Name: Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a aislar y expandir líneas celulares de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Estos protocolos permiten estudios funcionales, cribado de fármacos y modelos in vivo de metástasis.

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Este proyecto de investigación en el laboratorio Pannequin fue apoyado por una beca de investigación del SIRIC: Beca « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Las tesis doctorales de Guillaume Belthier y Zeinab Homayed fueron apoyadas por la liga anticancerígena/Ligue contre le Cancer. El salario de Céline Bouclier fue financiado por la "región Occitania". Gracias a Julian Venables por la edición en inglés.

Todos los protocolos in vivo fueron aprobados por las agencias de ética animal.
1. Amplificación CTC en condiciones de cultivo 3D
<ol><li>Para cultivar CTCs en suspensión, primeros CTC de semilla en pocillos de una placa ultra-Low Attachment (ULA) de 24 pocillos a la concentración máxima de 5 células/μL y en 1 mL de medio M12 (es decir, DMEM-F12 avanzado suplementado con 2 mM l-glutamina, 100 Unit/mL de penicilina y estreptomicina, suplemento de N2, factor de crecimiento epidérmico de 20 ng/mL y factor de crecimiento de fibroblastos de 10 ng/mL10).</li>
	<li>Para permitir la formación de esferas y la expansión celular, incubar las células en condiciones hipóxicas (2% O2)entre 6 a 10 días.</li>
	<li>Una vez que las esferas son lo suficientemente grandes (100 μm), para prevenir la necrosis, disociarlas para su amplificación.<ol>
<li>Coloque la suspensión celular en un tubo de 2 ml o un tubo de 15 ml y centrífuga a 300 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Retire el sobrenadante y agregue 500 μL de reactivo de disociación suave (por ejemplo, Accumax) al pellet.</li>
		<li>Vórtice suavemente e incube la suspensión celular con un reactivo de disociación suave durante 20 a 30 minutos a 37 °C. NOTA: Exceder el tiempo de incubación en el reactivo de disociación suave (Accumax) puede causar un aumento anormal de la mortalidad celular.</li>
		<li>Agregue 1.5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y centrifugue el tubo durante 5 minutos a 300 x g.</li>
		<li>Vierta el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en medio M12 fresco para alcanzar la densidad de 1-5 células por μL.</li>
		<li>Sembrar la suspensión celular en nuevos pocillos de una placa de fijación ultrabaja: 10 ml para matraces T75, 2 ml para placas de 6 pocillos y 100 μL para placas de 96 pocillos</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Tinción de inmunofluorescencia (IF) en secciones de esferas de CTC
<ol><li>Centrifugue las esferas ctc en un tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 minutos, aspire el sobrenadante y lave el gránulo dos veces con PBS.</li>
	<li>Resuspend el pellet con 500 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) e incubar durante 20 min sobre hielo. Centrifugar la suspensión a 300 x g y lavar dos veces con 5 mL de PBS.</li>
	<li>Resuspend el pellet con (es decir, 15 a 20 μL) histogel caliente y líquido. Con una pipeta, tomar toda la suspensión y hacer una gota sobre una superficie preenfriada a 4 °C y dejar polimerizar durante 5 a 10 minutos. NOTA: Trabaje rápido para evitar la polimerización de la suspensión en la punta.</li>
	<li>Separe la gota sólida con la cuchilla de un bisturí e insértela en un cassette de incrustación compartimentado.</li>
	<li>Realice los siguientes pasos: inclusión de parafina, seccionamiento de parafina, rehidratación de sección, recuperación de antígenos e incubación de anticuerpos. Estos pasos son los mismos que para cualquier tumor u órgano incrustado en parafina y procesado para la tinción de inmunofluorescencia12. NOTA: El cassette se puede almacenar en etanol al 70% a 4 °C hasta la incrustación de parafina.</li>
</ol>3. Análisis de citometría
<ol><li>Centrifugar las esferas ctc de la centrífuga en un tubo de 15 ml a 300 x g durante 5 minutos y lavar el pellet dos veces con PBS.</li>
