Name: 基因敲击由CRISPR/Cas9和细胞排序在巨噬细胞和T细胞线 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 了解CRISPR/Cas9介导的基因敲入技术，利用荧光报告基因和细胞分选在巨噬细胞和T细胞系中实现高效基因插入。该方法无需药物筛选或病毒载体，适用于免疫学功能基因组学研究。

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感谢新乡医学院流式细胞术核心设施。该技术的开发得到了国家自然科学基金项目81601360（资助LZ）、81471595和32070898（资助YL）的支持。本工作还得到了河南省教育委员会基金项目No. 21IRTSTHN030的资助。

1. 靶向 Rosa26 位点的sgRNA设计与质粒构建
<ol>
	<li>在目标插入位点周围设计引导RNA
	<ol>
		<li>确保小鼠的插入位点 Rosa26 （以下称为 mRosa26）基因敲入实验位于第一个内含子中 mRosa26；该位点已在先前的研究中使用过28,29对于人类细胞中的敲入实验，确保插入位点位于人类基因组中 ROSA26 位点（下文简称 hROSA26），已被确认为人源同源基因 mRosa2630.</li>
		<li>使用从小鼠基因组信息学数据库（Mouse Genome Informatics，http://www.informatics.jax.org/）和 Ensembl 基因组浏览器（http://www.ensembl.org/index.html）分别获取的小鼠和人类物种的基因组序列。复制目标基因上游 50 个碱基对（bp）的基因组序列&#160;mRosa26 或 hROSA26 位于目标插入位点两侧的位点。</li>
		<li>使用在线网络工具 CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）设计向导 RNA31粘贴1.1.2中的100 bp输入序列。选择特异性评分高、效率评分高且脱靶活性低的两条向导RNA。此外，优先选择Doench评分较高的RNA向导，避免标注为“Inefficient”的序列。32. 
		注意：其他CRISPR设计工具同样具有重要价值且可公开获取，例如Benchling CRISPR设计工具（https://benchling.com/crispr）。为提高CRISPR/Cas9介导的基因敲入突变细胞的频率，应尽可能选择两个靠近目标插入位点的向导RNA33.</li>
		<li>对于 mRosa26 位点，使用两个相邻的引导RNA，分别命名为mR26-sg1（5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3'）和mR26-sg2（5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3'）（图1A）。对于 hROSA26 位点，使用两个相邻的引导RNA，即hR26-sg1（5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3'）和hR26-sg2（5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3'）（图1B). 
		注意：mR26-sg1 和 mR26-sg2 的基因组编辑活性分别在 RAW264.7 细胞中进行评估，而 hR26-sg1 和 hR26-sg2 的活性则分别在 Jurkat 细胞中进行评估（参见 补充文件, 图 S1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>克隆含有靶向sgRNA的CRISPR表达载体 Rosa26 位点
	<ol>
		<li>合成一条向导RNA的正向与反向寡核苷酸（参见 补充文件). 
		注意：建议在向导序列的起始位置添加一个“G”核苷酸，这有助于由U6启动子驱动的表达。例如，要克隆上述mR26-sg1，正向寡核苷酸序列为CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT，反向寡核苷酸为AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC正向引物中的额外 G 及其在反向引物中的互补碱基以粗体标出。</li>
		<li>将对应于向导RNA的合成寡核苷酸克隆到我们先前工作中构建的多功能CRISPR表达载体pX458-DsRed2中21 (图1C) 使用张锋实验室开发的gRNA克隆通用方案（https://www.addgene.org/crispr/zhang/）；但跳过胶回收步骤，使用PCR纯化试剂盒纯化酶切后的载体（参见&#160;材料表). 
		&#8203;注意：在以往的实验方案中，需对经 BbsI 消化后的载体进行凝胶纯化；然而，该步骤耗时较长。在本方案中，消化产物直接使用 PCR 纯化试剂盒进行纯化，并用于后续连接反应，通常可获得与传统方法相当的阳性克隆效率。</li>
		<li>将10 µL连接产物（步骤1.2.2）转化至50 µL大肠杆菌 根据制造商说明，使用DH5α感受态细胞。从含氨苄青霉素（100 µg/mL）的LB琼脂平板上随机挑取三个菌落，分别接种于3 mL含氨苄青霉素的LB培养基中，过夜培养。</li>
		<li>使用1 mL过夜培养的细菌菌液进行Sanger测序，其余菌液保存于4 °C，直至确认构建正确：pDsR-mR26-sg1和pDsR-mR26-sg2 mRosa26 基因座敲入，以及 pDsR-hR26-sg1 和 pDsR-hR26-sg2 用于 hROSA26 位点</li>
		<li>使用质粒大量提取试剂盒制备高浓度质粒DNA（约2 µg/µL），用于转染级质粒的纯化（参见 材料表).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 作为同源重组模板的靶向载体的设计与构建
<ol>
	<li>设计同源定向修复模板
	<ol>
		<li>设计一个靶向载体，利用先前研究中优化的表达盒组成型表达目的蛋白（POI）29，该表达盒包含CAG杂合启动子、一个可用于克隆POI cDNA的AscI限制性酶切位点、一个IRES-EBFP2报告基因，以及牛生长激素多聚腺苷酸化（bGH-polyA）信号（图1B 和 补充文件）。</li>
