Name: 温度控制组件和液滴接口比莱耶的特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 了解液滴界面双层（DIB）模型膜的温度控制方法，用于研究生物物理膜的温度依赖性效应。该方案通过铝制夹具和电阻加热元件实现精确温控，支持高熔点脂质和天然细胞提取物的膜形成与电学表征。

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本研究得到美国国家科学基金会资助项目 CBET-1752197 和美国空军科学研究办公室资助项目 FA9550-19-1-0213 的支持。

作者无利益冲突。

本文所述方案提供了组装和操作实验系统的说明，用于控制形成DIBs所用油相和液滴的温度。该方法对于使用熔点高于室温的脂质形成DIBs尤为有利。此外，通过精确调节油相储液池的温度，可调控双分子层的温度，从而研究升高温度对多种膜特性与性质的影响，包括电容、面积、厚度、诱导的热致相变、膜活性物质的动力学行为，以及双分子层界面黏附能学37,38。
在用于DIB研究之前，该方案包含三个部分：1）加热平台装置的准备与组装；2）连接各种仪器；3）通过选定的比例和积分控制增益，确认适宜的温度控制性能。在第二部分中，最重要的是，用户必须确保避免功率放大器输出（>mA级电流）与膜片钳头级放大器（pA至nA级电流）之间形成共用的导电通路。意外的短路可能导致头级放大器永久性损坏。此外，确保PC机及所有仪器均连接至共用的交流电源地线，并在头级放大器和液滴电极附近使用接地的法拉第笼，有助于最小化双层电流测量中的噪声。在完成第二部分的设置后，用户必须首先通过向加热元件施加固定电压并记录温度的相应上...

细胞膜是由&#160;数千种脂质类型1、蛋白质、碳水化合物和甾醇组成的具有选择性通透性的屏障，包裹并划分所有活细胞。因此，了解其组成如何影响其功能，以及揭示天然和合成分子如何与细胞膜相互作用、附着、破坏和跨膜转运，是生物学、医学、化学、物理学和材料工程领域具有广泛意义的重要研究方向。
这些发现目标直接受益于已验证的技术，用于组装、操控和研究模型膜——包括由合成或天然脂质组装而成的脂双层——这些模型膜可模拟其细胞对应物的组成、结构和运输特性。近年来，液滴界面双层（DIB）方法2,3,4 在油相中通过脂质包被的水滴之间构建平面脂双层，已受到广泛关注5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23，相较于其他模型膜构建方法展现出实际优势：DIB 方法操作简便，无需对支撑膜的基底进行复杂加工或制备（例如&#34;涂覆&#34;），能够稳定生成寿命更长的膜，支持标准的膜片钳电生理测量，并简化了具有不对称叶层组成的模型膜的构建过程3。由于双层膜在液滴之间可自发形成，且每个液滴的位置和组成均可定制，DIB 技术在开发受细胞启发的材料体系方面也引起了广泛关注，这些体系基于刺激响应性膜18,24,25,26,27,28,29、平衡的区室化与运输14,30,31，以及类组织材料17,23,32,33,34,35,36 的应用而构建。
大多数关于模型膜（包括使用双层脂膜阵列DIBs的研究）的已发表实验均在室温（RT，约20–25 °C）下进行，并仅使用少数几种合成脂质（例如DOPC、DPhPC等）。这种做法限制了可在模型膜中研究的生物物理问题的范围；并且根据观察，它还可能限制可用于构建DIBs的脂质类型。例如，一种合成脂质DPPC，其相变温度为42 °C，在室温下无法形成紧密堆积的单层膜，也无法形成DIBs37。对于含有多种不同类型脂质、且来源于生活在较高温度（37 °C）环境中的细胞的天然脂质提取物而言，在室温下形成DIBs同样困难，例如哺乳动物来源的脑总脂质提取物（BTLE）38或细菌来源的大肠杆菌总脂质提取物（Escherichia coli total lipid extract, ETLE）37。因此，实现对多种脂质组成的研究，有助于在更接近生物学实际条件的情况下理解由膜介导的生物学过程。
升高油相温度具有两个作用：一是加快单分子层组装的动力学过程，二是可诱导脂质发生熔融相变，从而进入液态无序相。这两种效应均有助于双层油包水液滴界面（DIB）形成前的单分子层组装39。除了加热促进双层膜形成外，在膜形成后进行降温还可用于识别单个脂质双层中的热致相变38，包括那些使用量热法难以检测的天然脂质混合物（如 BTLE）中的相变。除了评估脂质的热致相变行为外，精确调控 DIB 的温度还可用于研究温度诱导的膜结构变化38，并探究脂质组成和膜流动性如何影响膜活性物质（如成孔肽和跨膜蛋白37）的动力学行为，包括在生理相关温度&#160;(37 °C) 下对哺乳动物和细菌模型膜的研究。
本文将介绍如何组装一种改良的DIB油相储液池，并操作反馈式温度控制器，以实现高于室温条件下的单层膜组装和双层膜形成。与先前的方案40不同，本文详细说明了在油相储液池中进行DIB组装与表征的同时，集成用于测量和控制温度所需仪器的具体方法。该操作流程使研究人员能够在多种科学背景下，在不同温度范围内应用此方法来构建和研究DIB。此外，代表性结果展示了当温度变化时，膜结构和离子传输特性可能发生的具体可测变化实例。这些技术是对DIB中可设计和有效实施的众多生物物理研究的重要补充，包括研究不同膜组成中膜活性物质的动力学行为。

