Name: 用于下一代测序的基于磁珠的蚊子DNA提取协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 学习基于磁珠的DNA提取方法，用于埃及伊蚊单个个体的全基因组测序。该方案无需昂贵自动化设备，成本低廉，适合资源有限的实验室开展高通量测序和群体基因组学研究。

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我们感谢以下机构提供的经费支持：美国疾病控制与预防中心（CDC）资助的太平洋西南区域媒介传播疾病卓越中心（合作协议编号 1U01CK000516）、CDC 拨款 NU50CK000420-04-04、美国农业部国家食品与农业研究所（Hatch 项目 1025565）、佛罗里达大学/IFAS 佛罗里达医学昆虫学实验室授予陈哲宇（Tse-Yu Chen）的奖学金、美国国家科学基金会 CAMTech IUCRC 第二阶段拨款（AWD05009_MOD0030），以及佛罗里达州卫生部（合同编号 CODQJ）。本文作者的观点和结论并不代表美国鱼类及野生动物管理局的观点或立场。

1. DNA 提取前的样品常规储存与制备
<ol>
	<li>如果样本保存在 &#62;70% 酒精中，需在 4 °C 条件下用 100 µL PCR 级水水化 1 小时（或过夜），以软化组织。</li>
</ol>
2. 样品破碎
<ol>
	<li>将培养箱或振荡加热块设置为 56 °C。</li>
	<li>配制蛋白酶 K（PK）缓冲液/酶混合液。每个蚊虫样本提取需使用 2 µL 蛋白酶 K（100 mg/mL）和 98 µL 蛋白酶 K 缓冲液（共 100 µL）。若为多个样本配制总混合液，应将总体积（所有样本合计）增加约 15%，以确保足量供应。</li>
	<li>若样本在提取前已进行水化处理，需弃去各样本管中的水分。</li>
	<li>在含有蚊虫组织的 1.5 mL 微量离心管中，加入 100 µL PK 缓冲液/酶混合液。</li>
	<li>使用微量离心管研杵匀浆组织。</li>
	<li>在室温下以 9,600 × g 离心样品 1 分钟。</li>
	<li>在 56 °C 下孵育样品 2–3 小时。</li>
	<li>孵育期间，使用 DNA 提取步骤（步骤 3）准备其他试剂。</li>
</ol>
3. DNA 提取
<ol>
	<li>配制磁珠主混合液。每个样本加入100 µL裂解缓冲液、100 µL异丙醇和15 µL磁珠（总计215 µL）。若需为多个反应配制主混合液，总量应增加约20%（所有样本总量之和），以确保体积充足。</li>
	<li>孵育时间结束后（步骤2.7），用移液器将每个裂解液转移至洁净的微量离心管或微孔板孔中。</li>
	<li>向每个样本中加入100 µL裂解液和215 µL磁珠主混合液。</li>
	<li>用移液器充分混匀10–20秒，室温静置10分钟。期间可轻轻振荡管子，以最大限度促进磁珠与DNA的结合。</li>
	<li>将管子或微孔板置于磁珠分离器上，静置至溶液澄清。</li>
	<li>用移液器弃去管或板中的液体。去除上清液时，尽量避免接触或扰动吸附有DNA的磁珠。</li>
	<li>将管或板从磁珠分离器上取下，向每个孔中加入325 µL洗涤缓冲液1。</li>
	<li>通过移液充分混匀，并在室温下孵育1分钟。</li>
	<li>重复步骤3.5–3.6。</li>
	<li>将管或板从磁珠分离器上取下，向每个孔中加入250 µL洗涤缓冲液1。</li>
	<li>通过移液充分混匀，并在室温下孵育1分钟。</li>
	<li>重复步骤3.5–3.6。</li>
	<li>将管或板从磁珠分离器上取下，向每个样本中加入250 µL洗涤缓冲液2。</li>
	<li>充分混匀，并在室温下孵育1分钟。</li>
	<li>重复步骤3.5–3.6。</li>
	<li>将管或板从磁珠分离器上取下，向每个孔中加入250 µL洗涤缓冲液2。</li>
	<li>充分混匀，并在室温下孵育1分钟。</li>
	<li>重复步骤3.5–3.6。</li>
	<li>将管或板从磁珠分离器上取下，向每个孔中加入100 µL洗脱缓冲液。</li>
	<li>充分混匀，并在室温下孵育2分钟。</li>
	<li>将管或板放回磁珠分离器上，静置至溶液澄清。</li>
	<li>用移液器将上清液转移至新的洁净0.5 mL微量离心管或微孔板孔中。</li>
	<li>将DNA样本储存于4 °C（最多1周）或-80 °C。&#160;若使用微孔板，需用封口膜密封。</li>
	<li>采用合适的方法测定DNA得率。 
	注：本研究中使用了DNA荧光计读数及260/280 nm处的吸光度检测。</li>
</ol>

<ol><li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314(2015).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473(2019).</li>
<li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li>
<li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).</li>
<li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211(2016).</li>
<li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li>
<li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S%C3%A3o+Tom%C3%A9+island%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li>
<li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+%28Howardina%29+busckii+and+Aedes+%28Ochlerotatus%29+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li>
<li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案可适用于其他昆虫物种。Nieman 等人1首次提出的原始方案已在多个物种中进行过测试，包括 Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta 和 Keiferia lycopersicella2,8,9,<sup class="xre...