		<li>设计与小鼠mRosa26或人hROSA26基因座基因组序列具有同源性的同源臂（HAs）。在表达盒左侧插入约1 kb的5'同源臂，对应于目标插入位点上游的基因组序列；同样，在表达盒右侧插入约1 kb的3'同源臂，对应于插入位点下游的基因组序列。 
		注意：表达盒应尽可能靠近CRISPR/Cas9切割位点插入34。为避免CRISPR/Cas9对已靶向等位基因的重复切割，需在靶向载体的原间隔序列邻近基序（PAM）序列（5'-NGG-3'）中引入核苷酸突变34,35。</li>
		<li>为实现靶向载体的线性化，在5'同源臂的上游紧邻处插入一个独特的EcoRI位点，在3'同源臂的下游紧邻处插入一个独特的BamHI位点。</li>
		<li>委托商业公司合成靶向载体，并分别命名为用于mRosa26和hROSA26基因敲入的pKR26-iBFP和pKhR26-iBFP。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>构建作为同源定向修复模板的靶向载体
	<ol>
		<li>为表达目的蛋白（POI），从Ensembl基因组浏览器获取cDNA序列（编码序列），并选择编码最长蛋白序列的转录本。例如，人ACE2基因的cDNA为ACE2-202 ENST00000427411.2，人RASGRP1基因的cDNA为RASGRP1 ENSG00000172575。</li>
		<li>通过商业公司合成POI的cDNA，也可通过PCR扩增进行克隆（本文未描述）。在cDNA的ATG起始密码子前立即放置序列GGCGCGCCACC（5' - 3'），该序列包含一个AscI限制性酶切位点（斜体加粗）和Kozak共有序列翻译起始位点（下划线），并在cDNA的终止密码子后添加另一个AscI限制性酶切位点（5'- GGCGCGCC -3'）。</li>
		<li>使用AscI对合成的序列进行酶切，并按照制造商说明，使用专为限制性酶切后DNA片段纯化设计的PCR纯化试剂盒进行纯化（见材料表）。</li>
		<li>按照制造商说明，使用T4 DNA连接酶将纯化的cDNA插入片段连接至经AscI线性化的骨架载体pKR26-iBFP或pKhR26-iBFP中。</li>
		<li>通过测序验证最终的靶向载体pKR26-POI-iBFP或pKhR26-POI-iBFP。按照制造商方案，使用质粒大提试剂盒（maxiprep）纯化验证后的构建体。</li>
		<li>使用EcoRI或BamHI酶切靶向载体，并按照制造商说明使用PCR纯化试剂盒纯化酶切产物。将线性化的靶向载体（约0.8 µg/µL）保存于-20 °C，直至进行电穿孔。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 巨噬细胞和T细胞系的电穿孔
<ol>
	<li>为电穿孔准备细胞培养
	<ol>
		<li>制备含10%胎牛血清（FBS）的罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）1640培养基，作为Jurkat T细胞的完全生长培养基。制备含10% FBS的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），用于RAW264.7巨噬细胞的培养。除用于转染后分选前孵育的培养基外，所有完全生长培养基均需添加100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（Pen/Strep）。</li>
		<li>根据供应商说明对RAW264.7和Jurkat T细胞进行传代培养（参见材料表）。传代RAW264.7细胞时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液使细胞脱落。使用含10%（v/v）DMSO的FBS作为RAW264.7和Jurkat细胞的冷冻保存培养基。</li>
		<li>以250 × g离心5分钟收集RAW264.7巨噬细胞，或以90 × g离心8分钟收集Jurkat T细胞。随后用5–10 mL不含Ca2+或Mg2+离子的1× DPBS洗涤细胞。弃去DPBS。</li>
		<li>用2 mL 1× DPBS重悬细胞沉淀。取10 µL细胞悬液，与等体积0.2%台盼蓝混合，以估算细胞数量和存活率。 
		注意：确保转染当天细胞培养的存活率&#62;90%。</li>
		<li>对于单次基因敲入实验，使用10 µL核转染尖端进行五次重复电穿孔。计算2.0 × 106个细胞所需的体积，并通过离心收集细胞。再次用1× DPBS洗涤细胞沉淀，操作同步骤3.1.3。 
		注意：使用10 µL核转染尖端时，每次电穿孔需4.0 × 105个细胞。因此，单次基因敲入实验至少需准备2.0 × 106个细胞。</li>
		<li>在24孔板中每孔加入0.5 mL不含Pen/Strep的完全生长培养基（按步骤3.1.1制备），并将培养板预置于37 °C培养箱中预热。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CRISPR/Cas9组分与靶向载体的电穿孔
	<ol>
		<li>开启电穿孔系统。采用先前研究中优化的电穿孔参数21：RAW264.7巨噬细胞为1,400 V/20 ms/2次脉冲，Jurkat T细胞为1,350 V/20 ms/2次脉冲。</li>
		<li>考虑到移液过程中的样品损失，在无菌1.5 mL微量离心管中配制55 µL电穿孔混合液，其中包含每种CRISPR/Cas9载体2.5 µg、线性化靶向载体2.4 µg以及重悬缓冲液R。 
		注意：为节省时间，可在离心过程中（步骤3.1.5）同时配制电穿孔混合液。</li>
		<li>将步骤3.1.5制备的2.0 × 106个细胞重悬于步骤3.2.2配制的55 µL电穿孔混合液中。</li>
		<li>使用移液器和10 µL核转染尖端吸取步骤3.2.3中的细胞/电穿孔混合液。 
		注意：移液过程中应避免引入气泡，以免导致电穿孔失败。</li>
		<li>将样品加入含有3 mL电穿孔试剂盒缓冲液E的离心管中。</li>
		<li>按照步骤3.2.1所述，对两种细胞类型分别施加相应的电穿孔参数。</li>
		<li>将样品转移至步骤3.1.6中已预热培养基的24孔板的一个孔中。</li>
