Name: 冷冻电子断层扫描 的糖核 酸的准备和冷冻-FIB微加工 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习使用冷冻聚焦离子束铣削技术制备酿酒酵母样品用于冷冻电子断层扫描的方法。本方案涵盖从细胞培养、玻璃化到薄片制备的完整流程，支持对真核细胞内部结构进行高分辨率原位结构研究。

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本工作由捷克共和国技术局资助，项目编号TN01000008，Instruct-Ultra项目（资助号731005），iNEXT-Discovery项目（资助号871037），后者由欧洲委员会“地平线2020”计划资助，以及CIISB研究基础设施（LM2018127），该设施为Instruct-ERIC中心。我们感谢来自捷克布尔诺赛默飞世尔科技公司的支持。

1. 培养与制备 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 用于玻璃化冷冻的细胞
<ol>
	<li>制备液体培养基 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）.
	<ol>
		<li>对一个500 mL玻璃瓶进行高压灭菌，用于培养基的制备。</li>
		<li>称取 2.2 g 酵母提取物（1.1%）和 4.4 g 蛋白胨（2.2%），溶于 200 mL 水中并混匀。</li>
		<li>121 °C 高压灭菌 15 分钟。</li>
		<li>称取10 g葡萄糖粉末，溶于50 mL水中，配制成20%葡萄糖溶液。经0.2 µm滤膜过滤后，于4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备固体培养基 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）.
	<ol>
		<li>称取4 g琼脂粉，加入200 mL培养基中，混匀。</li>
		<li>在121 °C下高压灭菌15分钟。</li>
		<li>将培养基冷却至40–50 °C，加入20 mL 20%的无菌葡萄糖溶液（前一步骤中制备）。将约20 mL完全培养基倒入培养皿中，在室温下静置使其凝固。</li>
		<li>用封口膜包裹琼脂平板以防止干燥，并于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 在悬浮液中 
	注意：该方案已针对从细胞系悬液制备冷冻聚焦离子束显微镜（cryo-FIBM）样品进行优化 SSaccharomyces cerevisiae 菌株 BY4741 [ATCC 4040002] 或类似菌株。
	<ol>
		<li>高压灭菌一个50 mL的锥形瓶（或类似容器）。</li>
		<li>在通风橱或超净工作台中操作。用移液器将10 mL培养基加入无菌的50 mL锥形瓶中。</li>
		<li>在培养基中加入 1 mL 过滤除菌的 20% 葡萄糖。用无菌一次性接种环（1-10 μL）从琼脂平板上挑取一个酵母菌落。</li>
		<li>将锥形瓶置于培养箱中，在30 °C下振荡培养（150-200 rpm），直至达到对数生长期（约7 h）。 
		注意：我们观察到，当菌落从室温培养4周的琼脂平板上挑取时，约15小时后可进入对数生长期。另见下文备注。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 从甘油菌种中在琼脂平板上划线。
	<ol>
		<li>从4 °C保存处取出一个新的琼脂平板。</li>
		<li>取 S. cerevisiae 从-80 °C超低温冰箱中取出冻存样本，放入冷冻架中，以避免样本完全解冻。</li>
		<li>用无菌接种环刮取少量培养物（1-10 μL），转移至50 μL培养基中，充分混匀。</li>
		<li>转移混合液的全部体积 S. cerevisiae 用无菌涂布棒将菌液在琼脂平板表面进行涂布培养并分散。</li>
		<li>在30 °C下培养约48小时，直至形成直径为1.5–2 mm的菌落。 
		注意：建议在实验前新鲜培养菌落。超过1周的菌落需要更长时间的液体培养才能进入对数生长期。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 在琼脂平板上。
	<ol>
		<li>使用已制备并长有菌落的琼脂平板 S. cerevisiae 菌落</li>
		<li>用移液器将10 mL无菌培养基和1 mL过滤除菌的20%葡萄糖溶液加入50 mL锥形瓶中。</li>
		<li>挑取一个菌落 S. cerevisiae 用无菌接种环接种，并在烧瓶中与培养基混合。</li>
		<li>30 °C 下振荡孵育 50 分钟（150–200 rpm）。</li>
		<li>用培养基将悬浮培养物稀释十倍，取50 μL悬浮液，用无菌涂布棒均匀涂布于琼脂平板上。</li>
		<li>在30 °C下培养约48小时，直至观察到1.5–2 mm的菌落。</li>
		<li>用封口膜封住培养皿边缘，防止干燥。室温保存，最多可使用4周。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 用于细胞簇的浸入式冷冻。
	<ol>
		<li>制备 S. cerevisiae 按照本节中的方案进行细胞培养 悬浮培养酿酒酵母 （第1.3节）在30 °C下振荡培养约7小时（150-200 rpm）。</li>
		<li>测量 OD S. cerevisiae 使用紫外-可见分光光度计在600 nm处测定细胞悬浮液的光密度。</li>