近期改进的DNA提取方案1的发展使得许多高影响力的下游研究成为可能，这些研究涉及全基因组测序2,3,4,5,6。这种基于磁珠的DNA提取方案可从单个蚊虫样本中稳定获得DNA，从而减少了从野外采集样本中获取足够数量样本所需的成本和时间。
群体基因组学和景观基因组学的最新进展与全基因组测序成本的降低直接相关。尽管先前的DNA提取方案1提高了高通量测序的效率，但缺乏资金的小型实验室或研究项目可能因实施该方案的成本（例如，专用仪器的费用）而无法使用这些强大的景观和群体基因组学工具。
本文介绍了一种改良的DNA提取方案，该方案采用与Neiman等人1相似的磁珠提取步骤以获得高纯度DNA，但无需依赖高成本仪器进行组织裂解和DNA提取。本方案适用于需要&#62;10 ng高质量DNA的实验。

<table><tbody><tr><td>AE 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>19077</td><td>洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>AL 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td>裂解缓冲液</td></tr><tr><td>AW1 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>19081</td><td>洗涤缓冲液 1</td></tr><tr><td>AW2 缓冲液</td><td>Qiagen</td><td>19072</td><td>洗涤缓冲液 2</td></tr><tr><td>MagAttract Suspension G</td><td>Qiagen</td><td>1026901</td><td>磁珠</td></tr><tr><td>磁珠分离器</td><td>Epigentek</td><td>Q10002-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td>微量分光光度计</td></tr><tr><td>PK 缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>4489111</td><td>蛋白酶 K 缓冲液</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>ThermoFisher</td><td>A25561</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>荧光计</td></tr></tbody></table>

一种基于磁珠的蚊虫dna提取方案及其在下一代测序中的应用

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

最近发表的一种使用磁珠和自动化DNA提取仪器的DNA提取方案表明，可以从保存良好的单只蚊虫中提取出高质量和高产量的DNA，足以用于后续的全基因组测序。然而，依赖昂贵的自动化DNA提取仪器对于许多实验室而言可能难以承受。本研究提供了一种经济实惠的基于磁珠的DNA提取方案，适用于低至中等通量的样本处理。该方案已使用单只埃及伊蚊（Aedes aegypti）蚊虫样本成功验证。降低高质量DNA提取的成本将有助于在资源有限的实验室和研究中更广泛地应用高通量测序技术。

使用荧光计测量，每只蚊虫头胸部组织的平均DNA产量为4.121 ng/µL（N = 92，标准差3.513），洗脱体积为100 µL洗脱缓冲液。该产量足以满足全基因组文库构建所需的10–30 ng基因组DNA投入量1,7。DNA产量可在0.3–29.7 ng/µL之间变化，具体取决于蚊虫体型大小和保存条件。部分高变异性源于本研究中所用磁珠的特性。如先前报道所述，不同品牌的磁珠可能产生更一致的浓度1。还应注意，不同蚊种在体型上存在差异，DNA产量与个体及物种的体型范围相关。如果DNA浓度低于典型范围，可调整蛋白酶K反应中的孵育时间（步骤2.7），但延长孵育时间不应超过16小时。此外，更换蛋白酶K和/或裂解缓冲液的品牌可能对DNA产量产生显著影响1。
最终DNA在含有0.5 mM EDTA的洗脱缓冲液中的典型微量荧光仪读数如图1</s...