		<li>对另外四次重复实验，以及仅含靶向载体和仅含CRISPR表达载体的对照组，重复步骤3.2.4–3.2.7。 
		注意：更换不同细胞类型或质粒DNA时，需更换核转染尖端和离心管。</li>
		<li>将转染后的细胞培养48–72小时，以使细胞在电穿孔后恢复，并在流式细胞术分析或荧光激活细胞分选（FACS）前表达CRISPR/Cas9组分。转染后24小时，使用配备红色通道的荧光显微镜观察DsRed2的表达情况。 
		注意：监测DsRed2荧光细胞的优势在于可评估电穿孔效率，并预测是否适合进一步的细胞分选。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 细胞分选以分离假定的基因敲入细胞
<ol>
	<li>在进行FACS分选前，用完全培养基将转染的细胞洗涤一次。按照步骤3.1.3所述，通过离心收集细胞，然后将细胞沉淀重悬于500 µL新鲜培养基中。</li>
	<li>在生物安全柜内设置细胞分选仪，配备85 µm喷嘴并调节至低流速。选择 &#34;单细胞&#34; 通过将20-30个细胞分选至96孔微孔板盖上，测试分选模式下的单细胞分选效率与精确度。每个孔中央出现一个液滴表明仪器设置正确。</li>
	<li>将步骤4.1中的细胞悬液转移至无菌FACS管中，并加入SYTOX Red死细胞染料，使其终浓度为1 nM。</li>
	<li>在流式细胞分选仪上分析样品。SYTOX Red 和 EBFP2 由 405 nm 激光激发，分别通过 V450/BV421 和 APC 通道检测。DsRed2 由 488 nm 激光激发，通过 PE 通道检测。使用未转染的细胞以及仅表达 EBFP2 或 DsRed2 的单阳性细胞作为光谱补偿对照。</li>
	<li>将10个单细胞分选至每孔含有150 µL预热完全培养基的96孔微孔板的各孔中。培养悬浮细胞系（如Jurkat T细胞）时使用圆底微孔板，培养贴壁细胞RAW264.7巨噬细胞时使用平底微孔板。 
	&#8203;注意：每孔分选10个细胞是一种优化策略，可提高细胞存活率，并减少需要铺板的96孔微孔板数量以及需要通过流式细胞术和基因分型筛选的样本数量；若每孔仅分选一个细胞，则需铺更多微孔板，以增加获得正确编辑细胞的几率。</li>
</ol>
5. 阳性敲入细胞的筛选与验证
<ol>
	<li>通过流式细胞术筛选候选敲入细胞
	<ol>
		<li>将步骤 4.5 中的细胞孵育 10–15 天，每 3 天添加一次完全生长培养基，以补充因蒸发而损失的液体。对于 Jurkat T 细胞，将圆底 96 孔板中培养的细胞转移至平底板，以优化细胞增殖。</li>
		<li>将扩增后的分选细胞转移至 48 孔板进行进一步扩增。</li>
		<li>当细胞接近汇合时，取一半培养物通过流式细胞术检测 EBFP2 表达（图 3）。通常情况下，48 孔板中汇合生长后一半的培养物相当于 0.5–1.0 × 105 个细胞，足以用于一次流式细胞术样本分析。</li>
		<li>将剩余细胞转移至 24 孔板进行进一步增殖。</li>
		<li>保留 EBFP2 阳性细胞比例较高的候选细胞群体，用于后续基因分型实验。 
		注：由于每个 96 孔板的孔中分选了 10 个细胞，因此敲入细胞可能与不表达敲入基因的细胞共同生长。因此，通常需要进行额外一轮细胞分选，以将 EBFP2 阳性细胞与阴性细胞分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 PCR 和测序筛选候选敲入细胞
	<ol>
		<li>收集 2 × 105 个候选细胞，使用 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA（参见 材料表）。</li>
		<li>为验证同源定向修复（HDR）是否精确发生在 mRosa26 位点而非基因组其他随机位点，使用跨越两侧同源臂（HAs）的引物进行 PCR 扩增（图 4）。选择一个位于靶向载体外侧基因组区域的引物（外部引物）和一个位于靶向载体内部的引物（内部引物）。 
		注：类似的设计可用于验证 hROSA26 位点的 HDR。此外，也可轻松设计 PCR 引物以检测目的插入序列（POI）的整合情况。同时，可采用三引物 PCR 同时检测野生型和敲入等位基因的基因型（参见 补充文件，图 S2）。</li>
		<li>使用快速克隆试剂盒对阳性 PCR 产物进行克隆（参见 材料表），并将反应混合物转化至 DH5α 感受态细胞中。</li>
		<li>每轮转化随机挑选 8–10 个单菌落，对步骤 5.2.3 中的 PCR 产物进行 Sanger 测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过免疫印迹分析和亲和纯化验证阳性敲入细胞 
	注：候选细胞可进行免疫印迹分析以验证目的插入序列（POI）的整合，或进行亲和纯化（AP）用于蛋白质-蛋白质相互作用研究。
	<ol>
		<li>根据抗体生产商的说明进行免疫印迹分析。有关一抗和二抗的使用信息，请参见 材料表。</li>
		<li>使用 Strep-Tactin Sepharose 珠子，按照生产商说明对表达 OST 标签 POI 的敲入细胞裂解液进行亲和纯化（AP）（参见 材料表）。</li>
		<li>使用成像仪检测化学发光信号。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本实验中，我们以人源Jurkat T细胞和小鼠RAW264.7巨噬细胞为例，展示了如何从载体设计到基因敲入细胞的筛选与验证，完成免疫细胞中的敲入编辑。T细胞和巨噬细胞系均对转染具有抗性36,37；然而，通过结合荧光报告基因与细胞分选技术，可克服CRISPR/Cas9递送效率低的问题。本方案适用于基因功能挽救实验和蛋白质-蛋白质相互作用实验，但由于该方案是针对Rosa26位点的敲入修饰而开发的，因此不能用于研究调控性DNA序列（如转录因子结合位点）。
双荧光报告系统辅助 CRISPR/Cas9 基因敲入编辑 
我们成功应用了一种双荧光报告系统，在免疫细胞中瞬时表达独立的 CRISPR/Cas9 载体，此前的研究已证明该系统可实现大片段 DNA 的删除21。我们设计了一种以 DsRed2 荧光蛋白作为报告基因的 CRISPR/Cas9 靶向工具，并引入另一种光...

