Name: μTongue:一个基于微流体的功能成像平台，用于在Viva的舌头 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 了解基于微流体的µTongue平台用于活体小鼠舌部味觉细胞功能成像的完整方案。该技术可在保留神经连接和血液循环的天然微环境中，通过双光子显微镜和钙成像实时观察甜味、鲜味和咸味刺激下的细胞反应。

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本工作由基础科学研究所（IBS-R015-D1）、韩国国家研究基金会（NRF）在韩国政府（MSIT）资助下提供的项目（编号：2019M3A9E2061789）以及韩国国家研究基金会（NRF）在韩国政府（MSIT）资助下提供的项目（编号：2019M3E5D2A01058329）支持。我们感谢Eunsoo Kim和Eugene Lee提供的技术协助。

所有外科手术均经成均馆大学和首尔国立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 溶液制备：人工唾液和味感物质
<ol>
	<li>通过将 2 mM NaCl、5 mM KCl、3 mM NaHCO3、3 mM KHCO3、0.25 mM CaCl2、0.25 mM MgCl2、0.12 mM K2HPO4、0.12 mM KH2PO4 和 1.8 mM HCl 溶解于蒸馏水（&#62;1 L）中来制备人工唾液，并将溶液 pH 调整至 7（见材料表）12。</li>
	<li>制备味觉刺激物，例如：酸味：10 mM 柠檬酸；咸味：400 mM NaCl，可选添加 50 µM 阿米洛利；甜味：40 mM 安赛蜜钾；苦味：5 mM 奎宁、5 mM 苯甲地那铵和 20 µM 环己酰亚胺的混合物，将上述呈味化学物质溶解于步骤 1.1 制备的人工唾液中。</li>
</ol>
2. 微流控系统的准备
注意：味觉刺激物通过加压多通道流体递送系统递送至小鼠舌面（参见图1和材料表）。
<ol>
	<li>向加压流动灌注系统的储液罐中加入人工唾液和味觉刺激物。</li>
	<li>将压缩空气管路连接至调压阀入口，并在流体输送系统中将气压设定在 30 至 50 psi 之间。</li>
	<li>将调压阀的输出压力设为 0.4 psi，并检查在此压力下是否有液体从管路中流出。</li>
	<li>将储液罐的多通管路连接至 µTongue 的输入端口。</li>
	<li>将 µTongue 的输出端口连接至注射泵，并以约 300 µL∙min-1 的速率抽取液体，以建立稳态条件。观察 µTongue 下方悬滴的体积是否恒定。根据样品高度调整设定参数的数值。</li>
	<li>断开压缩空气管路并停止注射泵，直至完成操作步骤 3。</li>
</ol>
3. 小鼠制备用于 体内 成像（图2).
注意：所有动物处理均在白天于实验室工作台上的无菌条件下进行。
<ol>
	<li>小鼠麻醉
	<ol>
		<li>准备一只7周龄或更年长的任一性别的小鼠。使用在味觉细胞中表达钙感应荧光蛋白的转基因小鼠品系。</li>
		<li>对小鼠进行固定以实施麻醉。通过腹腔注射方式向小鼠注射100 mg/kg的氯胺酮和10 mg/kg的赛拉嗪13。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过眶后途径将含有500 kDa TRITC-葡聚糖的2.5% W/V磷酸盐缓冲液静脉注射入小鼠体内，以便在成像过程中观察血液循环情况。</li>
	<li>将头部固定器连接至小鼠颅骨，以最大限度减少运动伪影。
	<ol>
		<li>将小鼠置于仰卧位，用70%乙醇喷洒其头部。用镊子轻轻提起头皮，用剪刀剪去约7 mm2的皮肤。</li>
		<li>清理头皮周围的毛发，去除皮下骨膜，在颅骨上涂抹速干胶，并安装定制的头部固定器。</li>