		<li>将细胞悬液浓缩至OD600 = 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备 S. cerevisiae 用于细胞单层的浸入式冷冻。
	<ol>
		<li>准备 S. cerevisiae 按照本节中的方案进行细胞培养 酿酒酵母悬浮细胞培养 30 °C 条件下振荡培养约 7 小时（150–200 rpm）。</li>
		<li>测量 OD S. cerevisiae 使用紫外-可见分光光度计在600 nm处测定细胞悬浮液的光密度。</li>
		<li>将细胞连同培养基转移至离心管中，在相对离心力（900 × g）下轻柔离心2分钟。</li>
		<li>用移液器吸弃细胞沉淀中的培养基。</li>
		<li>向细胞沉淀中加入新鲜培养基。根据所需细胞悬液的OD值，计算培养基的加入体积600 等于30至60。</li>
		<li>在玻璃化冷冻前，向细胞悬液中加入甘油（50%储存液），使其终浓度为5%。 
		注意：甘油作为一种保护剂，可改善细胞间区域冰晶的质量。为尽量减少甘油进入细胞内的量，仅在玻璃化冷冻前短时间内将其加入细胞中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）样品的玻璃化冷冻
<ol>
	<li>对透射电镜载网进行辉光放电处理30-45秒（压力：6-9 Pa，电流：7 mA），碳膜面朝上。</li>
	<li>将玻璃化冷冻机器人设置为以下参数：温度：18 °C，湿度：100%，滤纸接触时间：6 s，等待时间：5 s，滤纸接触循环次数：1次，滤纸压力：5。 
	注意：印迹压力是仪器特异性的数值，不同设备之间的最佳印迹压力值可能有所不同。特定活塞的最佳值必须通过实验确认。</li>
	<li>准备液态乙烷用于玻璃化冷冻。</li>
	<li>将非吸收性表面垫固定在印迹垫上，使其朝向样本。另一块印迹垫使用滤纸。</li>
	<li>用镊子夹取发出荧光的放电网格，并将镊子安装到浸入式冷冻仪器上。</li>
	<li>加入3.5 μL的 S. cerevisiae 将悬液加入加样气候室内的载网碳膜面。每次在载网上加样前均需充分混匀。</li>
	<li>将载网浸入液态乙烷中进行冷冻。</li>
	<li>将载网从液态乙烷转移至液氮2. 将载有玻璃化细胞的载网置于液氮中保存2 条件处理或将它们装入TEM网格卡盒，以便装载到FIB-SEM显微镜中。</li>
</ol>
3. 将透射电镜载网装入载网盒
注意：此处描述的工作流程使用安装在网格盒中的透射电镜（TEM）网格，以方便在扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）显微镜之间进行样品的处理与转移。网格盒组件由C型环、TEM网格和C型夹环组成。当使用其他显微镜制造商的仪器时，也可采用其他配置选项。网格盒组装工作站在填充液氮（LN2. 淋巴结2 该步骤使用载网盒覆盖网格区域，但将透射电镜载网安装至 cartridge 的操作需在液氮（LN）中进行2 蒸气。在玻璃化冷冻过程中，强烈建议佩戴防护面罩或面盾，以防止呼吸产生的污染影响样本。切勿使用已积累冰污染的工具。
<ol>
	<li>组装网格盒组件工作台，并准备用于夹合的干燥工具。</li>
	<li>用液氮冷却组装工作台2. 将剪切工具冷却至液氮温度2 温度</li>
	<li>将装有玻璃化样品的网格盒放入组装工作台。</li>
	<li>将带有细胞样本的透射电镜载网（细胞面朝下）放置于C型环上，并用C型夹固定。</li>
	<li>将剪切后的滤芯放入网格盒中，并妥善盖好。</li>
	<li>将试剂盒储存在液氮中2 将样品放入杜瓦瓶或装入FIB-SEM显微镜中。</li>
</ol>
4. 将样品装载并转移至FIB-SEM显微镜
注意：本说明是针对配备 PP3010 冷冻聚焦离子束/扫描电镜（cryo-FIB/SEM）制样系统的双束显微镜 Versa 3D 编写的。其他替代方案可能需要不同的具体参数；但整体工作流程的基本原理仍然适用。
<ol>
	<li>将显微镜冷却至液氮温度。
	<ol>
		<li>在开始冷却之前，将显微镜腔室和制备腔室（如有）抽至高真空状态（&#60; 4 × 10-4 Pa），以防止污染物生长。</li>
		<li>将制备腔室、显微镜载物台和防污染装置的氮气流量设定为 5 L/min。等待所有组件温度降至 &#60; -180 °C。 
		注：本研究所用的FIB-SEM显微镜系统通过冷却的氮气对载物台和防污染装置进行降温。其他系统可能采用不同的载物台冷却方式。当载物台和防污染装置温度达到-190 °C时，本仪器的腔室压力约为 ~3 × 10-5 Pa。在本实验设置下，样品薄片表面碳氢化合物污染层的生长速率约为 ~15 nm/小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载有样品的载网盒装入显微镜。
	<ol>
		<li>组装装样站并将其冷却至液氮（LN2）温度。</li>
		<li>将样品转移夹（样品 holder）、装有样品的载网盒、载网盒开启工具和镊子放入已冷却的装样站中。</li>
		<li>小心地将载有样品且样品面朝上的载网盒转移至样品转移夹中。</li>
		<li>在装样站内将样品转移夹翻转至装样位置。</li>
		<li>将样品转移夹装入显微镜中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选步骤：在样品表面镀金属保护层。 
	注：在对冷冻水合生物材料进行SEM成像时，可能会观察到强烈的电荷积累效应。此外，即使使用低束流，FIB成像也会导致生物样品快速损伤。因此，可在FIB-SEM显微镜内对样品额外镀膜，以保护样品表面。
	<ol>
		<li>通过气体注入系统（GIS）沉积有机金属铂作为保护层。
		<ol>
			<li>将样品调节至等中心高度（电子束与离子束成像的重合点）。</li>