<table><tbody><tr><td>25 mm × 40 mm × 1 mm 绝缘橡胶（x2）</td><td>任意</td><td></td><td>使铝制底座的底部与显微镜载物台绝缘</td></tr><tr><td>25 mm × 40 mm × 6 mm 绝缘橡胶（x2）</td><td>任意</td><td></td><td>保护加热元件免受显微镜载物台夹具损坏，并对加热元件顶部进行绝缘</td></tr><tr><td>3-(N-吗啉代)丙磺酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3183</td><td>脂质溶液的缓冲剂</td></tr><tr><td>丙烯酸基底</td><td>自制</td><td>HTD_STG_2</td><td>约 1000 µL 丙烯酸储液池，外轮廓具有防错设计以固定方向</td></tr><tr><td>铝制底座</td><td>自制</td><td>HTD_STG_1</td><td>带有油腔的基座装置，用于容纳丙烯酸装置，并在油腔两侧设有两个平面垫片以安装加热元件&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>脑组织总脂质提取物</td><td>Avanti</td><td>131101C-100mg</td><td>25 mg/mL 猪源性脂质提取物&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>紧凑型数据采集机箱（cDAQ）</td><td>National Instruments&amp;nbsp;</td><td>cDAQ-9174&amp;nbsp;</td><td>用于容纳多种类型传感器测量或输出模块的机箱</td></tr><tr><td>数据采集系统（DAQ）</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>Digidata 1440A&amp;nbsp;</td><td>高分辨率模拟-数字转换器</td></tr><tr><td>固定增益放大器/电源</td><td>Hewlitt Packard</td><td>HP 6826A</td><td>放大来自电压输出模块的直流电压输出</td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Corning</td><td>CLS284525</td><td>密封铝制底座底部，并允许对双层膜进行光学表征</td></tr><tr><td>加热元件（x2）</td><td>Omega</td><td>KHLV-101/5</td><td>25 mm × 25 mm 聚酰亚胺薄膜 Kapton 加热元件，最大功率为 5 瓦&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M3 不锈钢螺钉</td><td>McMaster Carr</td><td>90116A150</td><td>将热电偶固定在铝制底座上</td></tr><tr><td>膜片钳放大器</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>AxoPatch 200B&amp;nbsp;</td><td>测量电流并向探头输出电压</td></tr><tr><td>个人计算机</td><td>任意</td><td></td><td>配备多个高速 USB 接口且至少具有 6 GB 内存的计算机</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3911</td><td>解离离子的电解质溶液</td></tr><tr><td>温度输入模块</td><td>National Instruments&amp;nbsp;</td><td>NI 9211</td><td>支持 cDAQ 机箱的开路和冷端热电偶测量</td></tr><tr><td>热电偶</td><td>Omega</td><td>JMTSS-020U-6&amp;nbsp;</td><td>U 型热电偶，直径为 0.02 英寸，长度为 6 英寸</td></tr><tr><td>紫外光固化胶粘剂</td><td>Loctite</td><td>19739</td><td>将玻璃盖玻片固定在铝制底座上</td></tr><tr><td>电压输出模块</td><td>National Instruments&amp;nbsp;</td><td>NI 9263</td><td>用于 cDAQ 机箱的模拟电压输出模块</td></tr><tr><td>波形发生器</td><td>Agilent</td><td>33210A&amp;nbsp;</td><td>用于输出 10 mV、10 Hz 的正弦波形</td></tr></tbody></table>

