Name: 从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 了解从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞的优化方案，该方案采用酶解消化与碘克沙醇密度梯度分离技术，可获得高纯度细胞群体，适用于下游基因与蛋白质表达分析，为研究棕色脂肪细胞生物学特性提供可靠平台。

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Z. Lin 获得了美国国立卫生研究院（HL138454-01）和马森医学研究所基金的资助。

所有小鼠均饲养于无病原体环境中，所有实验程序均经马森医学研究机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。UCP1::Cre9 和 Rosa 26tdTomato 小鼠品系13 此前已有报道。所有小鼠均置于室温条件下，维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。
1. 溶液与棕色脂肪组织（BAT）的制备
<ol>
	<li>在15 mL离心管中配制消化液和分离液。</li>
	<li>10 mL BAT消化液：在10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中加入3.5 mg/mL Dispase II、1 mg/mL Collagenase II和10 mM CaCl2，配制成BAT消化液。</li>
	<li>10 mL 12%碘克沙醇溶液（分离液）：将1 mL 10× PBS、2 mL 60%碘克沙醇、0.01 mL 1 M MgCl2、0.025 mL 1 M KCl、0.1 mL 0.2 M乙二胺四乙酸（EDTA）和6.865 mL ddH2O混合，得到12%碘克沙醇溶液。</li>
	<li>使用过量CO2处死一只成年小鼠。具体操作：以每分钟10–30%笼体积的置换速率向小鼠笼内通入100% CO2，5分钟后通过观察是否无呼吸迹象来确认死亡。</li>
	<li>解剖动物并采集肩胛间棕色脂肪组织（BAT），在体视显微镜下剔除白色脂肪组织（WAT）和肌肉层。</li>
	<li>为确保充分消化，将每块BAT切成约3 mm3大小的组织块，放入含金属搅拌子和5 mL消化液的洁净50 mL烧瓶中。开始消化前，将含有BAT和消化缓冲液的烧瓶置于冰上静置1小时。 
	&#8203;注意：在后续步骤中，用于分离棕色脂肪细胞的BAT组织量约为80 mg。</li>
</ol>
2. 胆汁酸分离步骤
<ol>
	<li>将烧瓶置于装有磁力搅拌器的培养箱中，搅拌速度设为 60 rpm，培养箱温度设为 35 °C。消化过程持续约 30 分钟。若在消化过程中 BAT 组织块在搅拌子周围聚集，可用 1 mL 移液枪头将聚集的组织打散。</li>
	<li>将 70 µm 细胞筛置于洁净的 50 mL 离心管上。将约 4 mL 细胞悬液通过细胞筛过滤。用 4 mL 12% 碘克沙醇溶液冲洗细胞筛。反复吹打混匀细胞与碘克沙醇溶液。将细胞混合液转移至两个透明的 5 mL 聚苯乙烯试管中。 
	注意：消化结束后，消化液应呈浑浊状，表明消化充分。每次均应使用新鲜配制的消化液。消化液配制后应在 2 小时内使用完毕。</li>
	<li>若消化不充分，重复步骤 2.2 和 2.3 一次。</li>
	<li>将含有分离液和脂肪组织（BAs）的透明聚苯乙烯试管置于冰上静置 1 小时，脂肪组织将在上层形成一层。</li>
	<li>取 20 µL 分离得到的脂肪组织（BAs）用于显微镜检查。</li>
</ol>
3. 从BAs中分离RNA和蛋白质
<ol>
	<li>将BAs层移入两个1.7 mL微量离心管中，用于RNA和蛋白质的分离。小心去除过量的碘克沙醇溶液，避免破坏BAs层。</li>
	<li>向细胞溶液中加入1 mL Trizol&#160;，以同时分离RNA、DNA和蛋白质。充分混匀以裂解细胞。</li>
	<li>加入200 µL氯仿以分离各相。</li>
	<li>在4 °C条件下，以9,981 × g离心10分钟。</li>
	<li>离心后，取水相用于RNA提取。本研究中，总RNA用于逆转录，随后使用实时PCR进行定量RT-PCR检测。引物序列见材料表。</li>
	<li>将300 µL有机相转移至2 mL微量离心管中。</li>
	<li>向有机&#160;相中加入2.5体积的100%乙醇，涡旋10秒。</li>
	<li>加入200 µL 1-溴-3-氯丙烷，涡旋10秒。</li>
	<li>加入600 µL双蒸水，涡旋10秒。</li>
	<li>将混合溶液在室温下静置10分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以9,981 × g离心10分钟。此步骤中各相将被分离，蛋白质相位于中间层。</li>
	<li>去除上层水相，向剩余溶液中加入1 mL 100%乙醇。</li>
	<li>在4 °C条件下，以9,981 × g离心10分钟。离心后将形成蛋白质沉淀，弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL 100%乙醇洗涤沉淀。</li>
	<li>在4 °C条件下，以9,981 × g离心10分钟。保留沉淀，弃去上清液。</li>
	<li>在室温下将沉淀空气干燥10分钟。</li>
	<li>称量湿沉淀的重量，按每毫克沉淀加入20 µL的比例加入1% SDS溶液。</li>
	<li>将离心管置于加热振荡器中溶解沉淀，设定温度为55 °C，转速为11 × g。通常需要5–10分钟即可完全溶解蛋白质沉淀。 
	注意：溶解后蛋白质的浓度可通过BCA法测定14。</li>
</ol>