			<li>将载物台回转至45°（样品相对于电子束倾斜90°）。</li>
			<li>沿 z-轴方向将载物台向下移动4 mm，低于等中心高度。</li>
			<li>将GIS针加热至26–30 °C。</li>
			<li>在载有生物样品的载网上沉积约300–1000 nm厚的有机金属铂层（对应GIS沉积时间为30–120秒）。 
			注：对于含有小细胞簇的样品，我们通常使用GIS沉积30秒；对于单层细胞样品，则沉积45秒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>通过溅射镀膜在样品表面镀上一层导电金属层。
		<ol>
			<li>在载有生物样品的载网上沉积约10 nm厚的金属层（Ir、Au或Pt）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置用于样品薄片制备的显微镜参数
	<ol>
		<li>FIB参数设置如下：高压 = 30 kV，电流 = 10 pA（用于成像），10 pA–3 nA（用于FIB切削）</li>
		<li>SEM参数设置如下：高压 = 2–5 kV，束斑大小 = 4.5，电流 = 8–27 pA。</li>
		<li>将两种束的扫描旋转角度均设为180°。</li>
		<li>设置载物台倾斜角度：切削角度为6–11°（对应于预倾角为45°的样品转移夹和SEM与FIB柱之间夹角为52°的FIB/SEM显微镜，其载物台倾斜角度为13°–18°）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）切片的制备
<ol>
	<li>检查网格质量并选择合适的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞簇。
	<ol>
		<li>检查透射电镜（TEM）网格两面是否已正确 blot，确保细胞簇周围或网格背面无多余水分。 
		注意：为检查网格背面，需将样品台旋转至 -10°，并使用聚焦离子束（FIB）对网格成像。</li>
		<li>根据以下建议选择用于制备薄片的最佳细胞簇。
		<ol>
			<li>将细胞簇置于网格中心。铣削区域不应超出位于网格中心的 1100 × 1100 μm 正方形范围（即从网格中心向各个方向延伸 550 μm）。</li>
			<li>将细胞簇置于网格方格的中央区域，避免与网格条重叠。</li>
			<li>将细胞簇置于具有致密无裂孔碳膜的网格方格内。</li>
			<li>确保细胞簇周围无冰污染。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）单层细胞中选择最佳铣削位置。
	<ol>
		<li>确保所选网格方格中围绕细胞单层的网格条清晰可见。</li>
		<li>根据以下建议在细胞单层中选择最佳位置。所选铣削区域应满足以下标准：
		<ol>
			<li>目标区域位于网格中心。铣削区域不应超出位于网格中心的 1100 × 1100 μm 正方形范围（即从网格中心向各个方向延伸 550 μm）。</li>
			<li>目标区域位于网格方格的中央部分，且不与网格条重叠。</li>
			<li>细胞单层周围无冰污染。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）制备酿酒酵母（S. cerevisiae）薄片。 
	注意：铣削图案相对于目标区域生成并居中。冷冻聚焦离子束铣削（cryo-FIBM）按顺序进行，包含多个不同FIB参数设置下的铣削步骤。首先使用高电流（0.3–3 nA）铣削出厚度约为 2 μm 的薄片，随后逐步将其减薄至 500 nm。最后使用低电流（10–30 pA）进行精细铣削，使薄片最终厚度达到约 100–200 nm。
	<ol>
		<li>将目标区域（ROI）设置至等心高度，并保存该位置。 
		注意：每个位置的等心点需单独确定并保存。等心高度的设定方法为：将样品台倾斜至 0°，通过移动样品台的 x 和 y 方向使目标区域居中；然后将样品台倾斜至 25°，通过调节样品台 z 轴位置使目标区域重新回到扫描区域中心；最后将样品台倾斜回 13°–18° 以进行铣削。</li>
		<li>在目标区域上方定义一个扫描方向为从上至下的矩形铣削图案。</li>
		<li>在目标区域下方定义一个扫描方向为从下至上的矩形铣削图案。</li>
		<li>定义一个覆盖目标区域的非激活矩形铣削图案，用于粗略估计薄片厚度。该图案在薄片制备过程中不进行实际铣削。</li>
		<li>标记所有图案并设置薄片宽度（x 维度）。铣削图案的宽度不应超过细胞簇宽度的 2/3，通常对应 8–15 μm。</li>
		<li>设置粗铣步骤参数
		<ol>
			<li>FIB电流：0.3–3.0 nA；最终薄片厚度：1.5–2 μm；FIBM区域宽度：8–12 μm；样品台倾斜角度：13–17°；持续时间：8分钟；激活的铣削图案：上部和下部。</li>
			<li>FIB电流：0.3–1.0 nA；最终薄片厚度：1 μm；FIBM区域宽度：7.5–11.5 μm；样品台倾斜角度：13–17°；持续时间：8分钟；激活的铣削图案：上部和下部。</li>
			<li>FIB电流：100–300 pA；最终薄片厚度：0.5 μm；FIBM区域宽度：7.5–11.5 μm；样品台倾斜角度：13–17°；持续时间：8分钟；激活的铣削图案：上部和下部。</li>
			<li>FIB电流：30–100 pA；最终薄片厚度：0.3 μm；FIBM区域宽度：7.5–11.5 μm；样品台倾斜角度：13–17°；持续时间：8分钟；激活的铣削图案：上部和下部。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>设置精细铣削步骤参数：