		<li>待速干胶固化后，在头部固定器周围涂抹牙科胶，并用蓝光照射使其固化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠舌头放置在µTongue的底座单元上。
	<ol>
		<li>使用速干胶将小鼠下唇固定在µTongue的底座单元上。</li>
		<li>将小鼠放置在实验板上（见图1B中的小鼠准备板），并将µTongue的底座单元套入定位柱（见图1B中的µTongue固定柱）。确保底座单元边缘的孔与定位柱对齐。</li>
		<li>将小鼠头部固定器拧紧至实验板上的固定器支架上，然后调整小鼠头部与设备之间的距离。通过固定器支架平稳地将小鼠头部旋转约45°，以避免小鼠鼻部与显微镜物镜发生物理接触。</li>
		<li>使用塑料镊子轻轻拉出小鼠舌头，并将其腹侧固定在µTongue底座单元的上表面。随后，用湿润的棉签擦拭小鼠舌头表面。</li>
		<li>将一小片纸浸入人工唾液中，并覆盖在暴露的小鼠舌头上，以维持湿润环境。</li>
		<li>将弧形垫片安装在支撑µTongue底座两端的定位柱上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将准备好的小鼠放置在显微镜载物台上。将暴露的小鼠舌头置于显微镜物镜区域的大致中心位置，确保不超出载物台的动态范围。然后，用螺丝将小鼠实验板牢固固定在载物台上。</li>
	<li>在小鼠身体下方放置加热垫，并将温度维持在36.5 °C–37.5 °C之间。使用温度传感器监测小鼠体温，并根据传感器的反馈信号调节加热垫的温度。</li>
	<li>将一小条纸卷成细条状，置于小鼠口部，以防止液体进入气管。</li>
	<li>从小鼠舌头上移除湿润组织，将准备好的µTongue放置在舌头上。将微流控通道置于舌头表面，并调整其位置，以便通过成像窗口观察舌面。</li>
	<li>通过在两端轻轻拧紧螺丝，以最小的压缩压力固定µTongue。</li>
</ol>
4. 成像采集
<ol>
	<li>提前开启920 nm双光子激光器和显微镜。</li>
	<li>将水浸物镜（16倍，数值孔径0.80 或 25倍，数值孔径1.1）安装到显微镜上。在µTongue的成像窗口滴加蒸馏水，并将物镜浸入其中。</li>
	<li>在相机模式下，打开汞灯光源并照射舌面。</li>
	<li>通过调节Z轴，寻找丝状乳头的自发荧光信号，以确定大致的焦平面。然后，使用X轴和Y轴调节旋钮定位一个味蕾。</li>
	<li>切换至多光子模式。设置图像采集条件如下：激发波长：920 nm；发射滤光片设置：447/60 nm、525/50 nm 和 607/70 nm；双向光栅扫描模式，帧尺寸：512 × 512。</li>
	<li>调整 X 和 Y 位置，使味蕾位于图像窗口的中心。</li>
	<li>在味蕾约三分之二高度处搜寻环绕味蕾的血管。通过第3.2步中TRITC-葡聚糖（500 kDa）注射观察血流循环。若血流受阻，可轻微松开固定螺丝以恢复血流。</li>
	<li>调节Z轴，找到含有足够数量味觉细胞的味蕾所在的Z平面。</li>
	<li>以2-6 Hz的频率进行80秒的钙成像。在成像开始后，通过打开流体系统的储液器提供20秒的味觉刺激溶液。味觉刺激20秒后，将储液器切换回人工唾液。</li>
	<li>完成连续成像后，提前等待约3-4分钟，以准备下一次成像。持续向小鼠舌面灌注人工唾液，以清除前次成像中残留的味觉刺激物。根据实验设计需要，重复进行成像操作。</li>
	<li>当 体内 钙成像完成后，按照IACUC规程对小鼠实施安乐死。在麻醉状态下，将小鼠置于CO2 腔室 
	&#8203;注意：使用脚趾夹捏反射检查麻醉深度。在成像过程中，应持续从储液器提供人工唾液。若在 µTongue 的成像窗口出现气泡，可通过施加较强的液体压力，将气泡从 µTongue 的输入端或输出端推出以清除。</li>
</ol>
5. 图像分析（图3）
<ol>
	<li>图像转换
	<ol>