温度控制下液滴界面双层膜的组装与表征

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

在油相中将脂质包被的水相液滴组装成液滴界面双层膜（DIB）的方法，相较于其他方法具有若干关键优势：DIB结构稳定且通常可长期维持，双层膜面积可逆调节，通过调控液滴组成可方便地控制单层膜的不对称性，并可通过多个液滴的连接构建出类似组织的双层膜网络。DIB的形成依赖于脂质在液滴表面自发组装成高密度的脂质单层膜。尽管常见合成脂质在室温下易于实现这一过程，但对于熔点高于室温的脂质（包括某些细胞脂质提取物）而言，在相似条件下往往难以形成充分的单层膜或稳定的双层膜。这种局限性可能制约了DIB在模型膜研究中的组成多样性及其生物学相关性。为解决此问题，本文提出了一种实验方案，通过对承载DIB液滴的油相储层进行精确加热，并系统表征温度对脂质膜的影响。具体而言，该方案展示了如何利用导热性良好的铝制夹具和由反馈回路控制的电阻加热元件，设定并维持较高的温度，从而促进多种类型脂质的单层膜组装与双层膜形成。通过测量DIB电容的变化，可定量分析膜的结构特征以及构成双层膜的脂质所发生的热致相变行为。综上，该方法有助于在不同温度条件下评估模型膜中的生物物理现象，包括确定多组分脂质混合物的有效相变温度（TM）。这一能力将有助于更真实地模拟天然脂质膜的相变行为，并推动使用更广泛来源的膜组分构建和应用模型膜体系，包括那些更能反映细胞膜组分异质性的脂质体系。

图1 展示了如何在显微镜载物台上准备铝制夹具和丙烯酸油储液池以形成DIB。步骤1.2-1.4用于将夹具与载物台进行热隔离，以实现更高效的加热。步骤1.5-1.7展示了如何正确地将热电偶连接到夹具上并定位油储液池，步骤1.8-1.9展示了向这些部件中添加油的推荐位置。
图2 概述了用于在双层脂膜（DIB）上建立反馈温度控制并进行电学测量的组件：一台计算机（PC）、一个固定增益功率放大器、一个膜片钳放大器和一个数据采集系统（DAQ系统，或用于施加电压并测量皮安至纳安级电流的等效仪器）、第二个具备适当模拟输入和输出功能的DAQ系统、一个波形发生器，以及装配好的带有连接电阻加热器的铝制装置。DAQ-2 使用了两个模块（图2b）。其中一个为4通道、±10 V、16位模拟电压输出模块，用于向功率放大器的输入端（图2a中的蓝色连接）和膜片钳放大器的外部指令输入...