<ol><li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+and+functional+diversity+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li>
<li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).</li>
<li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White%2C+brown%2C+beige%2Fbrite%3A+Different+adipose+cells+for+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+Leukotrienes+and+Essential+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li>
<li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li>
<li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li>
<li>Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li>
<li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Report%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li>
<li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodixanol%3A+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li>
<li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+%28OptiPrep%29+density+gradient-based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674(2019).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li>
<li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELi+protocol%3A+Optimization+for+protein+extraction+from+white%2C+brown%2C+and+beige+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li>
<li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+Review%3A+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li>
<li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li>
</ol>

本研究建立了一种分离胆汁酸用于基因和蛋白质表达分析的新方法。
在已发表的胆管细胞（BAs）分离方案中，曾使用3% BSA溶液来富集BAs12。然而，该已发表方案所获得的富集BAs无法直接用于蛋白质表达分析，原因是BAs溶液中残留的高浓度BSA会干扰后续的蛋白质提取过程。当使用Trizol试剂处理在3% BSA溶液中富集的BAs时，会形成黏性蛋白聚集体，其中大部分在GTPC蛋白提取过程中无法溶解。此外，在GTPC蛋白提取产物中，大多数蛋白成分为BSA（图3B）。在本新方案中，以6%碘克沙醇替代3% BSA分离溶液用于纯化BAs。6%碘克沙醇溶液可高效地将BAs与非BAs成分分离，且所分离的BAs形态保持完整（图3D）。相较于3% BSA溶液，6%碘克沙醇溶液不会干扰蛋白质提取，所提取的蛋白适用于Western印迹分析（图4C、D</strong...

小鼠和人类都具有两种类型的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）1。WAT 以甘油三酯的形式将能量储存在白色脂肪细胞中，而 BAT 中的棕色脂肪细胞（BAs）则将化学能以热能形式耗散2。根据其发育来源，BAs 可进一步分为在胚胎发育过程中形成的经典棕色脂肪细胞（cBAs）以及由白色脂肪细胞转化而来的棕色样脂肪细胞（米色/褐脂细胞，可在应激条件下由白色脂肪细胞转化而来）3。BAs 呈多房室结构，并表达产热蛋白解偶联蛋白1（UCP1）4。肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）库是小型哺乳动物中主要的 cBAs 储存部位之一5，而米色细胞则分散存在于白色脂肪组织中6。
由于具有耗散能量的特性，棕色脂肪细胞（BAs）作为减轻肥胖的治疗靶点已受到广泛关注7。为了利用BAs治疗肥胖，必须深入了解调控BAs功能、存活及募集的分子机制。包括棕色脂肪组织（BAT）和白色脂肪组织（WAT）在内的脂肪组织具有异质性。除脂肪细胞外，脂肪组织还包含多种其他细胞类型，例如内皮细胞、间充质干细胞和巨噬细胞8。尽管已有可用于在小鼠BAs中特异性敲除候选基因的遗传工具（如UCP1::Cre品系）9，但用于从BAT或WAT中纯化BAs的技术仍十分有限，这使得在单细胞类型水平上研究BAs变得困难。此外，若无法获得纯化的BAs，则BAs与非BAs之间的关系将难以明确界定。例如，血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）已被用作未分化间充质细胞的标志物，其在BAT的内皮细胞和间质细胞中均有表达。在寒冷应激的BAT中，PDGFRα阳性的前体细胞可分化为新的BAs10。PDGFRα可被其配体PDGF激活，PDGF是一种调控间充质细胞生长与增殖的生长因子11；然而，目前尚不清楚BAs是否通过分泌PDGF来影响PDGFRα阳性前体细胞的行为。
最近发表了一种基于荧光激活细胞分选（FACS）的胆管细胞（BAs）分离方案12。该方案使用3%牛血清白蛋白（BSA）溶液将胆管细胞与非胆管细胞分离，再通过FACS进一步纯化富集的胆管细胞。由于该方案依赖于FACS设备及操作经验，其应用受到一定限制。在本研究中，我们建立了一种从棕色脂肪组织（BAT）中分离胆管细胞的新方案。利用该方案分离的胆管细胞可直接用于基因和蛋白质表达研究。此外，本研究的数据表明，胆管细胞是血小板衍生生长因子（PDGF）的主要来源之一。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;抗原&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;目录&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&amp;gamma;</td><td>LSBio</td><td>Ls-C368478</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRa</td><td>圣克鲁斯</td><td>sc-398206</td><td></td></tr><tr><td>UCP1</td><td>R&amp;amp;D 系统</td><td>IC6158P</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;化学试剂与溶液&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 II 型</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>1-溴-3-氯丙烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B62404</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）&amp;nbsp;</td><td>Goldbio</td><td>A-421-10</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>生物基础</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05040</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II，蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5693</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>EB0107</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15724</td><td></td></tr><tr><td>LiQuant Universal Green qPCR Master Mix</td><td>生命科学</td><td>LS01131905Y</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-855</td><td></td></tr><tr><td>OneScrip Plus cDNA合成超混合液</td><td>ABM</td><td>G454</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep（碘克沙醇）</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>AXS-1114542</td><td></td></tr><tr><td>PBS（10倍浓缩液）</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL07</td><td></td></tr><tr><td>PBS（1×）</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA 蛋白检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-1435</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue 安全染色剂</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Trizol试剂</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;引物&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>基因名称（物种）&amp;nbsp;</td><td>前进</td><td>逆转</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfra（小鼠）</td><td>CTCAGCTGTCTCCTCACAgG</td><td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfa（小鼠）</td><td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td><td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td><td></td></tr><tr><td>36B4（小鼠）</td><td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td><td>TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td><td></td></tr><tr><td>Ucp1</td><td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td><td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;应用&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700</td><td>Keyence</td><td>成像棕色脂肪细胞</td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>解离棕色脂肪组织</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>应用生物系统</td><td>定量 PCR</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc 成像系统</td><td>LI-COR</td><td>Western blot 成像</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