		<li>使用 Fiji14 或类似的图像分析软件打开原始图像文件。</li>
		<li>将图像文件转换为 RGB 堆栈文件，以使用 NPL Bud Analyzer 代码。
		<ol>
			<li>图像 &#62; 颜色 &#62; 拆分通道</li>
			<li>图像 &#62; 颜色 &#62; 合并通道，并选择步骤 5.2.1 中的图像。</li>
			<li>图像 &#62; 颜色 &#62; 堆栈转 RGB</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像配准 
	注意：使用自定义编写的数据分析代码。请参考 https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer。
	<ol>
		<li>运行名为 Taste_GUI.m 的代码；将弹出一个名为 NPL Bud Analyzer 的图形用户界面（GUI）窗口。点击右上角的 新建分析 按钮，然后加载步骤 5.1 中转换后的图像。在加载的图像上方设置帧率。</li>
		<li>在加载的图像上绘制感兴趣区域（ROI）以进行配准。双击选定的 ROI，系统将自动开始计算配准。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取相对荧光强度变化（ΔF/F）
	<ol>
		<li>返回到 NPL Bud Analyzer 窗口，系统将自动显示步骤 5.2 中配准后的图像。如果用户已有 reg 文件，请点击“加载数据”按钮，并选择 _reg.tif 文件。</li>
		<li>点击 圆形 或 多边形 按钮，并在味蕾图像上定位味觉细胞的感兴趣区域（ROI）。</li>
		<li>系统将自动在味蕾图像下方显示所选味觉细胞的原始荧光强度和钙信号轨迹（ΔF/F）。</li>
		<li>点击 保存轨迹 按钮，将在 GUI 右侧显示钙信号轨迹（ΔF/F），同时在味蕾图像上显示 ROI。重复步骤 5.3.2–5.3.4，直至完成所有 ROI 的选择。 
		注意：如果 ROI 选择错误，可点击 删除轨迹 按钮，以移除最近一次选择的 ROI 和对应的钙信号轨迹。</li>
		<li>完成 ROI 选择后，在右下角输入文件名，然后点击 完成 按钮，导出 ΔF/F 钙信号轨迹为 .xls 格式，同时导出带有 ROI 的味蕾图像为 .bmp 格式。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>钙信号轨迹分析
	<ol>
		<li>分析步骤 5.3 所获得的钙信号轨迹。当施加味觉刺激物后，若荧光强度上升超过基线标准差的两倍以上4，且使用配对或非配对 t 检验得到的 p 值小于 0.01，则认为该味觉细胞对味觉刺激物产生了反应10。</li>
		<li>若某味觉细胞在三次试验中对特定味觉刺激物产生反应超过两次（约 60%）15，则将其视为响应细胞。</li>
		<li>通过平均步骤 5.4.1 中获得的单个钙信号轨迹，得到代表性钙信号轨迹。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li>
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<li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li>
<li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+anion+in+salt+%28NaCl%29+detection+by+mouse+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li>
<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

