通过CRISPR/Cas9基因敲入及细胞分选在巨噬细胞和T细胞系中实现基因编辑

本实验方案的目的是借助荧光报告基因并结合细胞分选技术，简化在巨噬细胞和T细胞系中进行CRISPR/Cas9介导的基因敲入实验。ROSA26位点是公认的基因组安全港位点，常用于外源基因的插入。通常可在小鼠ROSA26位点或其人类同源位点中，表达目标蛋白，无论是否带有标签。

第1部分：靶向Rosa26位点的sgRNA设计与质粒构建。首先，利用小鼠基因组信息学（Mouse Genome Informatics）和Ensemble基因组浏览器中的序列，从小鼠Rosa26位点设计sgRNA，然后下载小鼠Rosa26基因的基因组序列。访问在线工具CRISPOR，将来自Rosa26位点的100个碱基对的输入序列粘贴至该工具中。

然后选择一个基因组，例如 Mus musculus-小鼠参考基因组2011。接下来选择PAM类型。使用20 bp NGG"PAM序列，该序列为spCas9所识别。

单击提交。选择特异性评分高、切割效率评分高且脱靶目标较少的向导RNA。应避免使用标注为效率低下的向导RNA。

值得注意的是，优选选择两个具有重叠序列的向导RNA，据报道称这可能会提高敲入效率。对于温暖餐序列，合成一条正向非法引物和一条反向非法引物，经退火磷酸化后即可用于克隆至载体。通过BbsI一位点消化制备线性化的载体，该载体能够表达报告基因；将退火后的引物连接至线性化载体，以构建最终的表达载体，该载体可同时表达向导RNA和与DSRIP二荧光报告基因连接的Cas9核酸酶。

第二部分：作为同源重组模板的靶向载体构建。用于表达目的蛋白。例如，人类寿命延长。

可从商业来源合成cDNA序列，并将亲和OST标签或其他常用于蛋白质纯化的标签与cDNA序列融合。请注意在cDNA起始密码子前包含Kozak共有序列。使用AscI限制性内切酶进行消化，并将获得的cDNA插入片段连接至载体骨架中。

载体即pKhR26-IBFP IBP，其最终靶向构建物包含容器序列，以及分别位于五端和三端的同源臂。表达盒包含一个CG启动子、UST增强子、Koonin区域，该区域连接一个Iris荧光报告基因和一段poly A信号序列。最后，通过使用EcoR1或BamH1等特异性限制性内切酶对靶向载体进行消化，将消化产物纯化后保存于-20 °C，用于后续电穿孔实验。

建议获得高浓度的线性化载体 DNA。第三部分：巨噬细胞和 T 细胞系的电穿孔，按照分离吉立塔克细胞的步骤进行细胞培养。转染时的最佳细胞密度约为每毫升 0.5 × 10⁶ 个细胞。

完整电穿孔操作采用十种宏观微核式尖端规格，准备一个24孔板，每孔加入500微升不含抗生素的完全生长培养基。将培养板置于加湿的37摄氏度、5% CO₂培养箱中预热。调低电转系统输入，设置适用于JetCAt或Rosales的电穿孔参数。

准备细胞DNA混合物的后续操作或收集鸡细胞。将Curchin 25平方厘米培养瓶中的细胞转移至15个动物培养瓶中。随后，将细胞通过离心在室温下以90 × g离心8分钟，弃去上清液。

洗涤时，用5 mL PBS重悬细胞，然后在与前一步相同的条件下通过离心旋转细胞悬液。弃去DPPs，并用2 mL DBS重悬细胞沉淀。

将微小的细胞悬液与等体积的0.2% Trepan Ballou混合，以估算细胞数量，将样品加载到计数槽中，插入Connie载玻片，放入自动细胞计数仪中自行观察图像，然后获得细胞计数结果。计算出200万细胞用于每次电穿孔实验，在敲除实验中将细胞数量转移至1.5 mL离心管中。通过离心形成细胞沉淀，离心收集细胞。