棕色脂肪组织（BAT）负责哺乳动物的非颤抖性产热，而棕色脂肪细胞（BAs）是BAT的功能单位。BAs含有多个小脂滴和丰富的线粒体，并表达解偶联蛋白1（UCP1）。根据其来源，BAs可分为两种亚型：胚胎来源的经典棕色脂肪细胞（cBAs）和由白色脂肪细胞转化而来的棕色脂肪细胞。由于密度较低，传统离心法难以从BAT中分离出BAs。本研究建立了一种新的方法，用于从小鼠中分离BAs，以进行基因和蛋白质表达分析。在该方案中，成年小鼠肩胛间BAT经胶原酶和分散酶溶液消化后，使用6%碘克沙醇溶液富集解离的BAs，随后用Trizol裂解分离得到的BAs。&#160;用于同时分离 RNA、DNA 和蛋白质的试剂。在 RNA 分离后，裂解液的有机相用于蛋白质提取。我们的数据显示，6% 碘克沙醇溶液能有效富集胆汁酸（BAs），且不影响后续的基因和蛋白质表达研究。血小板源性生长因子（PDGF）是一种调控间充质细胞生长与增殖的生长因子。与棕色脂肪组织相比，分离得到的胆汁酸（BAs）中相关基因的表达水平显著升高 Pdgfa总之，这种新方法为在单细胞类型水平上研究棕色脂肪细胞的生物学特性提供了一个平台。

肩胛间棕色脂肪组织（BAT）的制备以分离棕色脂肪细胞 
棕色脂肪细胞（BAs）的分离过程如图1A所示。整个流程，从棕色脂肪组织（BAT）的准备、消化/分离溶液的配制，到获得分离的棕色脂肪细胞，大约需要4小时。
在成年小鼠中，大量的棕色脂肪组织（BAT）存在于肩胛间区域。该肩胛间棕色脂肪组织（iBAT）被肌肉层和白色脂肪组织（WAT）覆盖（图1B）。在开始消化步骤之前，需去除肌肉层和WAT，以获得干净的iBAT（图1C）。在已发表的棕色脂肪细胞（BAs）分离方案中，曾使用剪碎的BAT进行BAs的分离12。本研究中，使用3 mm3大小的BAT组织块进行消化，所获得的BAs数量多于使用剪碎BAT的方法（图1D）。
<p class="j...