本方案详细介绍了使用反馈温度控制加热系统促进高熔点脂质单层组装及液滴界面双层形成的实验方法，以及通过电容测量来表征温度驱动下膜结构变化的技术。

液滴界面双层膜（DIB）方法通过在油相中将脂质包被的水相液滴组装形成脂质双层膜（即DIBs），具有若干关键优势……

本方案使研究人员能够精确加热液滴界面双层膜（DIB）模型膜，从而研究细胞环境中发生的多种与温度相关的作用。其核心优势在于能够在低体积储液池中局部测量并控制浴液温度，同时不妨碍对DIB进行电学或光学表征。精确加热液体浴的能力为研究由更广泛种类的膜组分（包括天然细胞提取物）形成的DIB中的物质传输与信号传导特性提供了可能。本实验为多步骤操作流程，需使用多种设备，必须严格遵循以确保足够的实验准确性，因此书面流程中的任何模糊之处均可通过视频演示加以澄清。首先，准备两片厚度为1毫米、长宽分别为25毫米×40毫米的绝缘橡胶片，以及两片厚度为6毫米、同样为25毫米×40毫米的橡胶片，一个已准备好的铝制基座夹具组件，以及一个可嵌入铝制基座夹具观察窗的丙烯酸油储液池。将较薄的橡胶片放置在显微镜载物台上，使每片的长边与载物台开孔边缘相切。将铝制底座固定装置放置在绝缘垫上，使装置的观察窗居于物镜正上方。在每个电阻加热元件上方放置一块较厚的橡胶，然后使用显微镜载物台夹将其固定，以保护加热元件免受载物台夹造成的损坏，并防止意外发生电短路。小心地将热电偶的测量端弯曲，使其在距离末端约四毫米处形成90度角。将热电偶的弯曲端插入铝制固定装置的左下角，并用锁紧螺钉轻轻固定。在向铝制固定装置的孔腔中加入十六烷油之前，先将丙烯酸储液池放入铝制固定装置的孔腔中，以尽量减少观察窗与丙烯酸储液池底部之间滞留气泡的风险。向铝制固定装置的孔腔中加入约 1,000 µL 的十六烷油，以提供最大的传热表面积，同时防止油溢出固定装置边缘，污染显微镜载物台或物镜。将约 1,000 微升十六烷油加入丙烯酸储液池中，注意不要溢出。在降低油浴温度至允许双层膜形成设定点的过程中，测量膜的标称电容，以确定膜中脂质的热致相变。在图形用户界面（GUI）的温度图上单击右键，并清除显示数据，以确保缓冲区中有足够的空间用于后续记录。使用连接至膜片钳放大器的波形发生器，在液滴界面双层膜（DIB）电极上施加三角波电压，并记录通过双层膜的诱导电流响应。通过以5摄氏度为增量逐步降低设定温度，对双层膜进行冷却，每次温度变化后需在新的稳态温度下至少等待5分钟，直至达到目标温度。当油浴将双层膜冷却至目标最低温度后，再次在图形用户界面（GUI）中右键单击温度图，将温度随时间变化的数据导出至电子表格软件。停止当前记录。根据测得的电流，计算冷却期间方波电流响应随时间变化的标称电容。绘制标称电容随温度变化的曲线，以观察膜电容的变化情况，然后通过查找电容随温度变化的非单调变化来确定熔解温度。类似地，在固定温度下，通过逐步升高油浴温度和双层膜面积来评估双层膜的准静态比电容。使用图形用户界面（GUI）以10摄氏度为增量调节设定温度，并使系统达到新的平衡温度。执行先前所述步骤，以启动电容电流的测量和记录。通过使用显微操作器小心调节电极的位置来改变双层膜的面积。等待方波电流达到稳态幅值，并采集DIB图像，以实现膜面积随时间变化的计算。使用安装在显微镜上的相机对从孔径处观察到的双层膜进行成像。同时在当前记录软件中添加数字标签，以标记图像采集的对应时间点。共获取五次DIB图像及双层电流的稳态区域，然后重置温度并重复成像。分析在标记时间点处对应于稳态双层区域的电流记录和DIB图像，提取每个温度下的双层电容和面积。针对每个温度绘制电容随面积的变化图，并计算一阶回归曲线的斜率，该斜率代表双层膜在各温度下的比电容。然后绘制比电容值随相应温度的变化图。通过分析比电容随温度变化的数据中是否存在非单调波动，以确定相变熔解温度。通过在双分子层上施加一个直流电压阶跃输入，评估电压依赖性离子通道形成的动态过程。将初始电压设定为所需的阶跃值（单位为毫伏），并将最终电压和阶跃大小设定为高于所需阶跃的值。设定阶跃输入的持续时间（单位为秒），然后选择阶跃输入的极性。将膜片钳放大器切换至接收来自LabVIEW或电压输出模块的指令电压，并将其发送至探头级，开启电压并记录诱导的电流反应，该反应应对临界电压呈现S形抑制。在设定温度下分别获取膜的动态电流-电压关系，以揭示电压依赖性关系，例如离子通道行为。将膜片钳放大器切换至接收来自波形发生器的指令电压，并发送至探头级，开始记录电流。在波形发生器上输出具有设定幅值、偏移量和频率的连续正弦波形。记录一个或多个周期内的感应电流响应，并可根据需要针对不同的正弦波幅值、频率和温度重复实验。使用温度控制系统来展示由脑组织总脂质提取物（BTLE）脂质形成的双层脂膜（DIB）的温度依赖性。在从室温加热至约 60 摄氏度的循环过程中，展示了电容电流和温度随时间的变化。在 60 摄氏度初始双层膜形成后，记录了一个完整的冷却/加热循环中，标称电容随温度的变化。通过在不同温度下进行准静态比电容测量，可用于确定脂质熔解温度。通过绘制双层膜电容与双层膜面积的关系图，可进行线性回归分析，其中斜率代表特异性电容的数值。DIB图像显示，当温度低于熔化温度时，膜即使在因电极间距较大而导致液滴拉伸所产生的张力作用下，仍处于高度粘附状态。所示的电流-电压曲线是通过施加正弦膜电压并在两种不同温度下测量感应电流获得的。箭头及后续数字有助于直观显示正弦电压随时间变化的连续四个阶段。此处展示了在相同电压水平和两种不同温度下，掺有单氮霉素的 BTLE 膜所测得的电流密度。正确地将十六烷油加入铝制夹具的孔中至关重要。如果未按顺序操作或操作不够谨慎，丙烯酸小室下方将产生气泡，从而阻碍对DIB的自下而上观察。用户还必须记得在每次测量前清除温度控制软件中的数据缓冲区，以确保数据完整记录。该方法可实现对仿生膜在不同温度条件下的表征，这对于研究膜结构与物质传输的温度依赖性至关重要。此外，该技术能力还可用于揭示其他膜活性物质（如生物离子通道和人工设计的纳米材料）在纳米尺度上的效应。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