	<li>Aspire el sobrenadante y agregue 500 μL del reactivo de disociación suave al pellet.</li>
	<li>Vórtice suavemente e incube la suspensión celular con el reactivo de disociación suave durante 20 a 30 min a 37 °C. NOTA: Exceder los 40 min de incubación en el reactivo de disociación suave (Accumax) puede resultar en un aumento anormal de la mortalidad celular.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 300 x g, eliminar el sobrenadante y resuspendir el pellet en 5 mL de tampón de bloqueo (es decir, PBS con albúmina sérica bovina al 1% (BSA)).</li>
	<li>Pase la suspensión celular a través de un colador celular de 40 μm para eliminar las esferas restantes.</li>
	<li>Después de contar, coloque 200,000 células en tres tubos de clasificación celular activados por fluorescencia (FACS), centrífuga a 300 x g durante 5 minutos y retire el sobrenadante. Utilice uno de los tres tubos FACS como control que no recibirá ningún reactivo de tinción.</li>
	<li>De acuerdo con la hoja de datos, agregue el anticuerpo apropiado en los dos tubos FACS restantes (es decir, un anticuerpo conjugado contra la proteína de interés, un control de isotipo conjugado).</li>
	<li>Después del tiempo de incubación recomendado, agregue 300 μL del tampón de bloqueo para lavar las células, centrífuga los 3 tubos a 300 x g y aspire el sobrenadante. Repita este paso dos veces. Luego, vuelva a suspender el pellet con el tampón de bloqueo con un reactivo de tinción de viabilidad celular (excepto para el control del tubo FACS sin ninguna tinción).</li>
	<li>Mantenga los tubos en hielo hasta el análisis FACS. Use primero el tubo sin manchas para identificar la puerta para la viabilidad celular y la tinción de anticuerpos. A continuación se analiza el tubo FACS con el anticuerpo conjugado frente a la proteína de interés, para cuantificar el porcentaje de CTC que expresa la proteína de interés. El tubo FACS con el control de isotipo conjugado no debe indicar un desplazamiento. Esto confirma que el cambio es específico de la proteína objetivo de interés. NOTA: Si es posible, utilice una línea celular que exprese un alto nivel de proteína de interés como control positivo y una línea celular que no exprese la proteína como control negativo.</li>
</ol>4. Ensayo de viabilidad de luminiscencia (CellTiter-Glo)
<ol><li>CtC disociadas resuspendidas (como se describe en la sección 1.4.5) en medio M12. Contar las células y adaptar la concentración celular a 200.000 células/ml.</li>
	<li>En una placa ULA de 96 pocillos, sembrar 10.000 CTC disociados por pozo, en 50 μL, e incubar la placa en hipoxia (2% O2)durante 24 h.</li>
	<li>Al día siguiente, agregue 50 μL del medicamento probado a los CTC. Previamente se recomienda realizar una titulación de la concentración del fármaco, para determinar la concentración inhibitoria máxima media (IC50). Trate algunos pozos con vehículo solo para determinar la viabilidad de las células basales. NOTA: El número de células sembradas puede diferir entre las líneas ctC, dependiendo de su tiempo de duplicación. Además, las células deben sembrarse por triplicado para minimizar la variabilidad de los resultados.</li>
	<li>Incubar placas en hipoxia durante otras 48 h.</li>
	<li>En el día 3, coloque las placas cultivadas y el tampón de viabilidad de la célula de luminiscencia y el sustrato a temperatura ambiente y reconstituya el sustrato con un volumen adecuado de tampón, de acuerdo con el protocolo del fabricante.</li>
	<li>Agregue 70 μL de la mezcla de viabilidad de luminiscencia en cada pozo de placa cultivada. Coloque las placas en un agitador orbital durante 20 minutos para inducir la lisis celular y luego transfiera 100 μL de la mezcla a una placa de múltiples pocillos de pared opaca, compatible con el luminómetro.</li>
	<li>Deje que la placa descanse a temperatura ambiente, cúbrala con papel de aluminio para estabilizar la señal luminiscente. NOTA: La señal luminiscente es estable hasta por 3 horas.</li>