作者声明存在竞争性财务利益：J. Han 和 M. Choi 是本文所述专利技术 µTongue 的发明人，且 µTongue 系统通过 SciTech Korea 公司进行商业化销售。

本文介绍了一种应用µTongue技术研究味觉细胞功能活性的详细实验方案 体内本方案中，使用基因编码的钙指示剂对味觉细胞进行功能成像。除使用转基因小鼠外，还可通过电穿孔法将钙染料（或电压感应染料）导入味觉细胞，作为替代方案。
本实验中使用的所有味觉溶液的折射率均低于1.336。尽管µTongue能够提供稳定的流体输送，且比率分析可改善成像伪影，但研究人员若使用更高浓度的呈味物质（例如，折射率为1.338的&gt;100 mM蔗糖溶液）仍会面临挑战。人工唾液与味觉溶液之间较大的折射率差异会导致图像焦平面偏移超出后期图像处理的补偿范围。根据经验，已确定允许实时稳定细胞成像的味觉溶液折射率范围（低于1.336）。
对于具有荧光成像和动物操作经验的研究人员而言，通过反复练习可较快掌握本方案。然而，其中包含若干关键步骤，若处理不当常会影响数据的成功获取。首先，舌体一旦暴露于口腔外，应使用人工唾液保持其湿润，以维持天然的黏膜微环境。其次，味蕾周围的血液循环必须保持完整，以确保氧气、营养物质及血液携带因子的生理供应。

活体荧光显微镜被广泛用于研究活体组织中的时空动态。研究人员正在快速开发基因编码的传感器，这些传感器能够将生物过程特异性且灵敏地转化为荧光信号——这些信号可利用广泛可用的荧光显微镜轻松记录1,2。尽管已使用该显微镜对啮齿类动物的大多数内脏器官进行了研究，但其在舌部的成功应用尚未实现3。
先前对味觉细胞进行钙成像的研究是通过将舌组织切成薄片以获取轮廓乳头味蕾4,5,6，或通过剥离味觉上皮以获取菌状乳头味蕾7,8，在体外（ex vivo）条件下完成的。这些样本的制备不可避免地具有侵入性，因而严重干扰了神经支配、通透性屏障和血液循环等天然微环境。2015年，Choi 等人首次报道了活体舌成像窗口技术，但由于液体味觉刺激物引起的运动和光学伪影，尚无法实现可靠的神经功能记录9。
最近，微流控舌片（µTongue）被提出10该装置将微流控系统与小鼠舌头上的成像窗口集成在一起。通过在整个成像期间实现味觉刺激物的准稳态流动，可最大限度地减少流体运动带来的伪影。图1）。输入端由一系列多通道压力控制器供液，输出端连接维持0.3 mL/min流速的注射泵。此外，通过引入钙离子不敏感的荧光指示剂（tdTomato）和钙离子指示剂（GCaMP6）进行比率分析，以最大限度减少因呈味溶液折射率差异所引起的光学伪影11该设计为味觉细胞提供了显微水平的稳定性 体内 即使在流体通道之间快速切换的情况下，µTongue 也能对多种呈味物质作用于小鼠味蕾的功能进行可靠筛选。 体内.
本方案详细阐述了小鼠菌状味蕾钙成像的实验操作步骤 体内 使用µTongue。首先，描述人工唾液和呈味溶液的制备方法；其次，介绍搭建微流控系统以实现准稳态流动的步骤；第三，详述将小鼠舌组织固定于µTongue上以进行成像的操作流程；最后，明确图像分析的各个步骤，包括横向运动伪影校正和比率测量。本方案可便捷地适用于任何具备小鼠饲养设施和双光子显微镜或同等设备的研究实验室。

<table><tbody><tr><td>安赛蜜钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04054-25G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>氯化钙溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-100G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>环己酰亚胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01810-5G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>苯甲地那铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5765-5G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>牙科胶</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>动物准备</td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>数据分析</td></tr><tr><td>肌苷酸（IMP）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>瞬干胶</td><td>Loctite</td><td>Loctite 4161, Henkel</td><td>动物准备</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Yuhan</td><td>Ketamine 50</td><td>动物准备</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>数据分析</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>甲基吡咯烷酮（MPG）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>多光子显微镜</td><td>Thorlab</td><td>&amp;nbsp;Bergamo II</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Nikon</td><td>N16XLWD-PF</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>Octaflow</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>OCTAFLOW II</td><td>流体控制</td></tr><tr><td>PC</td><td>LG</td><td>Lg15N54</td><td>流体控制</td></tr><tr><td>pH计</td><td>Thermoscientific</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806562</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>奎宁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Q1125-5G</td><td>人工唾液 / 味觉刺激物</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Havard Apparatus</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>流体控制</td></tr><tr><td>TRITC-葡聚糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>动物准备</td></tr><tr><td>超快光纤激光器</td><td>Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>显微镜</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Bayer Korea</td><td>Rompun</td><td>动物准备</td></tr></tbody></table>

