在微加工微流控平台中构建简化的三维皮肤芯片模型

本研究提出了一种新型的无光刻技术方案，用于构建基于微加工粘性乙烯基材料和并行流动方法生成真皮区室的三维皮肤芯片模型。微加工乙烯基材料简化了器件的制备过程，并提高了结构布局的灵活性，克服了传统聚二甲基硅氧烷（PDMS）和光刻技术的一些局限性。该多层皮肤芯片可用于药物和化妆品测试，因其支持高通量筛选且成本较低，还可用于多种疾病的建模研究。

首先使用 Brother Canvas Workspace 软件设计一款微流控芯片。创建一个 30 厘米 × 30 厘米的工作区域，并在其中填入芯片各层的设计图案，然后将其保存为 svg 文件。接着裁剪 30 厘米 × 30 厘米的乙烯基薄膜。

将其贴在低粘性粘性垫上，并根据需要排除所有气泡。使用U盘将svg文件上传至边缘绘图仪，设置切割参数：切割压力为0级，切割刀片为3级，切割速度为1级。参数设置完成后，将带有乙烯基材料的粘性垫放入绘图仪中，开始在95微米厚的乙烯基材料上切割通道图案。

使用对准器组装整个装置，以正确调整通道、入口和出口。将乙烯基层按相应的微机械设计堆叠，组装下层通道，保留底层的覆盖胶带以避免粘附到对准器上。将聚碳酸酯多孔膜切割并放置在下层通道的上方，注意不要覆盖入口。

添加10层带有上腔设计的乙烯基层，并在顶部粘贴一层双面胶带作为最外层。将芯片从对准器上取下，粘贴到玻璃载片上。在双面胶带乙烯基层的上方放置一层厚度为2毫米的PDMS片。

为确保芯片完全密封，需在芯片上方放置重物过夜。次日，先用70%乙醇冲洗芯片5分钟，再用蒸馏水洗涤，以对芯片进行灭菌。将泵一和泵二分别连接至上方腔室入口一和上方腔室入口二。

将泵三连接至下腔室的入口，然后将上腔室和下腔室的出口连接至废液管。使用PTFE管和18号不锈钢接头将注射器连接至各个入口。通过泵三以50 µL/min的流速经下腔室入口泵入PBS，同时通过泵二以100 µL/min的流速经上腔室入口二泵入PBS。

然后，用纤维蛋白原预凝胶装填注射器，立即放入泵一中，并以200微升/分钟的速度运行。当预凝胶从上腔出口流出后，停止泵一和泵二，随后在不移除管路的情况下，将芯片置于37摄氏度环境中静置10分钟以完成凝胶化。凝胶化完成后，用封帽封闭上腔入口一，并通过泵三以50微升/小时的速度经上腔入口二泵入培养基，过夜培养。

在构建真皮隔室24小时后，检查人原代成纤维细胞是否已在装置内均匀分布，然后通过上层通道入口二以每分钟40微升的速度，分五次将每毫升含10的6次方个HKCs的细胞悬液注入，每次持续1分钟。为促进细胞贴壁，将芯片置于37摄氏度、湿度饱和的培养箱中过夜。随后仅通过下层腔室入口，使用泵三以每分钟50微升的速度开始泵入新鲜培养基。

在代表性分析中，显示了水凝胶沿装置上腔室的高度。对于牺牲性 PBS 和预凝胶，分别在 100 和 200 微升/分钟的流速下，550 微米的平均高度最适合凝胶的功能发挥。若未通过下层通道充分冲洗 PBS，则会导致凝胶理论高度与实测高度之间出现差异，差异可达 40%。在启动平行流方案 24 小时后，发现人原代成纤维细胞成功地在装置上腔室的纤维蛋白凝胶中铺展，随后可将表达绿色荧光蛋白的 HKC 有效接种于水凝胶表面。

若未保持系统密闭过夜以使人角质形成细胞（HKCS）沉降，而在去除管路时操作，则会导致细胞形成不均匀且融合的单层。通过微流控芯片中对未分化皮肤模型进行三维共聚焦分析，可清晰观察到水凝胶表面将顶部的人角质形成细胞与底部包埋的成纤维细胞分隔开来。所构建的皮肤模型可暴露于气液界面，以获得成熟且分化的表皮，并可进一步利用多种真皮和表皮标志物进行表征。

该技术可实现更快且成本更低的器件制备，并利用微流控技术生成多层皮肤，为药物和化妆品测试提供更为真实的模拟方法。