Name: 循环肿瘤细胞系:基础和转化研究的创新工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解循环肿瘤细胞系的建立方法，通过3D培养扩增结直肠癌患者CTC，用于药物筛选和体内转移实验。该技术为基础与转化研究提供创新工具，助力个性化医疗发展。

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Pannequin 实验室的这项研究项目得到了 SIRIC 研究基金的资助：项目编号 « INCa-DGOS-Inserm 6045 »。Guillaume Belthier 和 Zeinab Homayed 的博士论文研究得到了抗癌联盟/法国抗癌协会（Ligue contre le Cancer）的支持。Céline Bouclier 的薪金由&#34;奥克西塔尼大区（region Occitanie）&#34;资助。感谢 Julian Venables 对本文英文的编辑工作。

所有体内实验方案均经动物伦理机构批准。
1. 循环肿瘤细胞在三维培养条件下的扩增
<ol>
	<li>为了在悬浮条件下培养CTC，首先将CTC以每微升最多5个细胞的浓度接种至超低吸附（ULA）24孔板的孔中&#181;L 并加入 1 mL M12 培养基（即添加了 2 的改良型 DMEM-F12）&#8197;毫摩尔 L-谷氨酰胺，100&#8197;单位/毫升青霉素和链霉素，N2 添加剂，20&#8197;ng/mL 表皮生长因子和 10&#8197;ng/mL 成纤维细胞生长因子10).</li>
	<li>为促进细胞成球及扩增，将细胞置于低氧条件（2% O₂）下培养26至10天之间</li>
	<li>当肿瘤球足够大时（100 μm），将其转移至含10% FBS的DMEM/F12培养基中，并接种于经多聚-L-鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养板上，以促进贴壁生长。 &#181;m），以防止坏死，将其解离以进行扩增。
	<ol>
		<li>将细胞悬液置于2 mL或15 mL离心管中，于300 x g离心5分钟。</li>
		<li>移去上清液，加入 500 &#181;加入 L 温和解离试剂（例如 Accumax）至沉淀中。</li>
		<li>轻轻涡旋，并在37℃下用温和解离试剂孵育细胞悬液20至30分钟 &#176;C. 
		注意：在温和解离试剂（Accumax）中孵育时间过长可能导致细胞死亡异常增加。</li>
		<li>加入 1.5 mL 磷酸盐缓冲液（PBS），以 300 × g 离心 5 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将沉淀重悬于新鲜M12培养基中，调整细胞密度至每微升1-5个细胞。 &#181;L.</li>
		<li>将细胞悬液接种至超低吸附培养板的新孔中：T75 培养瓶接种 10 mL，6 孔板每孔接种 2 mL，100 μL &#181;96孔板的L</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 循环肿瘤细胞球体切片的免疫荧光（IF）染色
<ol>
	<li>将CTC球体在300 × g条件下离心5分钟至15 mL离心管中，吸除上清液，并用PBS洗涤沉淀两次。</li>
	<li>用500 µL的4%多聚甲醛（PFA）重悬沉淀，在冰上孵育20分钟。以300 × g离心悬浮液，并用5 mL PBS洗涤两次。</li>
	<li>用（即15至20 µL）热且呈液态的Histogel重悬沉淀。使用移液器吸取全部悬浮液，在4 °C预冷的表面上形成液滴，并使其聚合5至10分钟。 
