使用膜结合IL-21修饰B细胞系的自然杀伤（NK）和CAR-NK细胞扩增方法

在这里，我们提出了一种扩增外周血自然杀伤（PBNK），来自肝组织的NK细胞以及源自外周血单核细胞（PBMC）或脐带血（CB）的嵌合抗原受体（CAR）-NK细胞的方法。该协议展示了使用221-mIL-21饲养层细胞的NK和CAR-NK细胞的扩增，以及扩增的NK细胞的优化纯度。

与其他基于扩增系统的饲养层细胞相比，该协议可以显着改善功能性，非详尽，记忆样NK细胞的离体扩增。与其他使用饲养层细胞的方案相比，这是一种更简单的方法，其中我们在NK细胞扩增之前跳过NK细胞分离步骤。该方案可以提供足够数量的NK细胞和CAR-NK用于免疫治疗。

这种技术是高度可重复的。然而，使用新鲜的新起始材料并在扩增的最初几天注意不要干扰NK细胞至关重要。首先使用无菌手术设备识别和切片活组织区域以获得淋巴细胞。

然后，将切片组织放入30毫升不含钙或镁的HBSS中，并将组织放在冰上直到准备好分离。在生物安全柜内工作，用无菌剃须刀片和镊子将组织切成小于0.5厘米的立方体。将切碎的组织碎片（不超过4克）放入组织解离管中，并向组织碎片中加入10毫升胶原酶IV。

为了彻底切碎组织，将组织解离管处理成37摄氏度的组织解离器。从组织解离器中取出试管后，使用5毫升注射器的后端通过40微米尼龙细胞过滤器研磨切碎的组织。丢弃大的未消化片段。

在室温下以400G旋转收集的淋洗液5分钟，并吸出上清液，然后将细胞沉淀重悬于30%聚乙烯吡咯烷酮涂层的二氧化硅中以去除脂肪细胞。在将细胞沉淀重悬于9毫升R-10培养基中之前，按照所述旋转细胞。要将淋巴细胞与红细胞和多形核细胞分离，请小心地将细胞悬液分层在 4 毫升 Ficoll 或淋巴细胞分离培养基上。

通过在室温下以 400G 离心 23 分钟来分离层，同时关闭加速和制动器。然后，小心地倒出上层中层并收获含有组织浸润淋巴细胞的间期。用10毫升培养基冲洗细胞，然后进行分析或初级自然杀伤或NK细胞扩增方案。

用 10 毫升 R-10 培养基分别洗涤外周血单核细胞或 PBMC 和 100 个伽马辐照的 221-mIL-21 细胞，在 400G 下离心 5 分钟。离心后，将 1 x 10 保存到第 6 个 PBMC 中进行流式细胞术，并将 5 x 10 至 6 个 PBMC 与 10 x 10 至 6 个 100 γ 照射的 221-mIL-21 细胞混合在一个特殊的 6 孔板中。将 30 毫升补充有人白细胞介素-2 和人白细胞介素-15 的 R-10 培养基加入同一 6 孔板中，并在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育板，每 3 至 4 天更换一次培养基。

在孵育期间，记录总外周血自然杀伤或PBNK细胞数活力，并每3至4天进行一次流式细胞术以计算NK细胞扩增率。每处理的100毫米板在11毫升D-10培养基中向第6个293T细胞中加入1.8 x 10，并在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育293T细胞。在1.70毫升管中，将470微升还原血清培养基与30微升转染试剂混合。

在单独的 1.70 毫升管中，将 2.5 μg pRDF 质粒、3.75 μg Pegpam3 质粒和 2.5 μg SFG 载体中的 CAR 构建体加入还原的血清培养基中，使最终体积为 500 μL。将管中的内容物与先前以滴加方式制备的1.70毫升管混合。在室温下孵育15分钟后，以滴加方式将管中的1毫升混合物加入293T细胞板中，并将板置于37摄氏度和5%二氧化碳下48至72小时。

用PBS稀释再连蛋白至终浓度为每毫升50至100微克。将500微升稀释的再生连蛋白加入未处理的24孔板的每个孔中。然后，使用封口膜密封板，并将板在 4 摄氏度下孵育过夜。

第二天，将再连蛋白板在2，103G下在4摄氏度下离心30分钟，弃去上清液。用1毫升R-10培养基封闭24孔板的每个孔后，将板在37摄氏度下用5%二氧化碳孵育1小时。使用0.45微米过滤器过滤先前转染的293T细胞以收集逆转录病毒上清液。

将2毫升过滤的逆转录病毒上清液等分到24孔的瑞连蛋白板的每个孔中。将24孔的再生连蛋白板在2， 103G下离心2小时，放入32摄氏度的预热离心机中。在离心平板的同时，从第 0 天收集扩增的 PBNK 细胞并使用台盼蓝对细胞进行计数。

用补充有白细胞介素-2和白细胞介素-15的R-10培养基稀释扩增的PBNK细胞至每毫升第5至5×10至第5个细胞的浓度。离心24孔再生连蛋白板后，从每个孔中部分吸出逆转录病毒上清液。然后，向每个孔中加入2毫升稀释的扩增PBNK细胞。

将板在 600G 下在 32 摄氏度下离心 10 分钟，然后将板在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育 48 至 72 小时。将细胞从24孔板转移到50毫升离心管中，以400G离心管离心管5分钟。用1毫升R-10培养基重悬沉淀后，将重悬的细胞转移到含有30毫升补充有白细胞介素-2和白细胞介素-15的R-10培养基的特殊6孔板中。

将特殊的6孔板在37摄氏度和5%二氧化碳下与刷新培养基孵育，并每3至4天计算一次NK细胞扩增速率。由221-mIL-21扩增的PBNK细胞被证明扩增近5 x 10至第4倍。在整个21天的扩增过程中，NK细胞纯度保持在85%左右。

扩增前，通过对PBMC进行抗CD56和抗CD3染色来检查221-mIL-21扩增系统的稳健性，结果显示NK细胞的细胞纯度为7.09%，T细胞的细胞纯度为高百分比。在PBMC和221-mIL-21共培养的第4天，在CAR-NK转导之前检查NK纯度。抗CD56、抗CD3和抗人IgG染色的CAR-NK细胞在第7天显示出较高的NK细胞群，并观察到约70%的高CAR转导效率。

第18天，用流式细胞术检查各亚群的CAR表达。NK细胞扩增后，细胞可用于体外功能测定或体内实验。研究人员可以使用该协议为功能性NK缺乏症患者以及其他物种（如狗）扩展NK和CAR-NK。