利用高细胞密度生物反应器通过实时定量细胞内核磁共振监测人体细胞中的蛋白质-配体相互作用

细胞内核磁共振（NMR）波谱技术为在活细胞内直接研究蛋白质结构与功能，以及监测蛋白质-配体相互作用等生物学相关过程提供了独特的方法。该NMR生物反应器可在核磁共振谱仪中维持大量人类细胞数天的存活与代谢活性，从而实现细胞内NMR的实时应用。该方法适用于任何可溶性、自由翻滚的胞内蛋白质，且其发生构象变化或化学变化时均可使用。

同位素标记进一步拓展了该方法的适用性。首先，使用第二个流动单元核磁共振管组装流动单元，该管随后将被含有细胞的核磁共振管替换。请参考流动单元操作说明书以正确组装。

将连接至流控单元温度控制系统的水浴设置为 37 摄氏度，并将储液瓶放入水浴中。将储液瓶的 FEP 管路连接至泵。将生物反应器阀门调至旁路位置，并用培养基预填充泵。

然后，将生物反应器阀门调至流动状态，以每分钟0.1毫升的流速用培养基预填充生物反应器。从二氧化碳培养箱中取出一个转染的HEK 293 T细胞T75培养瓶，移除用过的培养基。向细胞中加入2毫升胰蛋白酶EDTA，于室温孵育5分钟，使细胞脱落。

加入 20 毫升完全 DMEM 培养基以灭活胰蛋白酶，并通过反复吹打充分重悬细胞。随后将细胞转移至 50 毫升离心管中。在室温下以 800×g 离心 5 分钟，弃去上清液。

将细胞沉淀转移至一个1.5毫升带盖的微量离心管中。为了将细胞包埋在琼脂糖丝中，先在金属浴中将一份凝固的琼脂糖于85摄氏度融化，随后将其保持在金属浴的37摄氏度条件下以维持液态。使用巴斯德吸管，向流动装置核磁共振管底部加入60至70微升1.5%琼脂糖凝胶，并将其置于冰上，形成一个高度为5毫米的底部凝胶塞。

将细胞沉淀在金属浴中加热15至20秒，然后小心地将细胞重悬于450 µL琼脂糖溶液中，避免产生气泡。将细胞/琼脂糖悬液吸入一段长度为30厘米、内径为0.75毫米的色谱用PEEK管路中，该管路连接至1毫升注射器。让管路在室温下冷却2分钟。

在室温下，用 100 微升 PBS 预填充流动单元 NMR 管。通过轻轻推动注射器，将包埋在琼脂糖中的细胞丝注入流动单元 NMR 管中。从流动单元中移除空的 NMR 管，并将流速提高至每分钟 2 毫升，持续数分钟，以去除进样管路中的残留气泡。

将流速设置为 0.2 毫升每分钟，并缓慢而稳定地向上推入装有细胞的核磁共振管。以 0.1 毫升每分钟的流速供给生物反应器培养基。将核磁共振波谱仪的温度设置为 310 开尔文，并将流动单元插入波谱仪中。

将生物反应器插入核磁共振波谱仪后，等待数分钟以完成培养基的交换。调节质子通道的匹配与调谐，匀场磁体，并计算质子90度硬脉冲长度。根据质子硬脉冲调整每个脉冲序列中的质子功率水平。

记录第一张zgesgp质子核磁共振谱，以记录样品在磁场均匀性下的成分。将zgesgp以及p3919gp或SOFAST-HMQC实验复制至所需次数，并将其加入数据采集队列中。使用无菌长针头注射器穿刺硅胶管，将外源分子的浓缩溶液注入介质储液瓶中。

在核磁共振（NMR）实验结束后，将装有细胞的样品管替换为一个空管，并用水冲洗流动单元。对于表达未标记碳酸酐酶的细胞，通过应用零填充和指数线宽化窗函数来处理 p3919gp 谱图。对于表达氮-15标记的超氧化物歧化酶的细胞，通过在两个维度上均应用零填充和平方符号钟形窗函数来处理 SOFAST-HMQC 谱图。

在 MATLAB 中，使用自定义脚本 Load_ascii_spectra 导入光谱区域。运行 Load_acqus 脚本以从一维光谱中提取时间戳。运行 mcr_main 脚本打开 MCR-ALS 2.0 图形用户界面，在“数据选择”选项卡中加载光谱矩阵。

通过绘图检查数据。通过奇异值分解或手动评估组分数目，并选择一种方法对纯光谱进行初始估计。可采用最纯变量检测或渐进因子分析。

在“选择数据集”窗口中，选择“继续”。在“约束条件：行模式”窗口中设置浓度的约束条件。应用非负性约束，选择 fnnls 作为实现方法，并将物种数量设为 2。

然后，应用一个闭合约束，将约束值设为1，闭合约束条件设为等于，并应用于所有物种。在“约束：列模式”窗口中设置光谱的约束条件。应用非负性约束，选择 fnnls 作为实现方法，并将物种数量设为2。

在最后一个窗口中，设置 50 次迭代和 0.01 的收敛标准。指定浓度、光谱和标准偏差的输出名称。单击继续以运行 MCR-ALS 拟合。

通过台盼蓝染色实验确认，生物反应器中的细胞可存活长达72小时。该生物反应器用于实时监测两种抑制剂——乙酰唑胺和甲乙唑胺——与在HEK 293 T细胞胞质中过表达的碳酸酐酶之间的结合。通过首次激发塑形质子谱评估了过表达蛋白信号的存在以及磁场均匀性。

对于碳酸酐酶，通过观察 WATERGATE 谱图中 11 至 16 ppm 区域内的质子信号，监测两种抑制剂在细胞内的结合情况，这些信号来源于与锌配位的组氨酸及其他芳香族残基。结合成功的依据是出现了额外的信号。采用 MCR-ALS 方法分离游离态与结合态碳酸酐酶产生的核磁共振信号，并获得两种物种的相对浓度分布曲线。

采用生物反应器监测了依布硒啉（ebselen，一种谷胱甘肽过氧化物酶模拟物）促进的锌结合超氧化物歧化酶分子内二硫键的形成过程。通过对二维谱图选定区域进行MCR-ALS分析，分离出两种物种产生的信号，并获得了它们的相对浓度分布曲线。插入和取出流动单元核磁共振管时，必须缓慢而稳定，以避免压力突变导致气泡产生。

NMR 生物反应器的开发为研究原子分辨率的时间依赖性过程铺平了道路，例如在活细胞中绘制氧化还原调控以及药物/靶点相互作用的过程。