	注意：操作需迅速，以避免悬浮液在移液尖端内发生聚合。</li>
	<li>用解剖刀刀片将固化的液滴剥离，并将其置入分隔的包埋盒中。</li>
	<li>进行以下步骤：石蜡包埋、石蜡切片、切片再水化、抗原修复及抗体孵育。这些步骤与任何包埋于石蜡中并用于免疫荧光染色的肿瘤或器官组织处理方法相同12。 
	注意：包埋盒可在4 °C条件下保存于70%乙醇中，直至进行石蜡包埋。</li>
</ol>
3. 流式细胞分析
<ol>
	<li>将CTC细胞球在15 mL离心管中以300 × g离心5分钟，并用PBS洗涤沉淀两次。</li>
	<li>吸除上清液，向沉淀中加入500 µL温和解离试剂。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀，将细胞悬液在37 °C下用温和解离试剂孵育20至30分钟。 
	注意：在温和解离试剂（Accumax）中孵育时间超过40分钟可能导致细胞死亡异常增加。</li>
	<li>以300 × g离心细胞悬液5分钟，弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL封闭缓冲液（即含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS）中。</li>
	<li>将细胞悬液通过40 µm细胞筛，以去除残留的细胞球。</li>
	<li>计数后，将200,000个细胞分装至三个荧光激活细胞分选（FACS）管中，以300 × g离心5分钟并去除上清液。其中一管作为对照，不添加任何染色试剂。</li>
	<li>根据说明书，向其余两个FACS管中分别加入相应的抗体（即一个针对目标蛋白的偶联抗体，一个偶联的同型对照抗体）。</li>
	<li>按照推荐的孵育时间结束后，每管加入300 µL封闭缓冲液洗涤细胞，以300 × g离心3个FACS管并吸除上清液。重复此步骤两次。然后，除未染色的FACS对照管外，其余管将沉淀用含细胞活性染色试剂的封闭缓冲液重悬。</li>
	<li>将FACS管置于冰上直至进行FACS分析。首先使用未染色的FACS管确定细胞活性和抗体染色的设门范围。然后分析含有针对目标蛋白偶联抗体的FACS管，以定量表达目标蛋白的CTC百分比。含有偶联同型对照抗体的FACS管不应出现信号偏移，以此确认信号偏移特异性地来源于目标蛋白。 
	&#8203;注意：如有可能，使用高表达目标蛋白的细胞系作为阳性对照，不表达该蛋白的细胞系作为阴性对照。</li>
</ol>
4. 发光法细胞活力检测（CellTiter-Glo）
<ol>
	<li>将已解离的循环肿瘤细胞（CTC）（如第1.4.5节所述）重悬于M12培养基中。计数细胞，并将细胞浓度调整至200,000个细胞/mL。</li>
	<li>在ULA 96孔板中，每孔接种10,000个解离的CTC，体积为50 µL，并将培养板置于低氧环境（2% O2）中孵育24小时。</li>
	<li>次日，向CTC中加入50 µL待测药物。建议预先进行药物浓度梯度实验，以确定半最大抑制浓度（IC50）。部分孔仅加入溶剂作为对照，以测定基础细胞活力。 
	注：由于不同CTC细胞系的倍增时间不同，接种的细胞数量可能有所差异。此外，应设置三复孔以减少实验结果的变异性。</li>
	<li>继续将培养板置于低氧环境中孵育48小时。</li>
	<li>第3天，将培养板以及发光法细胞活力检测试剂缓冲液和底物置于室温，并根据生产商说明书，用适当体积的缓冲液溶解底物。</li>