免疫细胞在抵御病原体方面至关重要。先天免疫和适应性免疫均参与清除感染物并维持组织稳态1,2细胞系模型是理解哺乳动物免疫系统分子基础的重要工具，被广泛应用于 体外 功能分析，例如模拟人类T细胞活化的实验，以及确定遗传因子在激活或抑制免疫反应中的功能3,4值得注意的是，哺乳动物的免疫系统具有极大的异质性，同样重要的是，大量分子调控着特定细胞类型的分化、迁移和功能5,6.
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9基因组编辑工具可实现对特定细胞类型的遗传操作，从而以精确的方式对基因进行功能注释7,8。已有多种已发表的实验方案描述了以Cas9-向导RNA复合物（即核糖核蛋白，RNP）形式将CRISPR/Cas9递送至HEK293细胞、Jurkat细胞系、原代T细胞9,10、巨噬细胞11,12,13、干细胞14以及其他细胞类型15,16。在这些方案中，基因标记通常通过将荧光标签与内源性蛋白融合来实现17,18。然而，目前较少尝试使用适用于单细胞分选的双荧光报告系统来促进基因敲入实验19,20，尤其是在免疫细胞中。 
为了深入理解一种新型遗传因子在免疫细胞中的功能，通常需要进行细胞类型特异性的基因敲除、遗传拯救实验，并理想地鉴定其相互作用分子。尽管已有文献报道了优化免疫细胞中基因敲除的方法9,15,21，但关于如何在免疫细胞中引入具有多种功能的基因敲入等位基因以研究免疫应答的方法仍鲜有报道。因此，本实验方案旨在详细描述一种高效且高度可重复的技术流程，用于在人和小鼠免疫细胞系中于安全港位点Rosa26表达目的蛋白（POI）。我们设计了一种双色报告系统，通过表达CRISPR/Cas9的质粒（DsRed2）和重组DNA模板（EBFP2）来富集转染细胞，并可通过细胞分选进行分离。按照本方案操作，我们成功获得了多个基因敲入细胞系，包括人T细胞系Jurkat和小鼠巨噬细胞系RAW264.7，可用于功能尚未充分研究的蛋白质的深入分析。
作为示例，本方案展示了如何获得稳定表达人源ACE2（SARS-Cov-2的受体）的敲入型RAW264.7巨噬细胞22。由于先天免疫细胞参与了新型冠状病毒病（Covid-19）的发病机制23,24，而人源ACE2被认为是病毒进入细胞并在细胞内复制所需的主要受体，因此携带人源ACE2基因敲入的巨噬细胞可作为研究病毒在巨噬细胞内增殖机制的有用工具。同时，我们还展示了在人源ROSA26基因座敲入基因以表达RASGRP1蛋白的示例，该蛋白在其氨基末端融合了亲和性Twin-Strep标签（OST）。T细胞是免疫治疗中的关键靶细胞，越来越多的研究聚焦于调控其对癌症的响应能力25,26。由于Rasgrp1已被证实是T细胞受体及其相互作用分子信号通路下游的关键信号分子，但其相互作用分子尚未被充分阐明27，因此OST-RASGRP1敲入模型为鉴定调控T细胞对肿瘤和感染反应的相互作用分子奠定了基础。综上所述，这些工具可用于新型冠状病毒病（Covid-19）相关研究以及发现与Rasgrp1相互作用的新分子。