	<li>Registre la luminiscencia utilizando un lector de microplacas (es decir, Tecan Infinite 200 Pro).</li>
	<li>Para el análisis de los datos, calcule la media de la unidad de luz relativa triplicada RLU por condición. Evaluar el porcentaje de viabilidad según cada concentración de fármaco necesaria: (RLU de células tratadas/RLU de células no tratadas) x 100.</li>
</ol>5. Inyecciones subcutáneas
<ol><li>En un tubo de microcentrífuga, resuspenda las células en 100 μL de PBS estéril. Si el número de células inyectadas es bajo, resuspenda las células en PBS/Matrigel 1:1, reducidas en factores de crecimiento, para concentrar las células juntas y promover la iniciación del tumor. NOTA: La densidad celular puede ser de 10 células (para desafiar la capacidad de iniciación del tumor) a 1 millón de células dependiendo de la pregunta científica y el objetivo del experimento.</li>
	<li>Extraiga el volumen completo en una jeringa de insulina.</li>
	<li>En un ratón inmunodeficiente, pellizque la piel del flanco entre el índice y el dedo anular e inserte suavemente la aguja en la base de la piel. NOTA: Este procedimiento no es doloroso y se realiza en ratones conscientes.</li>
	<li>Inyecte lentamente el volumen en el mismo lugar para evitar la propagación de las células. Esto creará una pequeña ampolla debajo de la piel.</li>
	<li>Aplique una presión suave en el sitio de inyección para evitar el reflujo del volumen.</li>
	<li>Controle el crecimiento del tumor, cada dos días, usando una pinza.</li>
	<li>Sacrificar al animal si el tumor supera los 1500 mm3. Dependiendo de la disponibilidad de material, sacrificar a los ratones por inhalación de dióxido de carbono o gases anestésicos o por luxación cervical.</li>
</ol>6. Inyección intraesplénica
<ol><li>Antes de comenzar, autoclave los instrumentos quirúrgicos (tijeras y fórceps) a 124 °C durante 15 min y limpie todas las superficies del espacio de trabajo con etanol al 70%.</li>
	<li>En un tubo de microcentrífuga, resuspender las células en 50 μL de PBS estéril y almacenarlas en hielo. La densidad celular puede ir de 0,5 a 1 millón de células. Un mayor número de células puede causar el desarrollo de coágulos en la circulación sanguínea.</li>
	<li>Antes de inyectar las células, inyecte 100 μL de 0.015 mg / ml de buprenorfina por vía subcutánea, para aliviar el dolor.</li>
	<li>Coloque el ratón en una cámara de inducción, donde el isoflurano se mantiene al 3%, durante 2-3 min. Cuando el animal ya no responda al movimiento, colóquelo en su lado derecho sobre una almohadilla térmica y mantenga la anestesia utilizando una máscara facial de circuito respiratorio que administra una mezcla de gases de O2 e isoflurano.</li>
	<li>Aplique lubricante para los ojos sobre cada ojo para evitar el secado de los ojos durante la cirugía. Desinfecte el área torácica con solución de povidona yodada (es decir, betadina).</li>
	<li>En el lado dorsoventral, haga una pequeña incisión de 0,5 cm usando tijeras debajo de la 10ª costilla falsa.</li>
	<li>Levante suavemente el bazo y colóquelo sobre una gasa estéril. Usando una jeringa de insulina, inyecte los 50 μL de CTC en la punta del bazo. Asegúrese de mantener la jeringa en posición vertical y espere de 3 a 5 minutos para evitar el reflujo y luego retire la aguja.</li>
	<li>Ligar los vasos esplénicos de los dos lados (arterias y venas) y extirpar el bazo cortando directamente por encima de las dos ligaduras. El bazo se extirpa para prevenir la formación de tumores no deseados en este órgano.</li>
	<li>Sutura el peritoneo abdominal y luego la piel usando suturas estériles degradables 5.0.</li>
	<li>Mantenga al ratón caliente hasta su recuperación completa de la anestesia.</li>
	<li>Controle al ratón 3 días a la semana para detectar funciones corporales anormales, movimientos y posturas anormales y para perder peso.</li>
	<li>Sacrifique al animal cuando alcancen puntos finales humanitarios (aproximadamente 6 semanas después de la cirugía) para analizar la metástasis hepática.</li>
</ol>

