利用膜结合型IL-21修饰的B细胞系扩增自然杀伤（NK）细胞和CAR-NK细胞的方法

与基于其他饲养细胞的扩增系统相比，该方案可显著改善体外功能性、非耗竭性、类记忆样自然杀伤（NK）细胞的扩增效果。与使用饲养细胞的其他方案相比，该方法更为简便，因为在NK细胞扩增前无需进行NK细胞分离步骤。该方案可为免疫治疗提供足量的NK细胞及CAR-NK细胞。

该技术具有高度可重复性。然而，使用新鲜的起始材料，并在扩增的最初几天内注意避免扰动自然杀伤细胞（NK细胞）至关重要。首先使用无菌外科器械识别并切取有活性的组织区域，以获得淋巴细胞。

然后，将切好的组织置于30毫升不含钙和镁的HBSS中，并将组织保持在冰上，直至准备进行分离。在生物安全柜内操作，使用无菌剃刀片和镊子将组织切成小于0.5厘米的组织块。取不超过4克的组织碎块放入组织解离管中，并向组织碎块中加入10毫升胶原酶IV。

为了充分剪切组织，将组织解离管放入37摄氏度的组织解离仪中进行处理。从组织解离仪中取出管子后，使用5毫升注射器的推杆将剪切后的组织通过40微米尼龙细胞滤网进行吹打。弃去未消化的大块组织碎片。

在室温下以400G离心收集的洗脱液5分钟，吸除上清液，然后将细胞沉淀重悬于30%聚乙烯吡咯烷酮包被的二氧化硅中以去除脂肪细胞。按前述方法离心细胞，再将细胞沉淀重悬于9毫升R-10培养基中。为分离淋巴细胞与红细胞及多形核细胞，小心地将细胞悬液叠加于4毫升Ficoll或淋巴细胞分离介质上层。

在室温下以400G离心23分钟，离心时关闭加速度和刹车，以分离各层。然后，小心倾去上层培养基，收集含有组织浸润性淋巴细胞的界面层。用10毫升培养基洗涤细胞，随后进行分析或进行原代自然杀伤（NK）细胞扩增实验。

将外周血单个核细胞（PBMCs）和100 Gy γ射线照射的221-mIL-21细胞分别用10毫升R-10培养基在400G离心5分钟进行洗涤。离心后，保留1 × 10⁶个PBMCs用于流式细胞术检测，将5 × 10⁶个PBMCs与10 × 10⁶个γ射线照射的221-mIL-21细胞混合于特制的6孔板中。向同一6孔板中加入30毫升R-10培养基，并补充人白细胞介素-2和人白细胞介素-15，随后将6孔板置于37°C、含5%二氧化碳的培养箱中孵育，每3至4天更换一次培养基。

孵育期间，每隔3至4天记录外周血自然杀伤细胞（PBNK细胞）的总数、活力，并通过流式细胞术检测，以计算NK细胞扩增率。每处理一个100毫米培养皿，需在11毫升D-10培养基中加入1.8 × 10⁶个293T细胞，并将293T细胞置于37°C、含5%二氧化碳的环境中孵育。在1.70毫升离心管中，将470微升低血清培养基与30微升转染试剂混合。

在另一个1.70毫升离心管中，加入2.5微克pRDF质粒、3.75微克Pegpam3质粒以及2.5微克SFG载体中的CAR构建体至低血清培养基中，终体积为500微升。将该管内容物与先前准备的1.70毫升离心管中的内容物以逐滴方式混合。室温孵育15分钟后，将管中1毫升混合液以逐滴方式加入293T细胞培养板中，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48至72小时。

用 PBS 将逆转连蛋白稀释至终浓度为每毫升 50 至 100 微克。将 500 微升稀释后的逆转连蛋白加入未经处理的 24 孔板的每个孔中。然后用封口膜密封培养板，并在 4 摄氏度下孵育过夜。

次日，将含retronectin的培养板在4摄氏度下以2,103×g离心30分钟，弃去上清液。用1毫升R-10培养基封闭24孔板的每个孔后，将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。使用0.45微米滤器过滤先前转染的293T细胞，以收集逆转录病毒上清液。

将过滤后的逆转录病毒上清液每孔2毫升分装至24孔纤连蛋白包被板的各孔中。将24孔纤连蛋白包被板在32摄氏度预热的离心机中以2,103×g离心2小时。在离心过程中，收集第0天扩增的PBNK细胞，并用台盼蓝染色法进行细胞计数。

用添加了白细胞介素-2和白细胞介素-15的R-10培养基将扩增的PBNK细胞稀释至每毫升2.5 × 10⁵至5 × 10⁵个细胞的浓度。将24孔纤维连接蛋白包被板离心后，从每孔中部分吸除逆转录病毒上清液。然后，向每孔中加入2毫升稀释后的扩增PBNK细胞悬液。

将培养板在32摄氏度下以600G离心10分钟，随后在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育48至72小时。将细胞从24孔板转移至50毫升离心管中，以400G离心5分钟。用1毫升R-10培养基重悬细胞沉淀后，将重悬的细胞转移至含有30毫升R-10培养基的特殊6孔板中，该培养基中添加了白细胞介素-2和白细胞介素-15。

将特殊的6孔板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养，定期更换培养基，并每3至4天计算一次NK细胞扩增倍数。使用221-mIL-21扩增的PBNK细胞显示扩增倍数接近5 × 10⁴倍，且在21天的扩增过程中，NK细胞纯度维持在约85%。

扩增前，通过使用抗CD56和抗CD3抗体对PBMCs进行染色，检测了221-mIL-21扩增系统的稳定性，结果显示NK细胞纯度为7.09%，T细胞比例较高。在PBMCs与221-mIL-21共培养的第4天，在进行CAR-NK转导前检测了NK细胞纯度。对CAR-NK细胞进行抗CD56、抗CD3和抗人IgG染色后，第7天显示NK细胞比例较高，且CAR转导效率约为70%。

第18天，通过流式细胞术检测不同亚群中CAR的表达。NK细胞扩增后，可用于体外功能检测或体内实验。研究人员可利用本方案为患有功能性NK细胞缺陷的患者以及其他物种（如犬）扩增NK细胞和CAR-NK细胞。