	<li>向每个培养孔中加入70 µL发光活力检测混合液。将培养板置于轨道摇床上震荡20分钟以促进细胞裂解，然后将100 µL混合液转移至适用于发光仪检测的不透光多孔板中。</li>
	<li>将板在室温下静置，并用铝箔纸覆盖，以稳定发光信号。 
	&#8203;注：发光信号在3小时内保持稳定。</li>
	<li>使用酶标仪（例如Tecan Infinite 200 Pro）记录发光值。</li>
	<li>数据分析时，计算每种条件下三复孔的相对光单位（RLU）平均值。计算各药物浓度下的细胞活力百分比：（处理组RLU / 未处理组RLU）× 100。</li>
</ol>
5. 皮下注射
<ol>
	<li>在微量离心管中，将细胞重悬于 100 µL 无菌 PBS 中。如果注射的细胞数量较少，可将细胞重悬于 1:1 的 PBS/基质胶（Matrigel）混合液中（该基质胶为低生长因子版本），以使细胞聚集并促进肿瘤启动。 
	注意：根据科学问题和实验目的，细胞密度可从 10 个细胞（用于检测肿瘤启动能力）至 100 万个细胞不等。</li>
	<li>用胰岛素注射器吸取全部液体体积。</li>
	<li>在免疫缺陷小鼠的侧 flank 部位，用食指和无名指轻轻捏起皮肤，并在皮肤基部缓慢插入针头。 
	注意：该操作不会引起疼痛，可在清醒小鼠上进行。</li>
	<li>在同一位置缓慢注射全部体积，以防止细胞扩散。这将在皮下形成一个小的隆起（bleb）。</li>
	<li>对注射部位施加轻柔压力，以防止液体回流。</li>
	<li>每隔一天使用游标卡尺监测肿瘤生长情况。</li>
	<li>若肿瘤体积超过 1500 mm3，应实施安乐死。根据设备条件，可通过吸入二氧化碳或麻醉气体，或通过颈椎脱位法处死小鼠。</li>
</ol>
6. 脾内注射
<ol>
	<li>开始前，将手术器械（剪刀和镊子）在124 ℃下高压灭菌 &#176;在 15 分钟内将温度设为 C，并用 70% 乙醇清洁工作空间的所有表面。</li>
	<li>在微量离心管中，将细胞重悬于 50 &#181;L 的无菌 PBS 中，并置于冰上保存。细胞密度范围为 0.5 至 1 × 10⁶ 个细胞。细胞数量过多可能导致血液中形成凝块。</li>
	<li>在注射细胞之前，先注射100 &#181;0.015 mg/mL 剂量的布托啡诺，每升腹腔注射，用于镇痛。</li>
	<li>将小鼠放入诱导室中，以3%异氟烷维持2-3分钟。当动物对运动刺激不再有反应时，将其置于加热垫上右侧卧位，并通过面罩呼吸回路持续给予含O₂的混合气体以维持麻醉状态。2 和异氟烷。</li>
	<li>手术期间在每只眼睛上涂抹眼用润滑剂，以防止眼睛干燥。用消毒剂对胸部区域进行消毒&#160;聚维酮碘溶液（即 Betadine）。</li>
	<li>在背腹侧，使用剪刀于第10对假肋下方做一长度为0.5 cm的切口。</li>
	<li>轻轻提起脾脏并将其置于无菌纱布上。使用胰岛素注射器，注入 50 &#181;在脾脏尖端注射 CTCs 时，保持注射器垂直，等待 3–5 分钟以避免回流，然后拔出针头。</li>
	<li>从两侧结扎脾脏的血管（动脉和静脉），并在两道结扎线之上直接剪切以切除脾脏。切除脾脏可防止该器官内发生意外的肿瘤形成。</li>
	<li>使用5.0号可降解无菌缝线缝合腹膜，然后缝合皮肤。</li>
	<li>在小鼠完全从麻醉中恢复之前，保持其体温。</li>
	<li>每周监测小鼠三次，观察其身体功能是否异常、运动和姿势是否异常，以及体重是否下降。</li>
	<li>当达到人道终点时（手术后约6周）处死动物，以分析肝转移。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

