温度控制下液滴界面双层膜的组装与表征

本方案使研究人员能够精确加热液滴界面双层膜（DIB）模型膜，从而研究细胞环境中发生的多种与温度相关的作用。其核心优势在于能够在低体积储液池中局部测量并控制浴液温度，同时不妨碍对DIB进行电学或光学表征。精确加热液体浴的能力为研究由更广泛种类的膜组分（包括天然细胞提取物）形成的DIB中的物质传输与信号传导特性提供了可能。

本实验为多步骤操作流程，需使用多种设备，必须严格遵循以确保足够的实验准确性，因此书面流程中的任何模糊之处均可通过视频演示加以澄清。首先，准备两片厚度为1毫米、长宽分别为25毫米×40毫米的绝缘橡胶片，以及两片厚度为6毫米、同样为25毫米×40毫米的橡胶片，一个已准备好的铝制基座夹具组件，以及一个可嵌入铝制基座夹具观察窗的丙烯酸油储液池。将较薄的橡胶片放置在显微镜载物台上，使每片的长边与载物台开孔边缘相切。

将铝制底座固定装置放置在绝缘垫上，使装置的观察窗居于物镜正上方。在每个电阻加热元件上方放置一块较厚的橡胶，然后使用显微镜载物台夹将其固定，以保护加热元件免受载物台夹造成的损坏，并防止意外发生电短路。小心地将热电偶的测量端弯曲，使其在距离末端约四毫米处形成90度角。

将热电偶的弯曲端插入铝制固定装置的左下角，并用锁紧螺钉轻轻固定。在向铝制固定装置的孔腔中加入十六烷油之前，先将丙烯酸储液池放入铝制固定装置的孔腔中，以尽量减少观察窗与丙烯酸储液池底部之间滞留气泡的风险。向铝制固定装置的孔腔中加入约 1,000 µL 的十六烷油，以提供最大的传热表面积，同时防止油溢出固定装置边缘，污染显微镜载物台或物镜。

将约 1,000 微升十六烷油加入丙烯酸储液池中，注意不要溢出。在降低油浴温度至允许双层膜形成设定点的过程中，测量膜的标称电容，以确定膜中脂质的热致相变。在图形用户界面（GUI）的温度图上单击右键，并清除显示数据，以确保缓冲区中有足够的空间用于后续记录。

使用连接至膜片钳放大器的波形发生器，在液滴界面双层膜（DIB）电极上施加三角波电压，并记录通过双层膜的诱导电流响应。通过以5摄氏度为增量逐步降低设定温度，对双层膜进行冷却，每次温度变化后需在新的稳态温度下至少等待5分钟，直至达到目标温度。当油浴将双层膜冷却至目标最低温度后，再次在图形用户界面（GUI）中右键单击温度图，将温度随时间变化的数据导出至电子表格软件。

停止当前记录。根据测得的电流，计算冷却期间方波电流响应随时间变化的标称电容。绘制标称电容随温度变化的曲线，以观察膜电容的变化情况，然后通过查找电容随温度变化的非单调变化来确定熔解温度。

类似地，在固定温度下，通过逐步升高油浴温度和双层膜面积来评估双层膜的准静态比电容。使用图形用户界面（GUI）以10摄氏度为增量调节设定温度，并使系统达到新的平衡温度。执行先前所述步骤，以启动电容电流的测量和记录。

通过使用显微操作器小心调节电极的位置来改变双层膜的面积。等待方波电流达到稳态幅值，并采集DIB图像，以实现膜面积随时间变化的计算。使用安装在显微镜上的相机对从孔径处观察到的双层膜进行成像。

同时在当前记录软件中添加数字标签，以标记图像采集的对应时间点。共获取五次DIB图像及双层电流的稳态区域，然后重置温度并重复成像。分析在标记时间点处对应于稳态双层区域的电流记录和DIB图像，提取每个温度下的双层电容和面积。

针对每个温度绘制电容随面积的变化图，并计算一阶回归曲线的斜率，该斜率代表双层膜在各温度下的比电容。然后绘制比电容值随相应温度的变化图。通过分析比电容随温度变化的数据中是否存在非单调波动，以确定相变熔解温度。

通过在双分子层上施加一个直流电压阶跃输入，评估电压依赖性离子通道形成的动态过程。将初始电压设定为所需的阶跃值（单位为毫伏），并将最终电压和阶跃大小设定为高于所需阶跃的值。设定阶跃输入的持续时间（单位为秒），然后选择阶跃输入的极性。

将膜片钳放大器切换至接收来自LabVIEW或电压输出模块的指令电压，并将其发送至探头级，开启电压并记录诱导的电流反应，该反应应对临界电压呈现S形抑制。在设定温度下分别获取膜的动态电流-电压关系，以揭示电压依赖性关系，例如离子通道行为。将膜片钳放大器切换至接收来自波形发生器的指令电压，并发送至探头级，开始记录电流。

在波形发生器上输出具有设定幅值、偏移量和频率的连续正弦波形。记录一个或多个周期内的感应电流响应，并可根据需要针对不同的正弦波幅值、频率和温度重复实验。使用温度控制系统来展示由脑组织总脂质提取物（BTLE）脂质形成的双层脂膜（DIB）的温度依赖性。

在从室温加热至约 60 摄氏度的循环过程中，展示了电容电流和温度随时间的变化。在 60 摄氏度初始双层膜形成后，记录了一个完整的冷却/加热循环中，标称电容随温度的变化。通过在不同温度下进行准静态比电容测量，可用于确定脂质熔解温度。

通过绘制双层膜电容与双层膜面积的关系图，可进行线性回归分析，其中斜率代表特异性电容的数值。DIB图像显示，当温度低于熔化温度时，膜即使在因电极间距较大而导致液滴拉伸所产生的张力作用下，仍处于高度粘附状态。所示的电流-电压曲线是通过施加正弦膜电压并在两种不同温度下测量感应电流获得的。

箭头及后续数字有助于直观显示正弦电压随时间变化的连续四个阶段。此处展示了在相同电压水平和两种不同温度下，掺有单氮霉素的 BTLE 膜所测得的电流密度。正确地将十六烷油加入铝制夹具的孔中至关重要。

如果未按顺序操作或操作不够谨慎，丙烯酸小室下方将产生气泡，从而阻碍对DIB的自下而上观察。用户还必须记得在每次测量前清除温度控制软件中的数据缓冲区，以确保数据完整记录。该方法可实现对仿生膜在不同温度条件下的表征，这对于研究膜结构与物质传输的温度依赖性至关重要。

此外，该技术能力还可用于揭示其他膜活性物质（如生物离子通道和人工设计的纳米材料）在纳米尺度上的效应。