循环肿瘤细胞系：基础与转化研究的创新工具

转移是导致癌症相关死亡的主要原因。当癌细胞从原发肿瘤脱落，进入血液循环并最终到达远处靶器官时，就会发生这种现象。一旦这些脱落的细胞进入血液，我们称它们为继发性肿瘤细胞。

它们是一种具有可变性的材料，因为一方面，它们是导致转移形成的主要元凶，而另一方面，与肿瘤活检相比，获取它们更为容易。实际上，仅需通过简单的抽血即可采集。尽管血液样本中这些细胞的数量较少，但我们是首个利用三维可控条件，从患者血液中成功建立多个循环肿瘤细胞系的研究团队，且该方法具有更高的关注度。

该细胞系可用于常规实验，如同任何商业化的细胞系一样。例如，可用于基因药物筛选、目标蛋白研究，也可用于体内实验以检测其成瘤能力及转移潜能。循环肿瘤细胞（CTC）系应在低氧条件下进行三维培养。

一旦循环肿瘤细胞（CTC）形成球状体，即可将其置于培养基中，在300 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液，加入500 µL Accumax溶液。充分悬浮后，于37°C孵育20分钟。

然后用PBS洗涤解离后的细胞球并离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于新鲜添加补充物的DMEM/F12培养基中，并以每微升5个细胞的密度接种至新的24孔低吸附板中。离心收集CTC细胞球，弃去上清液，并用PBS洗涤沉淀物两次。

加入500 µL PFE，充分混匀，将离心管置于冰上孵育20分钟。然后，离心固定后的微球，用PBS洗涤沉淀两次，尽量去除PBS的体积，并加入20 µL已形成的HistoGel。重悬后，在培养皿上制成液滴，静置干燥10分钟，然后用手术刀将其剥离。

现在可以根据需要处理以靶向特定目的蛋白的循环肿瘤细胞（CTCs）。收集CTCs，并如前所述使用Accumax解离细胞球。去除Accumax，将细胞沉淀重悬于3 mL封闭缓冲液中，然后将悬液通过14微米细胞筛，以获得单细胞悬液。

计数细胞并分装至离心管中，每管加入含有200,000个细胞的体积，离心后弃去上清液。根据抗体说明书，向一管中加入所需体积的抗体，另一管中加入相应的同型对照抗体，并按照生产商的指导继续后续步骤。剩余的一管不进行标记，本实验强烈建议使用活率标记物。

在流式细胞仪上，首先使用未标记的样本管，在阴性标记区域设置电压。随后放置同型对照管。同型对照将作为阴性对照，用于区分阳性信号与非特异性信号。

最后，使用目标抗体对标记的细胞完成实验，如果目标蛋白有表达，应可见阳性标记门出现偏移。将分离的CTC重悬于添加了补充物的培养基中，密度为每毫升20万个细胞。在超低吸附96孔板中，每孔加入50微升，密封后于低氧条件下孵育24小时。

第二天，向各孔中加入50 µL不同浓度的待测药物，并仅加入等体积的DMEM/F12，以进一步确定细胞活力的基础水平，随后将培养板继续孵育48小时。第三天，重悬试剂后，向每孔加入70 µL混合液。将培养板置于旋转摇床上震荡20分钟，然后检测发光信号。

该检测是一种用于评估大量药物对循环肿瘤细胞（CTC）生长影响的有效工具。在Eppendorf管中，用100微升PBS重悬细胞，捏起小鼠背部皮肤，将针头插入皮下。在同一位置缓慢注射全部体积，每隔两天监测一次肿瘤生长情况，若肿瘤体积超过1.5立方厘米，则处死小鼠。

手术前，在小鼠背腹侧皮下注射镇痛剂，于第10肋下方做一小切口。轻轻将脾脏提出，置于无菌纱布上。使用胰岛素注射器，向脾脏内注射50 µL用PBS重悬的CTCs，针头停留三分钟不拔出。

从一侧结扎动脉血管，另一侧结扎静脉血管。然后在两条结扎线之上直接剪切，移除脾脏。缝合腹膜和皮肤，并对局部区域进行充分消毒。

本实验的目的是通过诱导可观察的转移性征象，检测来自结直肠癌患者的循环肿瘤细胞（CTCs）定植肝脏的能力。分离并建立临床肿瘤细胞系是基础研究和转化研究中的一种新兴工具。例如，若某个目的基因在体内研究中已被证实参与结直肠癌细胞系的迁移和侵袭能力，则可在将循环肿瘤细胞系注射至小鼠脾脏前，敲除该基因，使其定植肝脏，从而在体内验证该基因的功能。

对于转化医学研究，我们分离循环肿瘤细胞系的主要目的是将这种珍贵的材料用于个体化医疗。从患者的血液样本中，我们将在培养条件下分离并扩增循环肿瘤细胞（CTCs）两到三周，以获得足够的细胞材料，用于筛选现有的药物组合，评估其细胞毒性，最终实现针对性治疗方案的制定