<table><tbody><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>通用电气医疗</td><td></td><td>化学发光成像</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>MP Biomedicals</td><td>194526</td><td></td></tr><tr><td>抗兔 IgG，HRP 标记抗体</td><td>细胞信号传导技术</td><td>7074</td><td>在1/5000稀释度下</td></tr><tr><td>抗RasGRP1抗体，克隆10.1</td><td>默克</td><td>MABS146</td><td>1.0 &amp;mu;工作浓度的 g/mL</td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-肌动蛋白（D6A8）兔单克隆抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>8457</td><td>在1/1000稀释度下</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3539S</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer Mini 自动细胞计数仪</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E.coli &lt;/em&gt;DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>Takara</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>DMSO（二甲基亚砜）</td><td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>DPBS（10倍浓度），无钙，无镁</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>含高糖的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria&amp;trade; 融合</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td>配备生物安全柜</td></tr><tr><td>FACS Canto 流式细胞仪</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml 聚苯乙烯圆底试管</td><td>BD 生物科学</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 版本 10.7</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (D16H11) XP&amp;nbsp;兔单克隆抗体</td><td>细胞信号技术公司</td><td>5174</td><td>以1/1000稀释度</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，HRP</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>31430</td><td>在1/5000稀释度下</td></tr><tr><td>Immobilon ECL 超级 Western HRP 底物</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ PVDF 膜</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/</td></tr><tr><td>硫酸卡那霉素</td><td>MP Biomedicals</td><td>194531</td><td></td></tr><tr><td>LB 琼脂粉</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器（30-300 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf 或类似产品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon 转染系统，10 &amp;mu;L 型试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL 圆锥形无菌离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq&amp;reg; 热启动快速载入&amp;reg; 2X 试剂混合液</td><td>New England BioLabs</td><td>(M0489)</td><td>高GC%模板</td></tr><tr><td>PageRuler 预染蛋白标准品，10 至 180 kDa</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 0.1-20&amp;micro;l</td><td>Eppendorf 或类似产品</td><td>0030 075.005</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 2-200&amp;micro;l</td><td>Eppendorf 或类似产品</td><td>0030 075.021</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头 50-1000&amp;micro;l</td><td>Eppendorf 或类似产品</td><td>0030 075.064</td><td></td></tr><tr><td>质粒大提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>pX458-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>112219</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>从限制性消化中纯化质粒</td></tr><tr><td>Q5热启动高保真2X预混液</td><td>New England BioLabs</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>https://www.atcc.org/</td></tr><tr><td>重组抗ACE2抗体 [EPR4435(2)]</td><td>Abcam</td><td>ab108252</td><td>在1/1000稀释度下</td></tr><tr><td>RPMI 1640培养基</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin Sepharose 珠粒</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1201-010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX&amp;trade; 红色死细胞染料，适用于633或635 nm激发</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液，0.4%</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>含酚红的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ZOE 荧光细胞成像仪</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管，PCR 级洁净</td><td>Eppendorf 或类似产品</td><td>0030 125.215</td><td></td></tr><tr><td>24孔透明TC处理多孔板</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>96孔透明平底聚苯乙烯TC处理微孔板</td><td>康宁</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>96孔透明圆底TC处理微孔板</td><td>康宁</td><td>3799</td><td></td></tr></tbody></table>

