运动模式分析 喇叭虫 使用细胞追踪技术观察口器再生过程中及再生后的变化
2021年4月26日
我们介绍了一种利用明场显微镜和细胞追踪技术对数百个微米至毫米级细胞群体的运动性和行为进行表征的实验方案。该检测方法揭示了Stentor coeruleus在再生缺失的口器结构过程中会经历四个行为上截然不同的阶段。
长期以来，喇叭虫（Stentor coeruleus）被用作研究单细胞再生的模式生物。尽管其形态学再生的时间进程已为人所知，但功能再生的时间进程仍不清楚。本实验通过追踪处于同步化再生过程中的中心群体的运动能力，以定量分析功能丧失后的恢复情况。
该方法可适用于其他细胞类型。成像室密封不严会导致孔间液体泄漏或孔内产生气泡。对于不熟悉硅胶间隔垫使用的研究人员，我们强烈建议在使用前向每个孔中加入PSW或其他清洁介质，以检测是否存在泄漏。
样品室的构建过程用图示比文字描述更直观，从采集的视频数据中提取运动模式的过程也是如此。首先，裁剪一块250微米厚的硅胶间隔片，其高度和宽度均略小于载玻片。
使用打孔器制备圆形孔洞，相邻孔之间需留出足够空间以确保良好的密封性。通过将蓝色喇叭虫细胞在10%蔗糖或2%尿素中孵育两分钟，以启动口器的再生。随后用新鲜培养基洗涤三次。
轻轻吹打，将约10个喇叭虫分装至每个孔中。注意尽量使样品体积与孔的容积相匹配。从盖玻片的一边开始，轻轻将其覆盖在孔上，以封闭各孔。
使用窄而略带弹性的物体（如10微升移液器吸头）按压盖玻片与硅胶片接触的区域，以确保形成良好的密封。将样品置于显微镜载物台上，将显微镜调至最低可用放大倍数，使一个孔刚好充满整个视野。开始延时成像，并以每秒30帧的速度对每个时间点的每个孔采集10秒的视频。
为进行校准，请使用与视频相同的放大倍数设置，获取校准片或清晰直尺的图像。利用任意图像查看软件，测量已知物理距离的标记之间的像素数量。下载两个脚本，追踪细胞，并将清理后的轨迹保存至计算机上易于记忆的位置，同时将数据视频也传输至该计算机。
将数据视频按时间点分别组织到不同的文件夹中，每个时间点对应一个文件夹。通过打开“track cells”并运行脚本“Choose add to path”来执行数据视频中的自动细胞追踪；当弹出窗口提示时，选择“添加到路径”，此提示通常仅在从某个文件夹首次运行该脚本时出现。
当系统提示时，选择一个或多个数据视频以开始追踪。导航至数据视频文件，确认文件列表无误后，点击“打开”。若需手动剔除异常或错误的轨迹，请通过双击文件在 MATLAB 编辑器窗口中打开清理后的轨迹。在提示符下选择由“track cells”生成的数据文件夹输出结果。
导航至一个已创建的文件夹并选择它。当系统提示时，输入 1 以保留轨迹，输入 0 以拒绝该轨迹。然后按回车键继续处理下一个轨迹。
首先下载名为 spaghetti plots 的脚本。打开并运行该脚本。当文件浏览器窗口弹出提示时，选择要打开的文件夹。
导航至其中一个时间点的文件夹。当提示输入校准值时，每毫米对应的像素数量是多少？输入校准值，然后按回车键。
如有需要，通过修改脚本的第55行来调整图表的坐标轴，该行默认设置为RR等于4，以包含最大四毫米的半径。保存图表。
结果显示了喇叭虫细胞群体在口器再生过程的第2、3、7和8小时的集体运动性。这些图谱不仅显示了运动个体数量的预期增加，还显示了群体中运动最快细胞的活动范围增加了四倍。如果运动最快的细胞起始位置靠近边缘，则其无法完全沿直线游动，其运动范围显得更小。
将裂殖细胞分为三类：无运动能力且无可见附着物的细胞、无运动能力但有可见附着物的细胞，以及具有运动能力的细胞。结果显示，随着时间推移，再生过程中这三类细胞的相对数量以堆叠直方图形式呈现。在后期时间点，大量细胞出现在具有可见附着物的克隆中，强烈表明这些细胞已探索过周围环境，并优先靠近同类细胞进行附着。
选择适合喇叭虫（Stentor coeruleus）的样品孔尺寸非常重要，因为这种生物体大小约为一毫米。这包括直径为5/16英寸的硅胶垫片厚度，以及每孔10个细胞。在将本方案用于其他细胞类型时，这些数值应相应调整。
该实验可与RNA-I联合进行，以研究和比较不同喇叭虫表型的再生能力。
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概述
本文介绍了一种用于量化Stentor coeruleus在口器（OA）再生过程中运动能力的检测方法。通过同步化再生过程并随时间追踪细胞运动，该方案可对单细胞模式生物的功能恢复及行为变化进行详细分析。该方法结合了定制的成像腔室、延时显微成像和自动化视频分析，能够在大量细胞群体中提供可靠的运动性统计数据。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 再生生物学