µtongue：一种基于微流控技术的舌部功能成像平台 在体 内

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

活体荧光显微技术是一种广泛用于研究活体动物中多细胞动态的工具。然而，该技术尚未成功应用于味觉感受器官。通过将微流控技术整合到活体舌部成像窗口中，µTongue 能够提供味觉细胞可靠的生理功能图像 体内 在多种味觉物质受控暴露条件下进行检测。本文详细介绍了使用µTongue系统的分步操作流程，共包含五个部分：味觉物质溶液的制备、微流控模块的设置、样品装载、功能成像数据的采集以及数据分析。同时提供了若干提示与技术方法，以解决使用µTongue系统过程中可能遇到的实际问题。

采用Pirt-GCaMP6f-tdTomato小鼠获取味蕾图像。小鼠舌表面覆盖着自发荧光的丝状乳头。味蕾稀疏地分布于舌表面（图4A）。通过三种不同的滤光片探测器获取了味蕾及其结构的图像。使用607/70 nm滤光片组，获得味细胞中tdTomato的信号，用于比率分析（图4B）。使用525/50 nm滤光片组，获得味细胞以及环绕味蕾的血管中的GCaMP信号（图4B）。使用447/60 nm滤光片组，获得在结构上支撑味蕾的胶原结缔组织图像（图4B）。
在获取味蕾及相关结构的图像后， 体内 使用该方案进行钙成像。采用 Pirt-GCaMP6f-tdTomato 小鼠对味觉细胞进行筛选（图 5A)16. 味觉细胞对其相应的味觉刺激...