本文介绍了一种利用磁珠提取蚊虫DNA的方案，可获得高质量的DNA提取物。这些提取物适用于后续的高通量测序分析。

一种基于磁珠的蚊虫DNA提取方案及其在下一代测序中的应用

一种最近发表的使用磁珠和自动化DNA提取仪器的DNA提取方案表明，有可能提取出高质量的……

这种经济实惠的基于磁珠的DNA提取方案使资源有限的实验室和研究项目能够开展高通量测序。该方案无需昂贵设备即可获得高质量DNA，在某些诊断或研究情况下尤为有用，特别是在难以获取足量且适用于高通量测序质量要求的DNA时。本方案易于复制，仅需一次演示即可掌握。应首先使用少量样本进行尝试，以熟悉操作流程。开始时，将保存在70%以上酒精中的蚊虫组织样本用100 µL PCR级水水化，在4 °C下孵育1小时，以软化组织。孵育结束后，弃去水溶液，加入100 µL蛋白酶K缓冲液酶混合液。然后使用微量离心管研杵匀浆组织。匀浆后，离心组织裂解液，并在56摄氏度下孵育两到三小时。为提取DNA，将100 µL组织裂解液用移液器转移至新的洁净微量离心管中。然后加入215 µL磁珠主混合液。使用移液器将裂解液与磁珠混合液轻轻吹打10至20秒，随后在室温下静置10分钟。在孵育期间，可偶尔轻轻振荡离心管，以最大限度促进DNA与磁珠的结合。接下来，将离心管置于磁珠分离器上，直至溶液变澄清。然后使用移液器轻轻吸出管中的液体，注意不要扰动吸附DNA的磁珠。将离心管从磁珠分离器上取下，加入325 µL洗涤缓冲液一，洗涤磁珠。用移液器充分混匀，在室温下孵育1分钟。孵育结束后，将离心管置于磁珠分离器上，按先前所示方法吸除上清液，然后将离心管从磁珠分离器上取下，用洗涤缓冲液一洗涤磁珠一次。第二次使用缓冲液一洗涤后，以相同方式用250微升洗涤缓冲液二洗涤磁珠两次。最后一次洗涤后，将离心管从磁珠分离器上取下，加入100 µL洗脱缓冲液。用移液器充分混匀，室温孵育2分钟，然后将离心管放回磁珠分离器上。待溶液变澄清后，将上清液转移至新的洁净0.5 mL微量离心管中，并妥善保存。此处显示的是含有 0.5 毫摩尔 EDTA 洗脱缓冲液中蚊子 DNA 的典型微量荧光计读数。260 至 280 纳米的平均吸光度比值为 2.3。此表格展示了不同提取方法在一天工作时间内处理的样本数量及相应成本。按照本方案进行一次提取所需的试剂和耗材成本约为每样本9.50美元。该成本与任何典型的基于磁珠的提取方法相当。本方案的主要成本优势在于无需使用自动DNA提取仪器。处理多个样本时，务必在样本之间更换移液器吸头，以防止 DNA 交叉污染。我们使用本方法提取的高质量 DNA 进行全基因组测序。目前正利用测序数据鉴定在公共卫生和疾病防控中具有重要意义的杀虫剂抗性或免疫相关基因中的新突变。低成本的高通量测序解决方案为群体基因组学和景观基因组学研究开辟了令人振奋的前景，这些研究旨在理解蚊虫的扩散和基因流动，而这些因素会影响多种新型遗传控制策略的成功。

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生物学

用于下一代测序的基于磁珠的蚊子DNA提取协议

本文介绍了一种快速且经济的方法，用于从蚊虫标本中提取高质量的疟原虫及媒介DNA。该方法利用Chelex树脂的螯合特性，可简便地对蚊虫中肠和唾液腺阶段的疟原虫进行基因分型，同时通过PCR实现对Anopheles复合种的分子鉴定。...

一种简易的Chelex法从按蚊属（Anopheles spp.）中提取DNA

开发了一种核糖体RNA（rRNA）去除方案，用于富集蚊虫肠道元转录组RNA测序中的信使RNA（mRNA）。该方案利用来自蚊虫及其肠道微生物的样本特异性rRNA探针，通过扣除法去除rRNA。该方案的实施效果可实现约90-99%的rRNA去除率。...

蚊虫肠道宏基因组RNA-seq中核糖体RNA的去除

染色体涂染是研究细胞核结构和核型进化的一种有用方法。本文演示了一种从单条多线染色体中分离并扩增特定目标区域的方法，所获得的材料随后用于二维和三维荧光 原位...

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本方案提供了从DNA提取到数字液滴PCR（ddPCR）实验建立的完整步骤，包括在gRNA引导的Cas9切割及DNA修复后，对靶位点处非同源末端连接（NHEJ）事件进行鉴定与定量的分析方法。该方法的其他应用还包括多态性检测和基因编辑变异体验证等。...

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本方案表明，珠击法结合DNA捕获磁珠纯化可快速、稳定地从结核分枝杆菌（Mycobacterium...

使用定制缓冲液结合珠磨法提取分枝杆菌DNA并进行下一代测序工作流程

我们提出了一种优化的DNA提取方法，该方法采用基于基质的提取法结合磁珠纯化技术，从去污染的痰液样本中提取DNA，用于后续对结核分枝杆菌（Mycobacterium...

基于基质的DNA提取用于污染清除痰液样本的靶向下一代测序

学习基于磁珠的DNA提取方法，用于埃及伊蚊单个个体的全基因组测序。该方案无需昂贵自动化设备，成本低廉，适合资源有限的实验室开展高通量测序和群体基因组学研究。

一种基于磁珠的蚊虫DNA提取方案及其在下一代测序中的应用

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