- 单细胞生物的行为分析
背景
- Stentor coeruleus 是研究单细胞再生的经典模型。
- 尽管形态学上的再生时间线已较为明确，但功能恢复的时间线仍不甚清楚。
- 转录组学研究揭示了再生过程中复杂的基因调控，提示存在系统的细胞重编程。
- 目前亟需建立定量检测方法，以将基因表达阶段与行为变化关联起来。
研究目的
- 开发并演示一种用于定量分析S. coeruleus在OA再生过程中运动能力的检测方法。
- 捕捉再生期间运动变化的时间尺度和统计特征。
- 提供一种可适应于其他细胞类型运动表型筛选的工具。
使用的方法
- 使用硅胶垫片和盖玻片构建定制成像室，以形成密封的孔室。
- 通过将细胞在10%蔗糖或2%尿素中孵育，随后进行洗涤，诱导OA再生。
- 采用低倍显微镜在设定的时间间隔进行延时视频采集。
- 利用定制的MATLAB脚本进行自动细胞追踪和轨迹清理。
- 对细胞运动状态进行分类，并对随时间变化的群体行为进行统计分析。
主要结果
- OA 丢失后，S. coeruleus 最初会失去定向运动能力。
- 诱导后约 4 至约 8 小时，观察到游泳速度显著下降。
- 随着再生过程的进行，运动模式和运动范围逐渐增加，运动性最强的细胞其运动范围增加了四倍。
- 细胞被分为非运动型（有或无固着器）和运动型两类；后期时间点显示出更高的菌落形成能力和环境探索行为。
结论
- 该检测方法为研究单细胞生物的功能性再生提供了定量框架。
- 运动性的变化与再生阶段相关，并可与潜在的基因表达动态相联系。
- 该实验方案可适用于其他细胞类型，并可与RNAi等遗传干扰方法结合使用。
常见问题
行业重要性概述
对Stentor coeruleus口器再生过程中的运动性进行定量分析，能够实现细胞恢复的功能表型鉴定，有助于在早期发现阶段降低机制性风险。该检测方法提供了一个可扩展的平台，将基因表达动态与可观测的行为输出相联系，从而提高靶点验证和表型筛选的预测可信度。其对其他细胞类型的适用性使其成为跨项目研发工作的可重复利用能力。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 可在靶向干扰后实现对功能恢复时间进程的探究。
- 通过量化基因调控阶段的表型结果，支持生物学风险降低。
- 有助于建立将分子事件与可观察的细胞行为关联起来的预测信心。
- 为不同遗传背景或干预措施间的比较分析提供平台。
筛选与检测方法开发
- 为高通量表型筛选提供标准化、定量的运动性指标。
- 能够在大规模细胞群体中实现运动状态的可重复分类。
- 支持检测方法的可扩展性，并可适配多种单细胞或小型多细胞模型。
- 为下游功能或遗传筛选工作流程准备经过验证的生物系统。
转化与临床前研究
- 将功能表型分析与转录组学和分子数据相结合，以实现转化研究的连续性。
- 通过量化恢复情况和行为终点指标，支持基于风险评估的推进决策。
- 在临床前模型的选择与验证中，支持机制层面的风险降低。
流程与工作流整合
该运动性追踪实验可融入从早期假设验证到表型筛选及临床前模型验证的整个发现流程。
- 发现生物学：量化与基因表达阶段相关的功能恢复和行为变化。
- 筛选：提供可重复的定量运动性输出，用于比较分析。
- 分析：生成统计读数和群体水平的运动性分布，以实现可靠的条件比较。
- 转化研究：整合分子与表型数据，为临床前模型选择提供依据。
- 企业级复用：可灵活调整的实验方案支持在多种细胞类型和遗传背景下广泛应用。
运营与企业影响
- 科学价值：提高功能恢复研究中预测的可信度，并减少机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化运动表型分析，实现可扩展且可重复的数据生成。
- 战略价值：通过关联分子与行为终点指标，为决策提供依据，提升资金使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的优先级排序及跨项目推进决策。
实施注意事项
- 需要具备细胞操作、成像和定量数据分析方面的专业知识。
- 需要具备延时显微镜设备以及用于自动追踪的计算基础设施。
- 要求跨团队统一成像腔室的构建方法和数据处理脚本。
- 应用于其他细胞类型时，可能需要优化孔径尺寸和细胞密度。
- 确保腔室密封牢固至关重要，以防止技术性干扰并保证数据质量。