本研究介绍了一种分离小鼠棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析的新方法。

棕色脂肪组织（BAT）负责哺乳动物的非颤抖性产热，而棕色脂肪细胞（BAs）是BAT的功能单位。BAs……

为了研究棕色脂肪组织的生物学特性，获得高纯度的棕色脂肪组织至关重要。目前尚无现成的棕色脂肪组织纯化方法及相关试剂盒可供使用。在本研究中，我们建立了一种简便的实验方案以解决这一问题。现在，本方案需要掌握一项技能。与其他方法相比，该方法所需的实验材料更少，且纯化的棕色脂肪组织可直接用于基因和蛋白质表达分析。本方案为研究经典棕色脂肪组织的生物学特性提供了一种新方法。它还可用于研究白色脂肪细胞的褐变过程。演示该实验步骤的是我实验室的研究助理Amanda。首先，将装有棕色脂肪组织（BAT）和消化液的烧瓶置于35°C培养箱中的磁力搅拌器上，以每分钟60转的速度搅拌30分钟。使用1 mL移液器在搅拌棒周围打散棕色脂肪组织切片的聚集团块。消化完成后，将70 µm细胞筛置于干净的50 mL离心管上，将约4 mL细胞悬液通过细胞筛过滤。随后用4 mL 12%碘克沙醇溶液洗涤细胞筛。用移液器上下吹打，将细胞与碘克沙醇溶液混匀，然后将细胞混合液转移至两支透明的5毫升聚苯乙烯试管中。将装有细胞混合液的聚苯乙烯试管置于冰上静置1小时，使胆汁酸体（BAs）在上层形成一层。取出20微升分离得到的胆汁酸体用于显微镜检查。用于RNA和蛋白质提取时，将BA层移液至两支1.7毫升微量离心管中。然后小心去除过量的碘克沙醇溶液，避免破坏BA层。接着向细胞悬液中加入1毫升TRIzol试剂，以同时提取RNA、DNA和蛋白质，并充分混匀以裂解细胞。为分离各相，向试管中加入 200 微升氯仿，在 4 摄氏度下以 9,981 G 离心 10 分钟。离心后，取水相用于 RNA 提取。将 300 微升有机相转移至一个 2 毫升微量离心管中，并加入 750 微升 100% 乙醇。涡旋振荡10秒后，加入200微升1-溴-3-氯丙烷，再次涡旋10秒。加入600微升双蒸水后，再涡旋10秒。将混合溶液于室温下静置10分钟。离心后，在4°C条件下以9,981 ×g离心10分钟。此时各相将分离，蛋白质相位于中间层。移除上层水相，并向剩余溶液中加入1毫升100%乙醇。在4°C、9,981 G条件下离心10分钟后，弃去上清液，并用1毫升100%乙醇洗涤沉淀。在4°C、9,981 G条件下再次离心10分钟。去除上清液后，在室温下将沉淀晾干10分钟，并称量湿沉淀的重量。按每毫克沉淀物加入20微升1% SDS溶液的比例添加。将离心管置于55摄氏度、11 G条件下加热振荡5至10分钟，使沉淀物完全溶解。在该方案中，使用含有3% BSA的PBS将BAs与BAT分离。分离的细胞呈树莓状，内部含有多个脂滴，并且tdTom阳性，证实这些细胞为棕色脂肪细胞（BAs）。采用改良的GTPC方法从BAs中提取蛋白质，随后通过SDS-PAGE凝胶进行检测。在BAs样品中观察到一条与牛血清白蛋白（BSA）相关的主条带，提示其可能干扰了蛋白质的提取。为避免 BSA 干扰，使用 6% 碘克沙醇溶液分离 BA，所获得的 BA 呈典型的覆盆子状，并含有多个脂滴。从这些 BA 提取的蛋白质在 SDS-PAGE 凝胶中得到良好分离。这些细胞呈 tdTomato 阳性，而从沉淀中回收的细胞则为 tdTomato 阴性且无明显脂滴，表明 BA 与非脂肪细胞实现了有效分离。在基因表达分析中，分离得到的棕色脂肪细胞中 UCP1 和 PDGFA 的 mRNA 水平显著升高。但 PDGFRA 的 mRNA 仅在棕色脂肪组织中检测到。UCP1 蛋白在分离的棕色脂肪细胞中富集。在棕色脂肪组织（BAT）中检测到EDGFR alpha，但在分离的棕色脂肪细胞（BAs）中未检测到。这些结果证实了该分离方法的高效性，并表明所获得的棕色脂肪细胞适用于基因和蛋白质表达研究。在实施本方案时，应使用新鲜的消化缓冲液来解离棕色脂肪组织，并在消化过程中避免组织团块的形成。这种新方法使得在单细胞水平上研究棕色脂肪组织的生物学特性变得简便。通过应用该方法，研究人员能够对纯化的棕色脂肪细胞进行基因和蛋白质表达研究，精确解析棕色脂肪细胞的基因表达程序，而无需担心源自非脂肪细胞的污染问题。

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Immunology and Infection

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