上述方案最初用于结直肠癌循环肿瘤细胞的功能表征，但也可用于其他类型的癌症（如乳腺癌），并可适用于小鼠模型。
真正的限制因素是血液样本中循环肿瘤细胞（CTC）的数量以及用于分离和扩增这些细胞的技术效率。已有多种基于CTC特定特性的分离技术被报道，例如Parsortix，这是一种微流控装置，可根据细胞大小及其可压缩性实现CTC的分离13。此外，还有CellSearch，这是一种基于免疫磁珠的检测方法，也是目前唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于计数血液样本中CTC的方法，其原理是通过CD45阴性标记去除污染的淋巴细胞，并结合EpCAM及细胞角蛋白8/18/19等上皮标志物的阳性标记来识别CTC14。iChip是另一种基于细胞大小的技术，但它同时结合了EpCAM阳性富集或CD45阴性去除策略来进行CTC富集15,16。最近，我们还使用了一种快速简便的免疫密度分离方法—...

尽管近年来在癌症早期诊断和治疗策略方面取得了进展，但超过百分之九十的癌症发病仍归因于转移1。转移过程是一个多步骤级联事件，始于肿瘤细胞从原发灶局部脱落并进入血液，在血液中形成循环肿瘤细胞（CTCs），最终定植于远处器官，例如结直肠癌（CRC）常转移至肝脏和肺部2。近年来，液体活检受到越来越多关注，它是一种非侵入性工具，可用于从患者血液样本中有效检测和计数CTCs。肿瘤内遗传异质性是导致药物耐药的主要原因；因此，从肿瘤组织中分离出具有代表性的细胞，已成为实现个体化医疗的一项有前景的技术手段3。
尽管循环肿瘤细胞（CTCs）在血液中出现频率较低（每106 - 107 白细胞4基于循环肿瘤细胞（CTCs）与血液其他成分之间的特性差异，已开发出多种检测与分离技术5患者血液样本中CTCs的数量本身即可提供有关恶性肿瘤分期、治疗反应及疾病进展的信息6,7因此，CTC 分离是转化研究中评估遗传异质性或进行药物筛选的关键工具，同时也是基础研究中表征这些侵袭性细胞的重要手段，因为它们是介导转移发生的关键效应细胞8,9事实上，与经过长期培养已积累数千个突变的商业化癌细胞系相比，新鲜的循环肿瘤细胞（CTCs）保留了原始原发性肿瘤的主要特征，包括强大的转移能力，因而更能真实反映疾病状态。这些特性使CTCs成为基础研究的有力工具，尤其适用于针对预测在转移过程中起关键作用因子的基因敲除实验。这些实验的结果可被验证 体内，对小鼠进行操作，具体步骤如下。
一旦分离出循环肿瘤细胞（CTCs），可在非黏附培养条件下进行扩增，随后可像其他现有的癌细胞系一样对其进行操作，即根据具体科学问题，可将其在黏附条件下培养或包埋于Matrigel中10。例如，为检测目的蛋白的表达与定位，可将CTC细胞球在悬浮条件下培养，并包埋于Histogel中，以对细胞球切片进行免疫荧光分析。此外，若该蛋白定位于细胞膜，还可通过流式细胞术检测其在活细胞中的表达水平。
在功能研究中，为了验证某种可能在肝脏定植中发挥作用的靶蛋白的功能，可将通过shRNA或CRISPR/Cas9技术进行基因编辑的循环肿瘤细胞（CTC）注射到免疫缺陷小鼠的脾脏中。该实验是一种模拟肝脏转移定植的有力模型11。
通过将极少量细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，可以评估循环肿瘤细胞（CTCs）启动肿瘤的能力。由于肿瘤启动能力是癌症干细胞（CSCs）的标志性特征，该实验可指示CTC细胞系中CSC所占的百分比。这种干细胞表型使得循环肿瘤细胞系对某些标准癌症疗法具有耐药性。因此，扩增后的CTCs可用于药物筛选，并为患者确定最有可能有效的治疗方案；例如，可通过体外发光活力检测来测试CTCs对治疗的反应。
从长远来看，对新鲜分离并扩增的循环肿瘤细胞（CTCs）进行药物筛选，有望成为一种个性化医疗的新工具，有助于为患者选择最有效且最合适的治疗方案。
本文详细介绍了循环肿瘤细胞（CTC）系的培养方案、通过免疫染色和流式细胞术对特定蛋白进行染色的方法、CTC的细胞毒性检测以及体内异种移植实验的操作步骤。

<table><tbody><tr><td>Accumax 溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 发光细胞活力检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24 孔透明平底超低吸附多孔板</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Histiogel 标本包埋介质</td><td>LabStorage</td><td>HG-4000</td><td></td></tr><tr><td>人 EGF，优质级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>人 FGF-2，优质级</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-564</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>N-2 补充剂</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（5,000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr></tbody></table>