		<ol>
			<li>FIB电流：10–30 pA；最终薄片厚度：&#60;0.2 μm；FIBM区域宽度：7–11 μm；样品台倾斜角度：13–17°（+1°）；持续时间：12分钟；激活的铣削图案：上部。 
			注意：粗铣步骤（5.3.6）需对每个薄片依次进行。相比之下，精细铣削步骤（5.3.7）并不紧随粗铣之后立即执行，而是在整个实验会话结束时统一依次对所有薄片进行精细铣削，以最小化薄片表面的碳氢化合物污染。精细铣削过程中额外增加 +1° 的样品台倾斜角度，以提高薄片沿长度方向的厚度均匀性。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 将Saccharomyces cerevisiae 薄片转移至冷冻透射电镜
<ol>
	<li>准备一个充分干燥的杜瓦瓶，并用液氮（LN2）填充。</li>
	<li>在低温条件下将带有薄片样品的载网从聚焦离子束/扫描电镜（FIB/SEM）中取出，转移至载网盒中，并长期储存在液氮（LN2）储存杜瓦瓶内。或者，可直接将载网装入冷冻透射电镜（cryo-TEM）中。</li>
	<li>薄片相对于冷冻透射电镜（cryo-TEM）样品台倾斜轴的正确取向至关重要（详见配套视频 8:10 处的说明）。应确保所制备薄片的铣削方向与冷冻透射电镜样品台的倾斜轴垂直。</li>
	<li>预先倾斜冷冻透射电镜样品台，以补偿薄片相对于载网平面的倾斜角度，并采用剂量对称方案采集倾斜系列图像19。 
	注意：预倾斜角度的大小（通常为 6–8°）由微加工过程中透射电镜载网平面与聚焦离子束（FIB）方向之间的夹角决定。可通过冷冻透射电镜图像中薄片前缘的位置来确定预倾斜角度的符号。为此，必须了解显微镜样品台的旋转方向。在我们的实验装置中，当在纳米探针选区衍射（SA）模式下成像时，若薄片前缘位于图像右侧，则对应负的预倾斜角度。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

用于冷冻电子断层扫描的细胞样品制备是一个复杂的流程，需要使用多种高端仪器。在每个制备步骤中，样品质量都可能受到影响，从而影响整个流程的通量。此外，样品在不同仪器之间的转移还增加了污染或脱玻璃化风险。因此，优化样品制备流程中的各个步骤对于提高薄片制备流程的通量和可重复性至关重要。本文所述方案介绍了经过优化的样品制备方法&#160;酿酒酵母&#160;用于大分子复合物的结构表征&#160;原位&#160;通过冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）。
本方案描述了两种酵母样品的制备方法，二者主要区别在于透射电镜（TEM）载网上细胞的浓度。两种酵母样品均能获得高质量的冷冻电子断层扫描（cryo-ET）用薄片，研究者可根据具体研究目标选择合适的样品类型。在第一种情况下，酵母细胞在载网表面随机分布，形成由少数细胞组成的孤立簇；而第二种样品类型则在TEM载网表面形成连续的单层细胞。前者由于需要铣削去除的材料体积较小，适合快速制备薄片。最终获得的薄片较短，因此仅包含2–4个细胞横截面。适合样品制备的区域在载网表面（包括载网方格内）呈随机分布，这可能在一定程度上限制薄片制备流程的自动化。后者类型的样品在初始铣削阶段需使用较大的电流，以控制总体铣削时间。此外，此类样品更容易产生因铣削不均（如帘幕效应）引起的伪影。因此，与细胞簇较小的样品相比，需将气体注入沉积（GIS）溅射时间延长50%，以形成更厚的保护层。随后，样品表面再溅射一层额外的铱（也可用铂或金替代），以固化GIS层，增强其刚性，并提高样品表面的导电性。在粗铣薄片的第一步中，对薄片两侧各额外区域（距薄片边缘约2–5 μm）进行聚焦离子束铣削（FIBM），有助于减少薄片断裂的数量，这很可能归因于最终横截面内应力的降低23。最终获得的薄片较长，包含约10个细胞横截面，从而增加了适合进行冷冻电子断层扫描的区域数量。细胞间介质或缓冲液的玻璃化不良问题，可通过向缓冲液中添加冷冻保护剂（本研究中使用5%甘油）而有效缓解。由于大多数载网方格均适合进行薄片制备，因此细胞排列成连续单层的样品非常适合无人监管的自动化薄片制备。
薄片制备流程中的另一个重要环节是将样品转移至透射电子显微镜，并将其正确地定位到显微镜载物台的倾转轴上。理想情况下，薄片的主轴应与显微镜的倾转轴垂直，这样可在成像区域高度实现追踪和聚焦，并防止在高倾转角度下薄片边缘遮挡视野。当采用剂量对称方案采集冷冻电子断层数据时18&#160;，应在显微镜中首先旋转样品，以补偿薄片相对于载网平面的倾斜角度。

近年来，技术和软件的进步使生物样本的冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）成为过去十年结构生物学研究中的关键技术之一1,2冷冻电镜样品的制备通常包括将纯化的蛋白质或蛋白质-核酸复合物加样至样品载网（透射电镜载网），随后用滤纸吸除大部分液体，再将载网上残留的薄层样品浸入液态乙烷或丙烷中进行快速冷冻。3样品因此被固定在一层薄薄的介质中（通常 &#60;80 nm）的非晶态缓冲层，且样品处于完全水合状态、接近天然条件，无需任何化学固定或重金属染色。在透射电子显微镜下对结构均一的样品进行成像，可获得可用于单颗粒分析的数据，进而以接近原子分辨率解析大分子的三维结构。2此类 体外 结构对应于样品制备过程中所采用的条件和处理方式下大分子的构象。尽管在这些条件下确定的结构 体外 通常情况下，这些条件对应于大分子的完全功能状态，而能够对细胞内不同大分子之间的空间关系进行成像，则可为结构数据提供额外的功能背景信息。
冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）可用于原位重建多形性物体或大分子复合物的三维结构in situ4,5。cryo-ET 的优势在于，其三维信息是通过对单个实体成像获得的。然而，对单个大分子复合物或细胞器的观测分辨率非常有限。因此，需要从大量断层图像中提取具有相同结构的大分子进行平均处理（即亚断层平均化，STA），才能从 cryo-ET 数据中获得分辨率为 4–8 Å 的结构模型6,7。最近研究表明，cryo-ET 与 STA 还可用于解析核糖体等大分子机器在细胞环境背景下的高分辨率结构7。然而，透射电子显微镜的应用受限于样品厚度。通常情况下，在单颗粒冷冻电镜中，通过优化玻璃化条件，可使样品嵌入一层较薄的冰中，因此厚度问题并不突出。但大多数细胞实际上并不能让 300 keV 的电子束有效穿透。对于 300 keV 电子，在玻璃化生物样品中的非弹性平均自由程约为 395 nm8，这意味着对于大多数细胞而言，cryo-ET 研究仅限于细胞周边区域。
为获得适用于冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的足够薄的样品，已发展出多种减薄技术。冷冻超薄切片法（cryo-ultramicrotomy）利用金刚石刀在液氮温度（-196 °C）下对样品进行机械切片，可制备出厚度为60–80 nm、适用于cryo-ET的超薄切片。9,10,11可以从单个细胞制备多个切片，数据分析最终可获得细胞较大区域的三维结构信息。然而，机械切片可能引发多种伪影，如切片弯曲、裂隙或样品压缩，这些因素可能影响最终结构并导致冷冻电子断层成像数据产生偏差。10,11,12冷冻聚焦离子束微加工（cryo-FIBM）是一种替代方法，该方法通过在多步过程中使用聚焦的镓离子束（FIB）逐步消融样品，制备出厚度为80–300 nm的细胞切片（薄片）。13,14,15与冷冻超薄切片技术相比，冷冻聚焦离子束显微切割（cryo-FIBM）仅从单个细胞制备一片薄片，其体积约占细胞总体积的0.3–3%，通常需要对多个细胞进行微加工，才能在铣削出的横截面中找到感兴趣的区域。此外，目前整个工作流程的通量仍然较低，一次8小时的cryo-FIBM操作通常只能获得6–8片高质量的薄片。然而，cryo-FIBM获得的横截面不存在任何压缩伪影，可为高分辨率冷冻电子断层成像（cryo-ET）提供理想的样品。更重要的是，在整个薄片制备过程中样品始终保留在透射电镜（TEM）载网上，因此无需将薄片转移至用于cryo-ET的样品载体，同一载网可直接用于后续的TEM观察。我们预计，随着无需人工监督的薄片铣削软件的普及，cryo-FIBM的通量将很快得到显著提升。16,17 以及利用基于电荷耦合等离子体原理运行的FIB，这将实现更快的材料消融。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） （酵母）是球形的真核细胞，直径约为 2–5 µm。由于其体积小、易于获取、遗传背景清晰、世代时间短且操作简便，酵母在细胞和分子生物学研究中被广泛用作真核模式生物，类似于 大肠杆菌，其作为细菌学中研究充分的原核模式生物。该酵母可在悬浮液中轻松培养，并在短时间内产生大量细胞（倍增时间1–2小时）。更重要的是，酵母具有与动植物细胞相似的复杂内部细胞结构，同时基因组较小，非编码DNA含量低。基于高分辨率对酵母蛋白质组进行的结构表征 原位 因此，这些数据有助于为文献中已有的大量功能数据提供机制性解释。
在此，我们提供了一套全面的获取方案 原位 酵母样品的冷冻电子断层扫描数据，涵盖从样品培养到冷冻聚焦离子束显微切割薄片制备，以及将样品转移至透射电子显微镜进行冷冻电子断层扫描数据采集的全部步骤。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Himedia</td><td>MB053</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>PENTA</td><td>12020-31000</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Merck</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>乙烷</td><td>Messer</td><td>1007</td><td></td></tr><tr><td>液氮（LN2）</td><td>Lineq</td><td>LN2-1L</td><td></td></tr><tr><td>蛋白胨</td><td>Merck</td><td>P5905-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>菌株 BY4741</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td>T539</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>Y1333.1000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一次性用品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸水纸</td><td>Ted Pella</td><td>47000-10</td><td></td></tr><tr><td>C型夹</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97551</td><td></td></tr><tr><td>C型夹环</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 909 