为节省时间，可在离心过程中配制电穿孔混合液：在新的1.5 mL离心管中加入2.5 µg的CRISPR Cas9载体、2.4 µg的Belinda rice、报告载体以及重悬缓冲液，总体积为55 µL，轻轻涡旋混匀，并短暂静置以充分混合。

使用前将Luxor压力混合物置于室温。离心天冬氨酸后，DTB在此基础上再融合30秒，尽可能去除上清液，通过加入制备好的电穿孔混合物，用移液器轻轻吹打重悬细胞。进行电穿孔时，使用10微升微量核转杯尖端的移液器吸取细胞电穿孔混合物至关重要。

移液时避免产生气泡，否则会导致电镀失败。按下启动按钮，随后操作将很快转移样品。

将24孔板中的细胞加入预热的完全培养基，对剩余的四个重复样品执行与上述相同的电穿孔压力和操作步骤，轻轻摇动培养板以确保细胞均匀分布。将细胞置于37°C培养箱中孵育48至72小时。在进行细胞分选前，转染后24小时，使用荧光显微镜观察Disrupt2报告基因的表达情况，若观察到报告基因呈脱离状态，则表明电穿孔操作已成功进行。

第4部分：通过细胞分选分离潜在的基因敲入细胞。在进行细胞分选前，准备96孔板，每孔加入150 µL 细胞类型特异性的完全培养基，使用圆底微量孔板用于后续培养，使用平底微量孔板用于所有细胞的转移。将细胞转入无菌FACS管中，保持管子置于冰上，并将样本盒通过传递窗送入细胞分选室。如适用，设置细胞分选仪使用85 µm喷嘴和低流速模式进行免疫细胞分选，以获得最佳的细胞可评估性和存活率。从传递窗处短暂取样，然后将样本加载至采集室中。设置细胞分选参数：首先根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）定义细胞门控，随后通过设定阈值圈选活细胞，排除死细胞和碎片。

接下来，通过使用FSC-H与FSC-A的单细胞门控（单细胞分选）在多参数区段中寻找活的单个细胞。最后，针对目标DSR2和B设置门控，以筛选Volvo阳性亚群，该亚群代表已成功共转染CRISPR载体和包装载体的细胞。分选后，采用预热的完全培养基，通过周期模式或单细胞模式，将每孔10个单细胞接种至96孔板的每个孔中，并将96孔板置于细胞培养孵箱中孵育，以进行细胞扩增。

第五部分：阳性敲入细胞的筛选 在细胞存活后经过约两周的扩增，从48孔板中取少量细胞，以野生型细胞作为阴性对照群体，通过检测BFP表达或流式细胞术评估细胞中BFP阳性细胞的比例。保留BFP阳性细胞比例较高的孔继续进行验证。提取这些细胞的基因组DNA，使用跨越同源臂两侧的引物通过PCR扩增。其中一条引物位于靶向载体外侧的基因组序列中，另一条引物位于载体序列内。在本实验中，使用该引物组合扩增出的PCR产物预期大小为1.2 kb；使用F2和R2引物扩增得到的产物为1.2 kb。Sanger测序结果显示，PCR产物包含每个整合位点的连接序列，证实了基因正确敲入Rosa26位点。

例如，免疫印迹可用于在蛋白质水平上验证基因敲除是否成功，这是第六部分的代表性结果。如先前发表的研究所示，我们表达了带有OSD标签的GET45分子，并在使用USD标记的T细胞中检测到26个位点。GET45及其相互作用蛋白通过亲和纯化富集后，进行质谱分析。

蛋白质组学数据揭示了T细胞之间的相互作用。因此，该产物库极大地促进了寻找新型嵌入剂以阐明特定蛋白质功能的研究。本技术展示表明，通过瞬时表达，在每条RFP过表达的细胞系中，与表达载体共表达BFP，并靶向Rosa 26位点。

我们构建了在T细胞和巨噬细胞中均能实现稳定基因表达的基因敲入细胞系，而这类操作在遗传学操控中通常难以实现。本方法及相关建议适用于CRISPR技术介导的大片段DNA插入，可用于免疫细胞的机制研究，例如蛋白质鉴定、蛋白质相互作用分析等。