通过crispr/cas9基因敲入及细胞分选在巨噬细胞和t细胞系中实现基因编辑

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

免疫系统的功能基因组学研究需要进行基因操作，包括删除靶基因以及向目标蛋白添加元件。在细胞系模型中鉴定基因功能对于基因发现和细胞内在机制的探索具有重要意义。然而，利用CRISPR/Cas9介导的基因敲入技术对T细胞和巨噬细胞系等免疫细胞进行遗传操作较为困难，主要原因是这些细胞的转染效率较低，尤其是在静息状态下。为了对免疫细胞进行基因修饰，通常需要使用药物抗性筛选和病毒载体来富集表达CRISPR/Cas9系统的细胞，但这不可避免地会对细胞造成非预期的干扰。在之前的研究中，我们设计了与CRISPR/Cas9偶联的双荧光报告系统，该系统在电穿孔后瞬时表达，这一技术方案可实现免疫细胞中基因的快速删除；然而，在T细胞和巨噬细胞等免疫细胞中实现无需药物抗性筛选或病毒载体的基因敲入则更具挑战性。本文中，我们证明，通过流式细胞分选辅助筛选瞬时表达靶向Rosa26位点的CRISPR/Cas9载体并同时导入供体质粒的细胞，可在T细胞和巨噬细胞中实现无需药物抗性富集的基因敲入。作为示例，我们展示了如何通过基因敲入实验在RAW264.7巨噬细胞中表达SARS-CoV-2（导致当前新冠大流行的病毒）的受体人源ACE2。此类基因敲入细胞可广泛应用于机制研究。

按照上述方案，在小鼠 RAW264.7 巨噬细胞中利用 mRosa26 位点进行基因敲入实验，我们设计了一种靶向载体以表达人源 ACE2——即 SARS-CoV-2 病毒的受体（图 2A）。采用类似的设计，我们构建了人源 Jurkat T 细胞，实现了 OST 标签标记的 RASGRP1 融合蛋白的基因敲入（图 2C）。在转染三个质粒后，其中两个用于表达 CRISPR/Cas9 系统（DsRed2；pDsR-mR26-sg1 和 pDsR-mR26-sg2 用于 mRosa26 位点敲入；pDsR-hR26-sg1 和 pDsR-hR26-sg2 用于 hROSA26 位点敲入），另一个作为同源重组的 DNA 模板（EBFP2），筛选出表达两种荧光报告基因的双阳性细胞，并将其分选至 96 孔板中。在以单细胞分选模式分选的 RAW264.7 细胞中，双阳性细胞（DsRed2+ EBFP2+）比例为 0.91%，但每个孔中收集...