97561</td><td></td></tr><tr><td>涂布棒</td><td>Merck</td><td>Z376779-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>无菌接种环</td><td>BRAND</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>无菌塑料培养皿</td><td>Sigma</td><td>SIAL0166</td><td></td></tr><tr><td>透射电镜载网（TEM grids）</td><td>Quantifoil</td><td>4420G-XA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>Systec</td><td>101291545</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>BEL</td><td>M124A</td><td></td></tr><tr><td>冷冻聚焦离子束/扫描电镜显微镜（Cryo-FIB/SEM microscope）</td><td>ThermoScientific</td><td>1006123</td><td></td></tr><tr><td>冷冻透射电镜（Cryo-TEM microscope）</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 057 03301</td><td></td></tr><tr><td>层流洁净台</td><td>Telstar</td><td>AH5</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Gatan</td><td>955.82001</td><td></td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>New Brunswick</td><td>M1282-0002</td><td></td></tr><tr><td>紫外/可见光分光光度计（UV/VIS spectrophotometer）</td><td>WPA</td><td>S800</td><td></td></tr><tr><td>玻璃化冷冻机器人</td><td>ThermoScientific</td><td>9432 053 50621</td><td></td></tr></tbody></table>

样品制备与冷冻聚焦离子束微加工 酿酒酵母 用于冷冻电子断层扫描

Preparation and Cryo-FIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for Cryo-Electron Tomography

如今，冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）是唯一能够提供大分子复合物近原子分辨率结构数据的技术 原位由于电子与物质之间存在强相互作用，高分辨率冷冻电子断层扫描（cryo-ET）研究仅限于厚度小于200 nm的样品，这使得cryo-ET的应用仅局限于细胞的周边区域。过去十年中，为实现对较大细胞内部区域进行cryo-ET数据采集，引入了一种复杂的实验流程，该流程包括通过冷冻聚焦离子束微加工（cryo-FIBM）技术制备薄层细胞切片。本文介绍了一种利用浸入式冷冻法实现玻璃态化的样品制备细胞薄片的实验方案 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 作为细胞和分子生物学研究中广泛应用的真核细胞典型范例，我们描述了玻璃化冷冻的实验方案 S. cerevisiae 形成由少数细胞组成的孤立区域或在透射电镜载网上形成的连续单层细胞，并为这两种样品提供通过冷冻聚焦离子束（cryo-FIB）制备薄片的实验方案。

的 Saccharomyces cerevisiae 在对数生长期中期收获培养物。制备了两种类型的样品，其中细胞以少量细胞组成的小簇形式分布在透射电镜载网表面（图1A，C）或在透射电子显微镜载网的单个网格方格上形成连续的单层图1B，D）。用于制备含有独立细胞岛或细胞单层样本的区别因素在于接种到透射电镜（TEM）载网上的细胞培养物浓度。收获的细胞培养物浓缩至OD600 = 1.0 用于前一种情况，或至 OD600 = 30 至 60。在制备细胞单层样品时，于玻璃化之前额外添加 5% v/v 甘油。甘油对于填充细胞间隙的缓冲液的玻璃化至关重要（图2因为晶体缓冲层的反射在冷冻电镜断层扫描数据采集过程中可能对准确的位置追踪和聚焦产生不利影响。
此外，将酵母悬浮培养液点样至非吸附性材料上，例如聚四氟乙烯（PTFE）点样垫或由FlexFill 98A材料定制的3D打印点样垫。点样纸仅置于载网相对于样品施加面的背面（背侧点样）。对于悬浮培养物的快速冷冻，推荐采用背侧点样策略，因为从两侧使用滤纸点样会导致细胞黏附于点样纸上（图1E）。
本方案中所描述的方法利用固定在网格盒中的透射电镜（TEM）载网，该设计为载网提供了稳定的支撑，并便于在玻璃化处理后对样品进行操作。因此，必须确保聚焦离子束/扫描电镜（FIB/SEM）和透射电镜（TEM）显微镜中的其他样品 holder 及转移装置能够兼容此类网格盒。
将样品转移至FIB/SEM显微镜后，首先在样品表面镀上一层0.3–1.0 μm 使用显微镜气体注入系统（GIS）沉积一层甲基环戊二烯基铂。在样品表面 дополнительно溅射一层无机铱，以增强GIS层的硬度并使表面具有导电性。薄片通过多步铣削制备图3）其中（I）铣削电流、（II）薄片宽度以及（III）样品上下方铣削区域的距离均逐步减小。最后的铣削步骤（“抛光”）仅从薄片顶部一侧进行，采用低电流（10–30 pA），并将样品额外向 Ga+ 束方向倾斜 1°。采用所述方案，平均可在一次 6–8 小时的操作中，在两张透射电镜（TEM）载网上制备出 8–10 片薄片。