本文介绍了一种用于味觉功能细胞成像的 µTongue（舌上微流控）装置 体内 通过将微流控技术整合到舌部的活体成像窗口中。

µTongue：一种基于微流控技术的舌部功能成像平台 在体 内

活体荧光显微镜是一种广泛用于研究活体动物中多细胞动态的工具。然而，该技术尚未成功应用于……

本方案允许在神经连接和血液循环保持完整的自然微环境中观察味觉细胞的功能。利用该技术，可在体内研究细胞间的通讯。首先，用人工唾液和味觉刺激物填充加压流体灌注系统的储液器。将压缩空气管路连接至调压阀入口，并将流体输送系统中的气压设定为30至50磅每平方英寸。将调压阀的输出压力设为0.4磅每平方英寸，并检查液体是否开始从管路中流出。将储液器的歧管连接至微舌装置的进样口，再将微舌装置的出样口连接至注射泵，以约300微升每分钟的速度抽吸液体，以建立稳态条件。确认悬挂在微舌下方的液滴体积保持恒定，并调节空气压力和流速以获得所需的样品高度。微流控系统设置完成后，断开压缩空气管路并关闭注射泵，直至小鼠准备好进行活体成像。对小鼠实施麻醉后，通过眶后静脉注射TRITC-葡聚糖，以便在成像过程中观察血液循环。将小鼠置于仰卧位后，用70%乙醇喷洒其头部。用镊子轻轻提起头部皮肤，然后用剪刀剪去约七平方毫米的皮肤。清理头皮周围的毛发后，从皮肤下方去除骨膜，并在颅骨上涂抹速干胶。然后安装定制的头部固定器。待瞬干胶完全固化后，在头部固定器周围涂抹牙科胶，并用蓝光照射使其固化。使用瞬干胶将小鼠的下唇粘附至微型舌托的底座单元上，随后将小鼠放置于小鼠固定板上，并通过将微型舌托边缘的孔与固定柱对齐，将底座单元牢固地固定在固定柱上。将小鼠头部固定器拧紧至板上的头部固定器支架，并调整小鼠头部与设备之间的距离。然后利用头部固定器支架，将小鼠头部平稳旋转约45度。将小鼠固定在板上后，使用塑料镊子轻轻拉出其舌头。然后使用瞬干胶将舌头的腹侧粘附到微舌装置底座单元的上表面。为保持舌头湿润，用湿润的棉签擦拭其表面，随后在舌头的暴露面上放置一片浸有人工唾液的组织。将弧形垫圈放在柱上，固定微舌装置的底部，然后将小鼠标本移至显微镜载物台上。将小鼠暴露的舌头置于显微镜物镜区域的大致中心位置，注意不要超出载物台的动态范围，然后拧紧螺丝，将小鼠固定板牢固地固定在载物台上。在小鼠身体下方放置加热垫，以维持其体温在36.5至37.5摄氏度之间。为防止液体进入小鼠气管，将一小条卷曲的纸巾放入小鼠口腔内，随后移除舌面上预先放置的湿润组织，将制备好的微型舌片置于小鼠舌头上，使舌面可通过成像窗口清晰可见。通过轻轻拧紧微舌装置的两端并施加最小的压缩压力来固定微舌。开始采集图像时，先打开显微镜软件，然后开启920纳米的双光子激光器。将水浸物镜安装到显微镜上，随后将物镜 lowered 至微舌的成像窗口，并将物镜浸入水中。在相机模式下，打开汞灯的蓝光以照射舌面。通过调节Z轴并寻找丝状乳头的自发荧光信号，来确定大致的焦平面。然后使用X轴和Y轴调节旋钮，定位一个味蕾。切换至多光子模式，然后设置激发波长、发射滤光片组、扫描模式和图像采集的帧尺寸。将味蕾置于成像窗口中央，定位位于味蕾约三分之二高度处的周围血管，并观察血液流动情况。若血流受阻，可轻微松开固定螺丝以恢复血流。调整Z轴以找到含有足够数量味觉细胞的味蕾所在的Z平面，然后以每秒2至6赫兹的频率进行80秒的钙成像。成像开始后，打开流体系统的储液器，提供味觉溶液持续20秒。味觉刺激20秒后，将储液器切换回人工唾液。成像过程中，每次间隔应保持约三到四分钟，并持续提供人工唾液以保持舌面湿润，并清除前一次实验残留的味觉刺激物。Pirt-GCaMP6f-tdTomato 小鼠的舌表面分布有自发荧光的丝状乳头和稀疏的味蕾。使用光电探测器在 500 至 550 纳米波长下捕获呈黄色的丝状乳头，可在舌表面直至约 25 微米深度范围内观察到。通过500至550纳米滤光片检测到的绿色GCaMP信号和通过607至670纳米滤光片检测到的红色tdTomato信号代表味觉细胞。tdTomato信号用于比率测定分析。围绕味蕾的血管使用500至550纳米滤光片组获取，而为味蕾提供结构支持的胶原结缔组织则使用447至460纳米滤光片组获取。在此利用钙成像技术进行体内味觉筛选的代表性示例中，每个味觉细胞均以虚线标出边界。在本实验中，细胞2对甜味和鲜味刺激物均有响应，而细胞3对低盐和高盐刺激物均有响应。该味蕾中的细胞均未对酸味产生反应。由于本实验的目的是观察味觉细胞在自然环境中的功能，因此在制备阶段需将荧光物质注入血管，并在实验过程中确认其循环情况。

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μTongue:一个基于微流体的功能成像平台，用于在Viva的舌头

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体外 单液滴乳液的消化 通过 模拟胃肠液的多步亚相交换

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利用荧光示踪剂评估小鼠牙龈上皮屏障功能

了解基于微流体的µTongue平台用于活体小鼠舌部味觉细胞功能成像的完整方案。该技术可在保留神经连接和血液循环的天然微环境中，通过双光子显微镜和钙成像实时观察甜味、鲜味和咸味刺激下的细胞反应。

µTongue：一种基于微流控技术的舌部功能成像平台在体内

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