，需谨慎操作，以避免破裂、空气污染或繁琐的清洗步骤。最近有研究报道了一种易于使用的漂浮装置，可实现支撑膜直接、湿润状态下的转移至样品。使用该装置可最大限度减少人工操作步骤，保持支撑膜的物理完整性，并缩短疏水性污染累积的时间，确保仍能形成薄冰层。本文提供了用于电镜研究的碳膜、石墨烯和氧化石墨烯支撑膜制备的逐步操作方案。

使用无定形碳支撑膜制备的透射电镜载网通常在整个载网表面均有覆盖。尽管在某些情况下碳膜会出现破裂以及部分起皱现象（图2A），但仍存在大量完好无损的网格区域，因此广泛适用于负染色实验。影响支撑膜完整性的主要因素是碳膜厚度，该厚度由碳蒸发过程决定。同样，采用本GrOx方法时，载网整体通常也能实现良好的覆盖（图2B）。仅需将GrOx悬浮液施加1分钟，即可确保多层区域极少，且因石墨烯氧化物片层边缘清晰而易于识别。GrOx载网可由原始材料快速制备，并对样品具有高度保护作用。然而，由于GrOx片层本身的特性，GrOx载网上更常观察到片层边缘、覆盖不完全及起皱等现象，相较于其他技术更为明显。
尽管石墨烯支撑膜的完整性（类似于无定形碳膜）依赖于沉积过程，但覆盖良好的区域会显示出单层石墨烯的特征衍射图样。重要的是，通过保持石墨烯支撑膜处于湿润状态，可在孵育后从漂浮块上回收样品，并以适用于单颗粒分析的方式收集数据。该方法无需对石墨烯进行任何其他润湿处理，从而避免了使用昂贵设备使石墨烯亲水化的步骤，建议在样品制备和载网冷冻前尽快制备支撑膜（图2C）。
<img alt="缓冲液交换系统示意图及装置；用于生化分析的微流控装置；孔板视图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62321/62321fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1样品漂浮块的设计及其在支撑膜制备过程中的应用 (A) 浮力块的俯视图、井状结构图和侧视图示意图，包含形状、深度和倾斜度的测量标注。图中所示还包括镊子尖端放置的凹槽以及用于插入针头的通道。 (B) 使用斜坡可将非晶碳层轻松漂浮至漂浮板孔内缓冲液的表面， 即.，在制备负染透射电镜载网的过程中。C) 井的宽度适合容纳一个透射电镜（TEM）载网，而镊子凹槽可减少在制备步骤中不必要的释放和拾取载网操作，同时在载网需要释放时提供明确的回收路径，避免弯曲风险。图像见 B 经修改自 27缩写：TEM = 透射电子显微镜。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62321/62321fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="冷冻电镜载网分析，载网网格上的蛋白质颗粒，电子显微镜结果，纳米结构观察" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62321/62321fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2使用漂浮法载网制备的样品支撑膜的典型示例。 网格方格（左）和图像（右）视图显示如下（A) 非晶碳，(B）氧化石墨烯，以及（C) 使用漂浮法块制备的石墨烯支撑膜。无定形碳支撑膜用于70S核糖体负染样品的制备，而氧化石墨烯和石墨烯支撑膜则用于70S核糖体冷冻电镜样品的制备。图像见于 A 和 C 经修改自 27比例尺为 A 网格方格 = 10 µm；比例尺用于 B 以及 C 网格方格 = 5 µm；比例尺用于 A-C 图像比例尺 = 50 nm。缩写：cryo-EM = 冷冻电子显微镜技术。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62321/62321fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

冷冻电子显微镜（cryo-EM）的样品制备是该方法结构解析流程中的一个重要瓶颈。本文提供了使用一种易于操作、可三维打印的模块化样品支撑膜制备装置的详细方法，用于透射电镜研究中样品的稳定化制备。

冷冻电镜（cryo-EM）结构解析在过去十年中迅速发展；然而，样品制备仍然是一个重要的挑战……

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

使用支撑浮块在透射电子显微镜中制备样品支撑膜

来源：Bucher, T., et. al., 利用枯草芽孢杆菌生物膜模型研究小分子生物膜抑制剂的方法学。J. Vis.

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使用支撑漂浮块制备透射电子显微镜样品支撑膜

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