将带有薄片的透射电镜载网随后转移至透射电子显微镜中。首先对薄片进行筛选，仅选择那些表现出最小帘状伪影（由薄片表面铣削不均匀引起的伪影）、低表面污染水平以及良好细胞对比度的样品（通常在厚度适中的薄片中可观察到） &lt;选择厚度为200 nm的样品用于采集冷冻电子断层扫描（cryo-ET）数据。此外，贯穿全长存在裂纹的薄片在数据收集中被剔除。通常情况下，转移至透射电子显微镜（TEM）的薄片中约有50%适用于数据采集。倾斜系列数据在配备能量选择狭缝（设为20 eV）的后GIF K2直接电子探测器上采集，数据采集使用SerialEM软件完成。18 并采用剂量对称方案采集倾转系列图像19 ±的倾斜范围60° 以及增量的 3°数据采集时的放大倍数对应像素尺寸为3.47 Å/px，总剂量为65 e/Å²。2 在各个子帧中均匀分布。倾斜图像以三帧为一组进行采集，随后使用 MotionCor2 对数据采集过程中产生的运动和辐射损伤进行校正。20 程序。使用 Ctffind4 估算对比度传递函数的参数21倾斜系列在 eTomo 中进行处理18采用斑块跟踪程序对图像进行对齐。图像经2倍二值化处理后，使用加权反投影算法重构断层图像，随后在IMOD中采用类似SIRT的滤波器（设置为8次迭代）进行滤波。18在 Amira 软件中手动完成断层扫描图像的分割22重建的断层图像为酵母细胞内部提供了高分辨率的呈现，使我们能够细致观察液泡或线粒体等细胞器，或研究微管、核孔复合体等大分子复合物。 原位 以及在接近天然的条件下（图4).
<img alt="石墨烯表面SEM图像及示意图；纳米图案化与材料表征。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig1.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图1"> 
图1：玻璃化 S. cerevisiae 的FIB与SEM图像 
小酵母簇在透射电镜载网（TEM grid）上玻璃化后的聚焦离子束（FIB）图像（A）和扫描电镜（SEM）图像（C）。酵母在载网表面形成连续单层时的FIB图像（B）和SEM图像（D）。成像前样品表面已镀上气体注入系统（GIS）沉积层和铱（Irridium）层。图A–B中的比例尺为10 μm。酵母样品通过非吸收性材料（如PTFE或FlexFill 98A，绿色）进行 blotting 处理， blotting 纸从载网背面放置（白色，E）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像，多孔介质中颗粒密度比较；用圆圈标示差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图 2"> 
图 2：S. cerevisiae 薄片 
从样品中微加工获得的薄片的透射电子显微镜（TEM）图像，显示网格表面覆盖有连续的单层酵母细胞。细胞间观察到的反光区域为未充分玻璃化的培养基/缓冲液（A，以红色圆圈标示）。在培养基/缓冲液中添加 5% 甘油后，将酵母玻璃化并形成连续单层所制备的薄片的 TEM 图像（B）。比例尺对应 2 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="纳米结构测量示意图，展示不同尺寸尺度（μm、nm）下的电流范围（nA、pA）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图3"> 
图3：冷冻聚焦离子束显微镜（Cryo-FIBM）工作流程 
薄片铣削过程的示意图。初始粗铣步骤在假定薄片区（以绿色高亮显示）的两侧使用高FIB电流进行，而最终抛光步骤仅从顶部一侧进行，并使用低FIB电流（以橙色高亮显示，参见配套视频6:33处）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白复合物的冷冻电子显微镜图像；结构分析，分子可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62351/62351fig4.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="图4"> 
图4：通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）描绘的酵母细胞器与大分子复合物 
重建断层图的切片显示了液泡（A，比例尺：200 nm）、核糖体（B，比例尺：200 nm）、过氧化物酶体的拟晶状核心（C，比例尺：100 nm）、微管（白色箭头）与邻近未识别的纤维状结构（黑色箭头，D，比例尺：100 nm）、多条微管的细节（E，比例尺：50 nm）、带有箭头指示核孔的核膜（F，比例尺：200 nm）、线粒体（G,H，比例尺：100 nm，箭头指示单个嵴结构）、一束未识别的丝状结构（I，比例尺：100 nm）。图版 B, C, D, E, G 中的断层图切片来自细胞小簇制备的样本，而图版 A, F, H, I 中的断层图切片则来自单层细胞经切片制备的薄片样本。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62351/62351fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们提出了一种用于大分子高分辨率结构研究的冷冻生物样品冷冻聚焦离子束微加工薄片制备方案 原位 使用冷冻电子断层扫描技术。本方案提供了制备高质量、高重复性薄片的指南，用于对细胞内大分子的结构进行表征&#160;酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）.