<ol><li>Wittekind, C., Neid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and metastasis.</a> Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).</li>
<li>Eger, A., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%3A+Disease+Models%22%5BJournal%5D)">Models of epithelial-mesenchymal transition.</a> Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).</li>
<li>Palmirotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+of+cancer%3A+a+multimodal+diagnostic+tool+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).</li>
<li>Hong, B., Zu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circulating+tumor+cells%3A+current+challenges+and+new+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends.</a> Theranostics. 3, 377-394 (2013).</li>
<li>vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+challenges+in+the+isolation+and+analysis+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells.</a> Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+diagnostic+value+of+circulating+tumor+cells+with+CytoSorter%C2%AE+CTC+capture+system+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer.</a> Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+circulating+tumor+cells+and+tumor+response+in+colorectal+cancer+patients+treated+with+chemotherapy%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis.</a> BMC Cancer. 14, 976(2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li>
<li>Aceto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cell+Clusters+are+Oligoclonal+Precursors+of+Breast+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis.</a> Cell. 158, 1110-1122 (2014).</li>
<li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66, 1802-1810 (2017).</li>
<li>Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Colorectal+Cancer+in+Differentially+Established+Liver+Metastasis+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models.</a> Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).</li>
<li>Giraud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progastrin+production+transitions+from+Bmi1%2B%2FProx1%2B+to+Lgr5high+cells+during+early+intestinal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis.</a> Translational Oncology. 14, (2020).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+Evaluation+of+a+Novel+Size+Based+Circulating+Tumor+Cell+Isolation+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System.</a> PLoS One. 10, 0138032(2015).</li>
<li>Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+enumeration+by+the+CellSearch+system%3A+the+clinician%27s+guide+to+breast+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment.</a> Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).</li>
<li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic%2C+marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).</li>
<li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Science Translational Medicine. 5, (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen intereses contrapuestos que revelar.