循环肿瘤细胞系：基础与转化研究的创新工具

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

转移是导致癌症死亡的主要原因。尽管治疗策略不断改进，转移性癌症的预后仍然较差。因此，我们迫切需要深入了解转移发生背后的机制，从而提出针对晚期癌症的有效治疗方法。转移性癌症难以治疗，因为组织活检具有侵入性且难以获取。近年来，液体活检引起了广泛关注，包括来自外周血的无细胞循环脱氧核糖核酸（DNA）和循环肿瘤细胞；我们已从转移性结直肠癌患者中成功建立多个循环肿瘤细胞系，以参与其特征鉴定。事实上，为了对这些稀有且研究不足的细胞进行功能表征，关键步骤是扩增这些细胞。一旦建立，循环肿瘤细胞（CTC）系可在悬浮或贴壁条件下进行培养。在分子层面，可通过免疫荧光或流式细胞分析，利用CTC系进一步评估特定标志物（如分化、上皮或肿瘤干细胞相关标志物）的表达情况。此外，还可利用CTC系评估其对标准化学治疗药物以及靶向治疗药物的敏感性。通过将CTC皮下注射至免疫缺陷小鼠，也可验证CTC系启动肿瘤形成的能力。
最后，可通过编辑循环肿瘤细胞（CTC）的基因，利用短发夹核糖核酸（shRNA）或CRISPR/Cas9技术，来检测特定目的基因在癌症扩散中可能发挥的作用。经基因修饰的CTC可被注射至免疫缺陷小鼠的脾脏中，以实验性地模拟转移发展过程的某一阶段。 体内.
总之，循环肿瘤细胞系是未来研究和个性化医疗的宝贵工具，它将利用最初导致转移的细胞本身来预测治疗效果。

通过免疫荧光（IF）（图1A 右侧面板）和流式细胞术（FACS）（图1B）分别观察到的 EpCAM 和 CD26 表达表明，该循环肿瘤细胞（CTC）系具有上皮特性，并表现出一种肿瘤干细胞（CSC）的标志性特征10。该上皮特性可通过针对其他上皮和间充质标志物的抗体染色进一步表征，从而可大致判断该 CTC 系在上皮-间充质转化轴上的位置。其他 CSC 标志物的表达也可通过免疫染色和细胞术进行检测。此外，可通过药物抗性实验以及体内肿瘤启动能力检测等功能性实验进一步验证该 CSC 表型10。例如，此处的荧光素酶活力检测显示，仅在较高药物浓度下才能达到 CTC 的 IC50，表明这些细胞具有高度耐药性（图2）。此外，皮下注射 CTC 显示该细胞系具有成瘤能力（图3A）。上述结果进一步...

培养循环肿瘤细胞（CTCs）可通过检测特定标志物表达、评估耐药性以及定植肝脏等能力，从而对癌症进行更深入的功能学表征。总体而言，CTCs培养有望成为一种有前景的临床工具，用于个体化医疗，以改善患者的治疗预后。