目前，冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）是唯一能够在近原子分辨率水平上提供大分子复合物在...中结构数据的技术

本视频将重点介绍用于冷冻电子断层扫描的酵母沙门氏菌样品制备。我们将逐步介绍从细胞培养到冷冻电子断层扫描的完整工作流程。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在悬浮液中培养，用于后续的冷冻样品制备。建议在超净工作台内的无菌条件下操作。向已灭菌的培养烧瓶中加入10毫升无菌酵母提取物培养基用于细胞培养，再加入1毫升无菌的20%葡萄糖溶液。从培养平板上小心挑取一个酵母单菌落，转移至已准备好的培养烧瓶中的培养基内。将培养烧瓶用铝箔封口后充分混匀，使细胞均匀分散。将细胞培养物置于30°C恒温摇床中培养，持续振荡直至进入对数生长期。酵母细胞培养至对数生长期后，使用分光光度计以新鲜培养基作为空白对照，测定细胞悬液的物理密度。在进行玻璃化冷冻前，将细胞培养物浓缩至OD1或OD30，并添加5%的甘油。用于电镜观察的载网表面需经等离子体清洗和活化处理，以利于细胞悬液的附着。将载网放入辉光放电仪中，碳膜面朝上，设置等离子清洗程序为30至45秒。处理后的电镜载网现已活化，可用于细胞样品的加载。将含有酵母细胞悬液的电镜载网通过玻碳冷冻技术在液态乙烷中快速玻璃化冷冻，使用Vitrobot仪器完成该过程。液态乙烷的制备是通过将乙烷气体导入由液氮冷却的金属杯中实现液化的。在Vitrobot气候腔内，用滤纸从载网背面吸去多余液体，同时用不粘性塑料片从正面碳膜侧轻轻压平。Vitrobot腔内的温度设定为18°C，湿度为100%。在Vitrobot屏幕上设置等待时间、吸滤时间和吸滤力度。使用Vitrobot专用镊子夹取经辉光放电处理的载网，并将其安装至仪器上。向载网的碳膜面加入3.5微升酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞悬液。每次加样前需确保细胞悬液充分混匀。随后将载网迅速投入液态乙烷中进行玻璃化冷冻。完成玻璃化的电镜载网可在液氮环境中保存，或装入载网盒中，准备载入冷冻扫描电镜（cryo-SEM）显微镜。将带有玻璃化细胞的载网固定于适用于扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）的载网盒中。将C型夹环安装至夹持工具上，并在液氮中预冷。将载网放入载网盒，碳膜面朝下，用C型夹环固定。随后将样品放入专用的载网储存盒中。用于薄片（lamella）制备的样品被装载至双束FIB/SEM显微镜，并配备冷冻载台。样品准备腔的装载杯需充分冷却并注入液氮。将称为“转移 shuttle”的样品台放入系统中并同步冷却。将装有样品的载网盒从储存杜瓦瓶转移至装载杯中，并将载网插入shuttle的两个插槽内，确保细胞所在的碳膜面朝上。若使用FIB专用载网盒，应仔细将载网盒的缺口对准shuttle的12点钟方向。用螺丝固定载网后，将shuttle翻转至装载位置。将装载杯放入转移站并盖上盖子。将带有装载杯的转移腔置于盖子上方，并抽至低真空。将装有载网的shuttle固定在转移杆上，封闭于小型转移腔内。转移腔与准备腔连接后继续抽至高真空，随后将shuttle插入冷冻载台。将样品台倾斜至45度，并移动至载网中心位置。启动气体注入系统的针头，在生物样品表面沉积一层有机保护层，以减少聚焦离子束（FIB）铣削过程中的辐射损伤。随后对载网进行溅射镀膜，覆盖一层无机金属薄膜，以在生物材料表面形成导电层。对细胞簇或单层细胞中的薄片（lamella）进行聚焦离子束铣削，分多个步骤完成。将样品台移至铣削角度位置，找到目标区域，并设定上下铣削图案。采用逐步降低FIB电流和铣削深度的方式粗铣出薄片。最终的抛光步骤仅使用上部铣削图案和低FIB电流，以避免薄片前端损伤及表面“帘状效应”（curtaining effect）。在铣削过程中，电子束用于实时监测铣削进展。此处展示的是最终抛光完成的薄片。薄片的最终厚度需小于250纳米，以确保其对透射电子束具有足够的通透性。图示展示了在细胞簇和单层细胞中铣削薄片的示意图，以及两种样品类型的优缺点。完成铣削的载网需极其轻柔地从准备腔转移回装载杯。装载杯需重新冷却并注入新鲜洁净的液氮，以避免铣削后的薄片受到冰晶污染。将载网从shuttle中取出，放回载网储存盒。最终，将含有铣削薄片的样品转移至冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）。在插入TEM自动进样盒前，需将载网旋转90度，以确保薄片相对于TEM的倾斜轴处于正确取向。在TEM中对薄片进行筛选，定位用于采集冷冻电子断层扫描数据的目标区域。薄片的主轴应垂直于显微镜的倾斜轴，以便在高倾角下获得理想的视野。采用剂量测定法（dosimetric method）采集冷冻电子断层扫描数据。所获得的断层图像（tomogram）随后在Etomo软件中进行处理，单层结构在Amira软件中进行分割。在本实验方案中，我们向您展示了如何高效地利用冷冻聚焦离子束铣削技术制备酵母细胞样品的薄片，以及如何进行电子断层扫描数据的采集与处理。

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样品制备与冷冻聚焦离子束微加工酿酒酵母用于冷冻电子断层扫描

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