El protocolo descrito anteriormente se utilizó inicialmente para la caracterización funcional de ctC colorrectal, pero se puede usar para otros tipos de cáncer como el cáncer de mama y se puede adaptar para modelos de ratón.
El factor limitante real es el número de CTC presentes en la muestra de sangre y la eficiencia de la técnica utilizada para aislarlos y expandirlos. Se han descrito varias técnicas de aislamiento ctc basadas en propiedades específicas de CTC como el Parsortix, un dispositi...

A pesar de las recientes mejoras en el diagnóstico precoz del cáncer y en la estrategia terapéutica, más del noventa por ciento de la morbilidad por cáncer todavía se debe a la metástasis1. El proceso metastásico es una cascada de varios pasos que comienza con el desprendimiento local de las células del tumor primario y su entrada en el torrente sanguíneo donde se convierten en células tumorales circulantes (CTC) para finalmente colonizar sitios distantes como el hígado y los pulmones, en el caso del cáncer colorrectal (CCR)2. Recientemente, ha habido una creciente atención a las biopsias líquidas, que son una herramienta no invasiva para detectar y enumerar notablemente los CTC a partir de muestras de sangre de pacientes. La heterogeneidad genética intratumoral es una de las principales causas de resistencia a los medicamentos; por lo tanto, aislar células representativas del material tumoral constituye una herramienta prometedora para la medicina personalizada3.
A pesar de la baja frecuencia de CTC en la sangre (1 CTC por 106 - 107 leucocitos)4,se desarrollaron varias técnicas de detección y aislamiento basadas en diferencias de propiedad entre CTC y otros componentes de la sangre5. El número de CTC en las muestras de sangre de los pacientes, por sí solo, puede proporcionar información sobre la etapa de malignidad, la respuesta al tratamiento y la progresión de la enfermedad6,7. Así, el aislamiento ctc es una herramienta crucial para los estudios traslacionales para evaluar la heterogeneidad genética o realizar el cribado farmacológico, así como para los estudios fundamentales para caracterizar estas células invasoras, ya que son los actores clave de la inducción metastásica8,9. De hecho, en comparación con las líneas celulares de cáncer establecidas comercialmente que han acumulado miles de mutaciones a lo largo del tiempo, las CTC frescas comparten las características principales del tumor primario original, incluida una potente capacidad para hacer metástasis, y son un mejor reflejo de la enfermedad. Estas características los convierten en una herramienta robusta para estudios fundamentales, especialmente en experimentos knockout de factores clave predichos involucrados en la metástasis. El resultado de estos experimentos se puede validar in vivo, enratones, como se describe a continuación.
Una vez que los CTC están aislados, pueden expandirse en condiciones de cultivo no adherentes y luego, pueden manipularse como cualquier línea celular de cáncer disponible, es decir, pueden cultivarse igualmente en condiciones adherentes o incrustarse en Matrigel, dependiendo de la pregunta científica10. Por ejemplo, para probar la expresión y localización de una proteína de interés, las esferas ctc se pueden cultivar en condición de suspensión y se incrustan en Histogel para realizar inmunofluorescencia en secciones de esfera. Además, si la proteína es membranosa, su expresión en células vivas se puede medir por citometría.
Para estudios funcionales, para probar el papel de una proteína de interés que puede desempeñar un papel en la colonización hepática, se pueden inyectar CTC con genes editados, por shRNA o CRISPR / Cas9, en el bazo de ratones inmunodeficientes. Este último experimento es un modelo poderoso para imitar la colonización de metástasishepáticas 11.
La capacidad de los CTC para iniciar tumores se puede evaluar inyectando un número muy pequeño de células en ratones inmunodeficientes. Como la iniciación del tumor es un sello distintivo de las células madre cancerosas (CSC), este ensayo indicará el porcentaje de CSC dentro de las líneas de CTC. Este fenotipo de células madre hace que las líneas celulares tumorales circulantes sean resistentes a algunas terapias contra el cáncer estándar de oro. Por lo tanto, los CTC ampliados se pueden usar para detectar medicamentos e identificar el mejor tratamiento eficiente potencial para el paciente; La respuesta de CTC al tratamiento se puede probar in vitro utilizando un ensayo de viabilidad de luminiscencia, por ejemplo.
En una perspectiva a largo plazo, el cribado de fármacos en CTC recién aislados y amplificados podría utilizarse como una nueva herramienta para la medicina personalizada para ayudar a elegir el tratamiento más eficiente y adaptado para los pacientes.
En el presente trabajo se detallan protocolos para cultivar líneas ctc, para teñir proteínas específicas mediante inmunotinción y citometría, para realizar ensayos de citotoxicidad así como experimentos de xenoinjerto in vivo con CTC.

<table><tbody><tr><td>Solución Accumax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad de células luminiscentes</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24 pocillos Claro Fondo plano Fijación ultrabaja múltiple Placas de Pozo,Corning</td><td></td> <td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Histiogel Espécimen Medio</td><td>LabStorage</td><td>HG-4000</td><td></td></tr><tr><td>EGF Humano, grado premium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2 humano, grado premium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-564</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplemento</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502048</tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (5.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr></tbody></table>

líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

La metástasis es una de las principales causas de muerte por cáncer. A pesar de las mejoras en las estrategias de tratamiento, el cáncer metastásico tiene un mal pronóstico. Por lo tanto, nos enfrentamos a una necesidad urgente de comprender los mecanismos detrás del desarrollo de la metástasis y, por lo tanto, de proponer tratamientos eficientes para el cáncer avanzado. Los cánceres metastásicos son difíciles de tratar, ya que las biopsias son invasivas e inaccesibles. Recientemente, ha habido un interés considerable en las biopsias líquidas que incluyen tanto el ácido desoxirribonucleico circulante (ADN) libre de células como las células tumorales circulantes de sangre periférica y hemos establecido varias líneas celulares tumorales circulantes de pacientes con cáncer colorrectal metastásico para participar en su caracterización. De hecho, para caracterizar funcionalmente estas células raras y mal descritas, el paso crucial es expandirlas. Una vez establecidas, las líneas de células tumorales circulantes (CTC) se pueden cultivar en condiciones de suspensión o adherentes. A nivel molecular, las líneas CTC se pueden utilizar para evaluar la expresión de marcadores específicos de interés (como la diferenciación, las células madre epiteliales o cancerosas) mediante análisis de inmunofluorescencia o citometría. Además, las líneas ctC se pueden usar para evaluar la sensibilidad a los medicamentos a las quimioterapias estándar de oro, así como a las terapias dirigidas. La capacidad de las líneas ctc para iniciar tumores también se puede probar mediante inyección subcutánea de CTC en ratones inmunodeficientes.
Finalmente, es posible probar el papel de genes específicos de interés que podrían estar involucrados en la diseminación del cáncer mediante la edición de genes CTC, mediante ácido ribonucleico de horquilla corta (shRNA) o Crispr / Cas9. Por lo tanto, los CTC modificados se pueden inyectar en bazos de ratón inmunodeficientes, para imitar experimentalmente parte del proceso de desarrollo metastásico in vivo.
En conclusión, las líneas CTC son una herramienta valiosa para futuras investigaciones y para la medicina personalizada, donde permitirán predecir la eficiencia del tratamiento utilizando las mismas células que originalmente son responsables de la metástasis.

Tanto las expresiones EpCAM como CD26 observadas por IF (Panel derechode laFigura 1A) y FACS(Figura 1B)respectivamente, indican que la línea CTC es epitelial y muestran una de las características de CSC10. Este rasgo epitelial se puede caracterizar aún más por la tinción con anticuerpos dirigidos contra otros marcadores epiteliales y mesenquimales. De este modo, podría ser posible saber aproximadamente dónde está la línea...

El cultivo de CTC permite una caracterización funcional más profunda del cáncer, a través del ensayo de la expresión de marcadores específicos, y la evaluación de la resistencia a los medicamentos y la capacidad de colonizar el hígado, entre otras posibilidades. En general, el cultivo de CTC podría ser una herramienta clínica prometedora para la medicina personalizada para mejorar el resultado del paciente.

Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

La metástasis es una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer. Este fenómeno ocurre cuando las células cancerosas se separan del tumor primario, entran en la circulación sanguínea para finalmente llegar a un órgano objetivo distante. Una vez que estas células desprendidas entran en la sangre, las llamamos células tumorales secundarias.Representan un material variable porque, por un lado, son los principales culpables de la formación de metástasis y, por otro lado, son más fáciles que las biopsias tumorales. De hecho, se pueden recolectar mediante una simple punción de sangre. A pesar del bajo número de estas células en la muestra de sangre, somos los primeros en establecer varias líneas celulares tumorales circulantes a partir de la sangre del paciente con mayor preocupación utilizando la condición controlada en 3D.Esta línea celular se puede utilizar en cualquier línea celular comercial para experimentos de rutina. Por ejemplo, para el cribado genético de fármacos, a proteínas de interés, pero también para experimentos in vivo para probar la capacidad de iniciación tumoral y su potencial metastásico. CtC, líneas celulares tumorales circulantes, deben cultivarse en condiciones 3D en hipoxia.Una vez que CTC ha formado esferas, podemos ponerlo en el medio y centrifugarlo durante cinco minutos a 300 RCF. Deseche el sobrenadante y agregue 500 microlitros de Accumax. Suspendemos uno e incubamos la solución 20 minutos a 37 grados.Luego lave las esferas disociadas con PBS y peletice las células. Resusped el pellet con un DMEM/F12 recién suplementado y vea las células a la densidad de cinco celdas por microlitro en una nueva placa de 24 Low Attachment. Las esferas de ctc de centrífuga eliminan el sobrenadante y lavan el pellet dos veces con PBS.A 500 microlitros de PFE mezclar bien e incubar el tubo en hielo durante 20 minutos. A continuación, centrífugo las esferas fijas y lave el pellet dos veces con PBS, eliminando el volumen máximo de PBS y añadiendo 20 microlitros de HistoGel formado. Llévalo a suspensión y haz una gota en el jarrón de cultivo, déjalo secar durante 10 minutos y desconéctalo con un bisturí.Ahora puede procesar para cualquier deseado con el fin de CTC dirigido a una proteína deseada de interés. Recopile CTC y disocie las esferas con Accumax como se describió anteriormente. Elimine el Accumax y resuspenda el pellet con tres ml de tampón de bloqueo y transfiera la suspensión a través de un colador celular de 14 micrómetros para obtener una solución de celda única.Cuente las células y envíelas a tubos y agregue un volumen de 200, 000 células, centrifugue los tubos y deseche el sobrenadante. De acuerdo con la hoja de datos de anticuerpos, agregue en un tubo, el volumen deseado del anticuerpo y en otro tubo su isotipo y continúe los pasos siguiendo las instrucciones del fabricante. El tubo restante no se etiquetará y el uso de un mercado de viabilidad se sugiere encarecidamente en este experimento.En el citómetro, comience con el tubo no etiquetado para establecer el voltaje en el área marcada negativamente. Después de esto, coloque el tubo de isotipo. El isotipo serviría como control negativo para distinguir entre la señal positiva y la señal no específica.Y termine el experimento con las células marcadas con el anticuerpo de interés donde debería ver un cambio en la puerta marcada positivamente, si se expresa la proteína de interés. Esto suspende CTC disociados en medio suplementado a la densidad de 200, 000 células por ml. En un accesorio Ultra Low 96, placa de pozo, selle el volumen de 50 microlitros e incube la placa 24 horas en hipoxia.Al día siguiente, agregue 50 microlitros de diferente concentración del medicamento probado y agregue el mismo volumen de DMEM / F12 solo para determinar aún más la base de viabilidad celular e incubar la placa durante otras 48 horas. En el tercer día, reconstituya el agente y agregue 70 microlitros de la mezcla en cada pozo. Coloque la placa en un agitador orbital durante 20 minutos y luego mida la luminiscencia.Este ensayo es una herramienta útil para probar un gran número de medicamentos con el fin de evaluar sus efectos sobre el crecimiento celular de CTC. En Eppendorf, las células de resuspend en 100 microlitros de PBS pellizcan la piel en la parte posterior del ratón e insertan la aguja debajo de la piel. Inyecte lentamente todo el volumen en el mismo lugar y controle el crecimiento del tumor cada dos días y sacrifique a los ratones si el tumor excede un tamaño de 1,5 centímetros cúbicos.Antes de la cirugía, inyecte por vía subcutánea un analgésico, en el lado ventral dorsal del ratón, haga una pequeña incisión debajo de la 10ª costilla. Levante suavemente el bazo y colóquelo sobre una gasa estéril. Usando una jeringa de insulina, inyecte 50 microlitros de CTC resuspendidos en PBS y espere tres minutos sin quitar la aguja.Ligar el vaso arterial de un lado y el vaso venal del otro lado. Luego retire el bazo cortando directamente por encima de las dos ligaduras. Cose el peritoneo abdominal y la piel y desinfecte bien la zona.El objetivo de este experimento es probar la capacidad de los CTC derivados de pacientes con cáncer colorrectal para colonizar el hígado mediante la inducción de una previsión metastásica visible. El aislamiento y establecimiento de la línea celular tumoral clínica es una herramienta emergente tanto para estudios fundamentales como traslacionales. Por ejemplo, si tiene un gen de interés donde los estudios in vivo demostraron que este gen está involucrado en la migración y la capacidad de invasión de las líneas celulares de cáncer colorrectal, eliminar este gen en líneas celulares tumorales circulantes antes de la inyección en el bazo de ratones, dejar que colonicen el hígado podría ser una buena herramienta para confirmar su resultado in vivo.Para los estudios traslacionales, nuestra perspectiva principal de aislar líneas celulares tumorales circulantes es utilizar este precioso material en medicina personalizada. A partir de las muestras de sangre del paciente, aislaríamos y amplificaríamos los CTC en cultivo durante dos o tres semanas con el fin de tener suficiente material para examinar el panel de medicamentos que está disponible y evaluar su citotoxicidad para finalmente atribuir

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Células tumorales circulantes son aislados de la sangre de pacientes con cáncer sin causar daño celular. El aislamiento de las células tumorales se logra usando una superficie bimolecular de E-selectina además de anticuerpos contra marcadores epiteliales. Un recubrimiento de nanotubos específicamente promueve la adhesión de las células cancerosas que resulta en purezas de captura altas.

