µTongue：一种基于微流控技术的舌功能成像平台 在体 内

本方案可在神经连接和血液循环保持完整的自然微环境中观察味觉细胞的功能。利用该技术，可进行体内细胞间通讯的研究。首先，用人工唾液和味觉刺激物填充加压流体灌注系统的储液器。

将压缩空气管路连接至调压阀入口，并将流体输送系统中的气压设定为30至50磅每平方英寸。将调压阀的输出压力设为0.4磅每平方英寸，检查液体是否开始从管路中流出。将储液器的歧管连接至微舌装置的进样口，再将微舌装置的出样口连接至注射泵，以约300微升每分钟的速度抽吸液体，以建立稳态条件。

确认悬挂在微舌下方的液滴体积保持恒定，并调节空气压力和流速以获得所需的样品高度。微流控系统设置完成后，断开压缩空气管路并关闭注射泵，直至小鼠准备好进行活体成像。对小鼠实施麻醉后，通过眶后静脉注射TRITC-葡聚糖，以便在成像过程中观察血液循环。

将小鼠置于仰卧位后，用70%乙醇喷洒其头部。用镊子轻轻提起头部皮肤，然后用剪刀剪去约七平方毫米的皮肤。清理头皮周围的毛发后，从皮肤下方去除骨膜，并在颅骨上涂抹速干胶。

然后安装定制的头部固定器。待瞬干胶凝固后，在头部固定器周围涂抹牙科胶，并用蓝光照射使其固化。使用瞬干胶将小鼠的下唇粘附至微型舌托的底座单元上，随后将小鼠放置于小鼠固定板上，并通过将微型舌托边缘的孔与固定柱对齐，将底座单元固定在固定柱上。

将小鼠头部固定器拧紧至板上的头部固定器支架，并调整小鼠头部与设备之间的距离。然后利用头部固定器支架，将小鼠头部平稳旋转约45度。将小鼠固定在板上后，使用塑料镊子轻轻拉出其舌头。

然后使用瞬干胶将舌头的腹侧粘附到微型舌装置底座单元的上侧。为保持舌头湿润，用湿润的棉签擦拭其表面，随后在舌头暴露的表面放置一片浸有人工唾液的组织。将弧形垫圈放在柱上，固定微型舌的底部，然后将小鼠标本移至显微镜载物台。

将小鼠暴露的舌头置于显微镜物镜区域的近似中心位置，注意不要超出载物台的动态范围，然后拧紧螺丝，将小鼠固定板牢固地固定在载物台上。在小鼠身体下方放置加热垫，以维持其体温在36.5至37.5摄氏度之间。为防止液体进入小鼠气管，将一小条卷曲的纸巾放入小鼠口腔内，随后移除舌头上表面放置的湿润组织，将制备好的微型舌片置于小鼠舌头上，使舌头表面可通过成像窗口清晰可见。

通过轻轻拧紧微舌装置的两端并施加最小的压缩压力来固定装置。开始采集图像时，先打开显微镜软件，然后开启920纳米的双光子激光器。将水浸物镜安装到显微镜上，随后将物镜缓慢下降至微舌装置的成像窗口，并将物镜浸入其中。

在相机模式下，打开汞灯的蓝光以照射舌面。通过调节Z轴并寻找丝状乳头的自发荧光信号，来确定大致的焦平面。然后使用X轴和Y轴调节旋钮，定位一个味蕾。

切换至多光子模式，然后设置激发波长、发射滤光片组、扫描模式和图像采集的帧尺寸。以味蕾为中心，在成像窗口中定位位于味蕾约三分之二高度处的周围血管，并观察血液流动情况。若血流受阻，可轻微松开固定螺丝以恢复血流。

调整Z轴以找到含有足够数量味觉细胞的味蕾所在的Z平面，然后以每秒2至6赫兹的频率进行80秒的钙成像。成像开始后，打开流体系统的储液器，提供味觉溶液持续20秒。味觉刺激20秒后，将储液器切换回人工唾液。

成像过程中，每次间隔约三到四分钟，持续提供人工唾液以保持舌面湿润，并清除前一次实验残留的味觉刺激物。Pirt-GCaMP6f-tdTomato 小鼠的舌表面分布有自发荧光的丝状乳头和稀疏的味蕾。使用光电探测器在 500 至 550 纳米波长下捕获呈黄色的丝状乳头，可在舌表面至约 25 微米深度范围内观察到。

通过500至550纳米滤光片检测到的绿色GCaMP信号和通过607至670纳米滤光片检测到的红色tdTomato信号代表味觉细胞。tdTomato信号用于比率测定分析。围绕味蕾的血管使用500至550纳米滤光片组获取，而为味蕾提供结构支持的胶原结缔组织则使用447至460纳米滤光片组获取。

在此利用钙成像技术进行体内味觉筛选的代表性示例中，每个味觉细胞均以虚线标出边界。在本实验中，细胞2对甜味和鲜味刺激物均有响应，而细胞3对低盐和高盐刺激物均有响应。

该味蕾中的细胞均未对酸味产生反应。由于本实验的目的是观察味觉细胞在自然环境中的功能，因此在制备阶段将荧光物质注入血管，并在实验过程中确认其循环至关重要。