转移是导致癌症死亡的主要原因。尽管治疗策略已有所改进，转移性癌症的预后仍然较差。因此，我们面临着……

转移是导致癌症相关死亡的主要原因。当癌细胞从原发肿瘤脱落，进入血液循环并最终到达远处靶器官时，就会发生这种现象。一旦这些脱落的细胞进入血液，我们称它们为继发性肿瘤细胞。它们是一种具有可变性的材料，因为一方面，它们是导致转移形成的主要元凶，而另一方面，与肿瘤活检相比，获取它们更为容易。实际上，仅需通过简单的抽血即可采集。尽管血液样本中这些细胞的数量较少，但我们是首个利用三维可控条件，从患者血液中成功建立多个循环肿瘤细胞系的研究团队，且该方法具有更高的关注度。该细胞系可用于常规实验，如同任何商业化的细胞系一样。例如，可用于基因药物筛选、目标蛋白研究，也可用于体内实验以检测其成瘤能力及转移潜能。循环肿瘤细胞（CTC）系应在低氧条件下进行三维培养。一旦循环肿瘤细胞（CTC）形成球状体，即可将其置于培养基中，在300 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液，加入500 µL Accumax溶液。充分悬浮后，于37°C孵育20分钟。然后用PBS洗涤解离后的细胞球并离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于新鲜添加补充物的DMEM/F12培养基中，并以每微升5个细胞的密度接种至新的24孔低吸附板中。离心收集CTC细胞球，弃去上清液，并用PBS洗涤沉淀物两次。加入500 µL PFE，充分混匀，将离心管置于冰上孵育20分钟。然后，离心固定后的微球，用PBS洗涤沉淀两次，尽量去除PBS的体积，并加入20 µL已形成的HistoGel。重悬后，在培养皿上制成液滴，静置干燥10分钟，然后用手术刀将其剥离。现在可以根据需要处理以靶向特定目的蛋白的循环肿瘤细胞（CTCs）。收集CTCs，并如前所述使用Accumax解离细胞球。去除Accumax，将细胞沉淀重悬于3 mL封闭缓冲液中，然后将悬液通过14微米细胞筛，以获得单细胞悬液。计数细胞并分装至离心管中，每管加入含有200,000个细胞的体积，离心后弃去上清液。根据抗体说明书，向一管中加入所需体积的抗体，另一管中加入相应的同型对照抗体，并按照生产商的指导继续后续步骤。剩余的一管不进行标记，本实验强烈建议使用活率标记物。在流式细胞仪上，首先使用未标记的样本管，在阴性标记区域设置电压。随后放置同型对照管。同型对照将作为阴性对照，用于区分阳性信号与非特异性信号。最后，使用目标抗体对标记的细胞完成实验，如果目标蛋白有表达，应可见阳性标记门出现偏移。将分离的CTC重悬于添加了补充物的培养基中，密度为每毫升20万个细胞。在超低吸附96孔板中，每孔加入50微升，密封后于低氧条件下孵育24小时。第二天，向各孔中加入50 µL不同浓度的待测药物，并仅加入等体积的DMEM/F12，以进一步确定细胞活力的基础水平，随后将培养板继续孵育48小时。第三天，重悬试剂后，向每孔加入70 µL混合液。将培养板置于旋转摇床上震荡20分钟，然后检测发光信号。该检测是一种用于评估大量药物对循环肿瘤细胞（CTC）生长影响的有效工具。在Eppendorf管中，用100微升PBS重悬细胞，捏起小鼠背部皮肤，将针头插入皮下。在同一位置缓慢注射全部体积，每隔两天监测一次肿瘤生长情况，若肿瘤体积超过1.5立方厘米，则处死小鼠。手术前，在小鼠背腹侧皮下注射镇痛剂，于第10肋下方做一小切口。轻轻将脾脏提出，置于无菌纱布上。使用胰岛素注射器，向脾脏内注射50 µL用PBS重悬的CTCs，针头停留三分钟不拔出。从一侧结扎动脉血管，另一侧结扎静脉血管。然后在两条结扎线之上直接剪切，移除脾脏。缝合腹膜和皮肤，并对局部区域进行充分消毒。本实验的目的是通过诱导可观察的转移性征象，检测来自结直肠癌患者的循环肿瘤细胞（CTCs）定植肝脏的能力。分离并建立临床肿瘤细胞系是基础研究和转化研究中的一种新兴工具。例如，若某个目的基因在体内研究中已被证实参与结直肠癌细胞系的迁移和侵袭能力，则可在将循环肿瘤细胞系注射至小鼠脾脏前，敲除该基因，使其定植肝脏，从而在体内验证该基因的功能。对于转化医学研究，我们分离循环肿瘤细胞系的主要目的是将这种珍贵的材料用于个体化医疗。从患者的血液样本中，我们将在培养条件下分离并扩增循环肿瘤细胞（CTCs）两到三周，以获得足够的细胞材料，用于筛选现有的药物组合，评估其细胞毒性，最终实现针对性治疗方案的制定

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癌症研究

循环肿瘤细胞系:基础和转化研究的创新工具

从癌症患者血液中分离循环肿瘤细胞，且不造成细胞损伤。通过使用E-选择素的双分子层表面以及针对上皮标志物的抗体，实现肿瘤细胞的分离。纳米管涂层可特异性促进癌细胞黏附，从而获得较高的捕获纯度。...