Rápido aislamiento de células tumorales viables de circulación de muestras de sangre del paciente

En este artículo se describe la preparación de tejido de melanoma recién obtenido en cultivos de células primarias, y cómo eliminar contaminaciones de los eritrocitos y los fibroblastos de las células tumorales. Por último, se describe cómo...

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativos células madre del cáncer de melanoma

Las células tumorales circulantes (CTC) son pronóstico en varios tipos de cáncer metastásico. Este manuscrito describe el sistema de patrón oro CellSearch (CSS) plataforma enumeración CTC y destaca los errores de clasificación errónea comunes. Además, dos protocolos adaptados se describen, por definido por el usuario caracterización marcador de CTCs y CTC enumeración en modelos de ratones preclínicos de metástasis que utilizan esta tecnología.

Adaptación de semiautomatizado de células tumorales circulantes (CTC) Ensayos para aplicaciones clínicas y de investigación preclínica

Se ha demostrado que las células tumorales circulantes (CTC) desempeñan un papel importante en la metástasis tumoral. En este artículo, se describe un método para el aislamiento y la propagación de CTC a partir de la sangre total de un modelo tumoral singénico de ratón con metástasis de carcinoma hepatocelular (CHC).

El aislamiento y la propagación de células tumorales circulantes de un Cáncer de ratón

Un protocolo para utilizar un poli (N-iso propilacrilamida) (PIPAAm) microfiltro recubierto para la captura eficaz y la liberación de respuesta térmica de las células tumorales circulantes viables (CTC) se presenta. Este método permite la captura de CTC de la sangre de los pacientes y la posterior liberación de CTC viables para el cultivo aguas abajo fuera del chip, análisis y caracterización.

Captura y Liberación de viables células tumorales circulantes de la sangre

Describimos el establecimiento de tumores colorrectales ortotópicos mediante la inyección de células tumorales o organoides en el ciego de ratones y el subsiguiente aislamiento de células tumorales circulantes (CTC) de este modelo.

Aislamiento de células tumorales circulantes en un modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Aquí, presentamos un flujo de trabajo integrado para identificar rasgos fenotíricos y moleculares que caracterizan las células tumorales circulantes (CTCs). Combinamos la inmunostalización en vivo y la micromanipulación robótica de los CTCs individuales y agrupados con técnicas basadas en una célula para el análisis y la evaluación de la capacidad de la metastasis-siembra.

Micromanipulación de células tumorales circulantes para análisis molecular descendente y evaluación potencial metastásica

El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

El chip microfluídico clínico es una importante técnica de análisis biomédico que simplifica el preprocesamiento clínico de las muestras de sangre de los pacientes y tiñe inmunofluorescentemente las células tumorales circulantes (CTC) in situ en el chip, lo que permite la rápida detección e identificación de una sola CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para el aislamiento de células tumorales circulantes versátiles

Las células tumorales circulantes (CTC) son fundamentales para el estudio de la progresión y la metástasis del cáncer. Este artículo presenta un protocolo integrado de alto rendimiento para el enriquecimiento de CTC y la secuenciación de CTC única, mejorando la eficiencia de captura y la pureza de CTC al tiempo que reduce la contaminación y los costos de secuenciación, avanzando así en la investigación oncológica de precisión y las aplicaciones clínicas.

Tecnología de clasificación de células tumorales circulantes de alto rendimiento basada en microfluidos y secuenciación de células individuales

Aprenda a aislar y expandir líneas celulares de células tumorales circulantes de pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Estos protocolos permiten estudios funcionales, cribado de fármacos y modelos in vivo de metástasis.

Líneas celulares tumorales circulantes: una herramienta innovadora para la investigación fundamental y traslacional

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