本方案利用荧光报告基因和细胞分选技术，简化巨噬细胞和T细胞系中的基因敲入实验。这些简化的基因敲入实验使用两种质粒：一种是表达CRISPR/Cas9和DsRed2的质粒，另一种是表达EBFP2的同源重组供体质粒，后者可永久整合到免疫细胞的Rosa26位点。

通过CRISPR/Cas9基因敲入及细胞分选在巨噬细胞和T细胞系中实现基因编辑

免疫系统功能基因组学研究需要进行基因操作，包括靶基因的敲除和外源元件的添加……

本实验方案的目的是借助荧光报告基因并结合细胞分选技术，简化在巨噬细胞和T细胞系中进行CRISPR/Cas9介导的基因敲入实验。ROSA26位点是公认的基因组安全港位点，常用于外源基因的插入。通常可在小鼠ROSA26位点或其人类同源位点中，表达目标蛋白，无论是否带有标签。第1部分：靶向Rosa26位点的sgRNA设计与质粒构建。首先，利用小鼠基因组信息学（Mouse Genome Informatics）和Ensemble基因组浏览器中的序列，从小鼠Rosa26位点设计sgRNA，然后下载小鼠Rosa26基因的基因组序列。访问在线工具CRISPOR，将来自Rosa26位点的100个碱基对的输入序列粘贴至该工具中。然后选择一个基因组，例如 Mus musculus-小鼠参考基因组2011。接下来选择PAM类型。使用20 bp NGG"PAM序列，该序列为spCas9所识别。单击提交。选择特异性评分高、切割效率评分高且脱靶目标较少的向导RNA。应避免使用标注为效率低下的向导RNA。值得注意的是，优选选择两个具有重叠序列的向导RNA，据报道称这可能会提高敲入效率。对于温暖餐序列，合成一条正向非法引物和一条反向非法引物，经退火磷酸化后即可用于克隆至载体。通过BbsI一位点消化制备线性化的载体，该载体能够表达报告基因；将退火后的引物连接至线性化载体，以构建最终的表达载体，该载体可同时表达向导RNA和与DSRIP二荧光报告基因连接的Cas9核酸酶。第二部分：作为同源重组模板的靶向载体构建。用于表达目的蛋白。例如，人类寿命延长。可从商业来源合成cDNA序列，并将亲和OST标签或其他常用于蛋白质纯化的标签与cDNA序列融合。请注意在cDNA起始密码子前包含Kozak共有序列。使用AscI限制性内切酶进行消化，并将获得的cDNA插入片段连接至载体骨架中。载体即pKhR26-IBFP IBP，其最终靶向构建物包含容器序列，以及分别位于五端和三端的同源臂。表达盒包含一个CG启动子、UST增强子、Koonin区域，该区域连接一个Iris荧光报告基因和一段poly A信号序列。最后，通过使用EcoR1或BamH1等特异性限制性内切酶对靶向载体进行消化，将消化产物纯化后保存于-20 °C，用于后续电穿孔实验。建议获得高浓度的线性化载体 DNA。第三部分：巨噬细胞和 T 细胞系的电穿孔，按照分离吉立塔克细胞的步骤进行细胞培养。转染时的最佳细胞密度约为每毫升 0.5 × 10⁶ 个细胞。完整电穿孔操作采用十种宏观微核式尖端规格，准备一个24孔板，每孔加入500微升不含抗生素的完全生长培养基。将培养板置于加湿的37摄氏度、5% CO₂培养箱中预热。调低电转系统输入，设置适用于JetCAt或Rosales的电穿孔参数。准备细胞DNA混合物的后续操作或收集鸡细胞。将Curchin 25平方厘米培养瓶中的细胞转移至15个动物培养瓶中。随后，将细胞通过离心在室温下以90 × g离心8分钟，弃去上清液。洗涤时，用5 mL PBS重悬细胞，然后在与前一步相同的条件下通过离心旋转细胞悬液。弃去DPPs，并用2 mL DBS重悬细胞沉淀。将微小的细胞悬液与等体积的0.2% Trepan Ballou混合，以估算细胞数量，将样品加载到计数槽中，插入Connie载玻片，放入自动细胞计数仪中自行观察图像，然后获得细胞计数结果。计算出200万细胞用于每次电穿孔实验，在敲除实验中将细胞数量转移至1.5 mL离心管中。通过离心形成细胞沉淀，离心收集细胞。为节省时间，可在离心过程中配制电穿孔混合液：在新的1.5 mL离心管中加入2.5 µg的CRISPR Cas9载体、2.4 µg的Belinda rice、报告载体以及重悬缓冲液，总体积为55 µL，轻轻涡旋混匀，并短暂静置以充分混合。使用前将Luxor压力混合物置于室温。离心天冬氨酸后，DTB在此基础上再融合30秒，尽可能去除上清液，通过加入制备好的电穿孔混合物，用移液器轻轻吹打重悬细胞。进行电穿孔时，使用10微升微量核转杯尖端的移液器吸取细胞电穿孔混合物至关重要。移液时避免产生气泡，否则会导致电镀失败。按下启动按钮，随后操作将很快转移样品。将24孔板中的细胞加入预热的完全培养基，对剩余的四个重复样品执行与上述相同的电穿孔压力和操作步骤，轻轻摇动培养板以确保细胞均匀分布。将细胞置于37°C培养箱中孵育48至72小时。在进行细胞分选前，转染后24小时，使用荧光显微镜观察Disrupt2报告基因的表达情况，若观察到报告基因呈脱离状态，则表明电穿孔操作已成功进行。第4部分：通过细胞分选分离潜在的基因敲入细胞。在进行细胞分选前，准备96孔板，每孔加入150 µL 细胞类型特异性的完全培养基，使用圆底微量孔板用于后续培养，使用平底微量孔板用于所有细胞的转移。将细胞转入无菌FACS管中，保持管子置于冰上，并将样本盒通过传递窗送入细胞分选室。如适用，设置细胞分选仪使用85 µm喷嘴和低流速模式进行免疫细胞分选，以获得最佳的细胞可评估性和存活率。从传递窗处短暂取样，然后将样本加载至采集室中。设置细胞分选参数：首先根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）定义细胞门控，随后通过设定阈值圈选活细胞，排除死细胞和碎片。接下来，通过使用FSC-H与FSC-A的单细胞门控（单细胞分选）在多参数区段中寻找活的单个细胞。最后，针对目标DSR2和B设置门控，以筛选Volvo阳性亚群，该亚群代表已成功共转染CRISPR载体和包装载体的细胞。分选后，采用预热的完全培养基，通过周期模式或单细胞模式，将每孔10个单细胞接种至96孔板的每个孔中，并将96孔板置于细胞培养孵箱中孵育，以进行细胞扩增。第五部分：阳性敲入细胞的筛选 
在细胞存活后经过约两周的扩增，从48孔板中取少量细胞，以野生型细胞作为阴性对照群体，通过检测BFP表达或流式细胞术评估细胞中BFP阳性细胞的比例。保留BFP阳性细胞比例较高的孔继续进行验证。提取这些细胞的基因组DNA，使用跨越同源臂两侧的引物通过PCR扩增。其中一条引物位于靶向载体外侧的基因组序列中，另一条引物位于载体序列内。在本实验中，使用该引物组合扩增出的PCR产物预期大小为1.2 kb；使用F2和R2引物扩增得到的产物为1.2 kb。Sanger测序结果显示，PCR产物包含每个整合位点的连接序列，证实了基因正确敲入Rosa26位点。例如，免疫印迹可用于在蛋白质水平上验证基因敲除是否成功，这是第六部分的代表性结果。如先前发表的研究所示，我们表达了带有OSD标签的GET45分子，并在使用USD标记的T细胞中检测到26个位点。GET45及其相互作用蛋白通过亲和纯化富集后，进行质谱分析。蛋白质组学数据揭示了T细胞之间的相互作用。因此，该产物库极大地促进了寻找新型嵌入剂以阐明特定蛋白质功能的研究。本技术展示表明，通过瞬时表达，在每条RFP过表达的细胞系中，与表达载体共表达BFP，并靶向Rosa 26位点。我们构建了在T细胞和巨噬细胞中均能实现稳定基因表达的基因敲入细胞系，而这类操作在遗传学操控中通常难以实现。本方法及相关建议适用于CRISPR技术介导的大片段DNA插入，可用于免疫细胞的机制研究，例如蛋白质鉴定、蛋白质相互作用分析等。