快速分离患者血液样本中具有活性的循环肿瘤细胞

本文介绍了如何将新鲜获取的黑色素瘤组织制备成原代细胞培养物，以及如何去除肿瘤细胞中红细胞和成纤维细胞的污染。最后，我们描述了如何利用磁性激活细胞分选技术（MACS）从CD133-主体细胞中分选出CD133+的黑色素瘤干细胞样细胞。...

患者来源的细胞培养及从黑色素瘤中分离CD133+潜在肿瘤干细胞

循环肿瘤细胞（CTCs）在多种转移性癌症中具有预后价值。本文描述了作为金标准的CellSearch系统（CSS）CTC计数平台，并强调了常见的分类错误。此外，还介绍了两种 经过改进的实验方案，可用于利用该技术对CTC进行用户自定义标志物表征，以及在转移性小鼠模型中进行CTC计数。...

循环肿瘤细胞（CTC）半自动化检测技术在临床与临床前研究中的应用转化

循环肿瘤细胞（CTCs）已被证实对肿瘤转移具有重要作用。本文介绍了一种从同基因型小鼠肝细胞癌（HCC）转移模型的全血中分离并扩增循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。...

从小鼠癌症模型中分离与扩增循环肿瘤细胞

本文介绍了一种利用聚(N-异丙基丙烯酰胺)（PIPAAm）包被的微滤膜有效捕获活体循环肿瘤细胞（CTC）并实现温度响应性释放的实验方案。该方法可从患者血液中捕获CTC，并随后释放具有活性的CTC，用于后续的芯片外培养、分析与表征。...

从血液中捕获并释放可存活的循环肿瘤细胞

我们描述了通过将肿瘤细胞或类器官注射到小鼠盲肠中建立原位结直肠肿瘤模型，并从此模型中后续分离循环肿瘤细胞（CTCs）的方法。...

结直肠癌原位小鼠模型中循环肿瘤细胞的分离

本文介绍了一种整合性工作流程，用于鉴定循环肿瘤细胞（CTCs）的表型和分子特征。我们将活细胞免疫染色与单个及成簇CTCs的机器人显微操作相结合，并利用基于单细胞的技术进行后续分析，评估其定植转移的能力。...

循环肿瘤细胞的显微操作用于下游分子分析及转移潜能评估

本实验方案描述了如何从原代癌细胞生成三维肿瘤培养模型，并通过细胞活力检测和显微镜观察评估其对药物的敏感性。...

建立源自患者肿瘤样本的三维肿瘤球体并评估其对药物的敏感性

临床微流控芯片是一种重要的生物医学分析技术，可简化临床患者血液样本的预处理，并对循环肿瘤细胞（CTCs）进行免疫荧光染色 原位...

用于分离多种循环肿瘤细胞的临床微流控芯片平台

循环肿瘤细胞（CTCs）对于癌症进展和转移的研究至关重要。本文介绍了一种高通量、一体化的CTC富集与单个CTC测序方案，在提高捕获效率和CTC纯度的同时，降低了污染风险和测序成本，从而推动了精准肿瘤学研究及临床应用的发展。...

基于微流控的高通量循环肿瘤细胞分选与单细胞测序技术

了解循环肿瘤细胞系的建立方法，通过3D培养扩增结直肠癌患者CTC，用于药物筛选和体内转移实验。该技术为基础与转化研究提供创新工具，助力个性化医疗发展。

循环肿瘤细胞系：基础与转化研究的创新工具

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