从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析

为了研究棕色脂肪组织的生物学特性，获得高纯度的棕色脂肪组织至关重要。目前尚无现成的棕色脂肪组织纯化方法及相关试剂盒可供使用。在本研究中，我们建立了一种简便的实验方案以解决这一问题。

现在，本方案需要掌握一项技能。与其他方法相比，该方法所需的实验材料更少，且纯化的棕色脂肪组织可直接用于基因和蛋白质表达分析。本方案为研究经典棕色脂肪组织的生物学特性提供了一种新方法。

它还可用于研究白色脂肪细胞的褐变过程。演示该实验步骤的是我实验室的研究助理Amanda。首先，将装有棕色脂肪组织（BAT）和消化液的烧瓶置于35°C培养箱中的磁力搅拌器上，以每分钟60转的速度搅拌30分钟。

使用1 mL移液器在搅拌棒周围打散棕色脂肪组织切片的聚集团块。消化完成后，将70 µm细胞筛置于干净的50 mL离心管上，将约4 mL细胞悬液通过细胞筛过滤。随后用4 mL 12%碘克沙醇溶液洗涤细胞筛。

用移液器上下吹打，将细胞与碘克沙醇溶液混匀，然后将细胞混合液转移至两支透明的5毫升聚苯乙烯试管中。将装有细胞混合液的聚苯乙烯试管置于冰上静置1小时，使胆汁酸体（BAs）在上层形成一层。取出20微升分离得到的胆汁酸体用于显微镜检查。

用于RNA和蛋白质提取时，将BA层移液至两支1.7毫升微量离心管中。然后小心去除过量的碘克沙醇溶液，避免破坏BA层。接着向细胞悬液中加入1毫升TRIzol试剂，以同时提取RNA、DNA和蛋白质，并充分混匀以裂解细胞。

为分离各相，向试管中加入 200 微升氯仿，在 4 摄氏度下以 9,981 G 离心 10 分钟。离心后，取水相用于 RNA 提取。将 300 微升有机相转移至一个 2 毫升微量离心管中，并加入 750 微升 100% 乙醇。

涡旋振荡10秒后，加入200微升1-溴-3-氯丙烷，再次涡旋10秒。加入600微升双蒸水后，再涡旋10秒。将混合溶液于室温下静置10分钟。

离心后，在4°C条件下以9,981 ×g离心10分钟。此时各相将分离，蛋白质相位于中间层。移除上层水相，并向剩余溶液中加入1毫升100%乙醇。

在4°C、9,981 G条件下离心10分钟后，弃去上清液，并用1毫升100%乙醇洗涤沉淀。在4°C、9,981 G条件下再次离心10分钟。去除上清液后，在室温下将沉淀晾干10分钟，并称量湿沉淀的重量。

按每毫克沉淀物加入20微升1% SDS溶液的比例添加。将离心管置于55摄氏度、11 G条件下加热振荡5至10分钟，使沉淀物完全溶解。在该方案中，使用含有3% BSA的PBS将BAs与BAT分离。

分离的细胞呈树莓状，内部含有多个脂滴，并且tdTom阳性，证实这些细胞为棕色脂肪细胞（BAs）。采用改良的GTPC方法从BAs中提取蛋白质，随后通过SDS-PAGE凝胶进行检测。在BAs样品中观察到一条与牛血清白蛋白（BSA）相关的主条带，提示其可能干扰了蛋白质的提取。

为避免 BSA 干扰，使用 6% 碘克沙醇溶液分离 BA，所获得的 BA 呈典型的覆盆子状，并含有多个脂滴。从这些 BA 提取的蛋白质在 SDS-PAGE 凝胶中得到良好分离。这些细胞呈 tdTomato 阳性，而从沉淀中回收的细胞则为 tdTomato 阴性且无明显脂滴，表明 BA 与非脂肪细胞实现了有效分离。

在基因表达分析中，分离得到的棕色脂肪细胞中 UCP1 和 PDGFA 的 mRNA 水平显著升高。但 PDGFRA 的 mRNA 仅在棕色脂肪组织中检测到。UCP1 蛋白在分离的棕色脂肪细胞中富集。

在棕色脂肪组织（BAT）中检测到EDGFR alpha，但在分离的棕色脂肪细胞（BAs）中未检测到。这些结果证实了该分离方法的高效性，并表明所获得的棕色脂肪细胞适用于基因和蛋白质表达研究。在实施本方案时，应使用新鲜的消化缓冲液来解离棕色脂肪组织，并在消化过程中避免组织团块的形成。

这种新方法使得在单细胞水平上研究棕色脂肪组织的生物学特性变得简便。通过应用该方法，研究人员能够对纯化的棕色脂肪细胞进行基因和蛋白质表达研究，精确解析棕色脂肪细胞的基因表达程序，而无需担心源自非脂肪细胞的污染问题。