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用于微小RNA簇网络分析的CRISPR基因编辑工具

本方案描述了利用组装的Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物对小鼠骨髓来源巨噬细胞进行基因组编辑的操作步骤 体外...

利用电穿孔递送Cas9-sgRNA复合物在原代骨髓来源巨噬细胞中实现高效基因敲除

随着CRISPR相关技术方案变得越来越实用且易于获取，在特定实验条件下仍可能出现复杂情况和障碍。本方案概述了利用CRISPR/Cas9技术构建受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1/RIP1）基因敲除人源细胞系的步骤，并重点指出了在此过程中可能遇到的潜在挑战。...

使用 CRISPR-Cas9 系统生成 RIP1 敲除 U937 细胞系

THP-1细胞系被广泛用作研究人类单核细胞/巨噬细胞在各个生物学相关研究领域中功能的模型。本文介绍了一种高效的基于CRISPR-Cas9的基因编辑和单细胞克隆分离方案，可实现稳定且可重复的表型数据的获取。...

基于电穿孔的CRISPR-Cas9介导的THP-1细胞基因敲除及单细胞克隆分离

了解CRISPR/Cas9介导的基因敲入技术，利用荧光报告基因和细胞分选在巨噬细胞和T细胞系中实现高效基因插入。该方法无需药物筛选或病毒载体，适用于免疫学功能基因组学研究。

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