温度控制组件和液滴接口比莱耶的特征

细菌的机械敏感性通道可用作生物分子器件中的力电换能器。液滴界面双层膜（DIBs）是此类器件中受细胞启发的构建单元，为整合和刺激机械敏感性通道提供了新平台。本文中，我们展示了一种基于微移液管的新型DIBs形成方法，可在机械刺激条件下研究机械敏感性通道。...

基于微移液管的多功能方法用于在液滴界面双层膜中整合并刺激细菌机械敏感性离子通道

我们展示了一种可储存、可运输的脂双层形成系统。当冷冻的膜前体恢复至室温后，可在1小时内形成脂双层膜，成功率超过80%。该系统将减少与离子通道研究相关的繁琐操作和对专业技术的依赖。...

使用聚二甲基硅氧烷薄膜自动形成脂双层膜

有丝分裂纺锤体的组装和定位依赖于微管动力学、马达蛋白和交联蛋白共同产生的作用力。本文介绍了我们近期开发的方法，该方法利用球形乳液液滴的几何限域，自下而上地重建基本的有丝分裂纺锤体。...

在球形乳液液滴中重建基础有丝分裂纺锤体

我们提出了一种在玻璃表面进行功能化的方法，使其形成被流动脂双层包围的纳米级蛋白质斑块。这些基底适用于先进的光学显微镜技术，有望作为细胞黏附与迁移研究的平台。...

支撑脂双层中的配体纳米簇阵列

本文介绍了一种利用接触气泡双层法形成脂双层的实验方案。将水相气泡吹入有机溶剂中，在水-油界面处形成单层膜。通过操纵两根移液管使气泡对接，从而形成双层膜结构。...

用于膜片钳研究的接触气泡双层脂质膜实验

用于单个DNA分子大规模并行蛋白质合成的飞升级液滴阵列

我们报道了一种通过在脂质双层中掺杂铜(II)...

水/气界面处掺杂疏水性有机分子的杂化脂质膜的自组装

本方案描述了模拟细胞的单脂质和多脂质囊泡、支撑脂双层以及悬浮脂双层的制备方法。这些 体外 模型可进行调整以包含多种脂质类型，并可用于研究各种分子和大分子间的相互作用。...

用于研究分子相互作用的模拟细胞支撑及悬浮脂双层模型的构建

本文介绍了一种利用单分子全内反射荧光（smTIRF）显微镜技术，在人工拥挤的脂质膜上对单个分子的结合、运动性和组装行为进行观测与分析的实验方案。...

单分子在聚合物拥挤的脂质膜上的扩散与组装

本文介绍了一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的双层装置的制备方法，用于在油包水乳液（液滴）中生成组合文库。方案中详细描述了实现液滴自动化生成所需的硬件和软件，并展示了荧光液滴定量文库的制备过程。...

用于组合式液滴生成的双层微流控装置

本文介绍了一种实验方案，用于组装、电刺激并分析掺有短杆菌肽A的液滴界面双层膜。通过测量膜面积、离子流和单通道电导的变化，并将这些响应与受电突触启发的膜模型中类似可塑性的离子传导变化相关联，从而量化脂质-蛋白质的结构-功能关系。...

利用液滴界面双层膜表征脂质-蛋白质膜的结构与功能

了解液滴界面双层（DIB）模型膜的温度控制方法，用于研究生物物理膜的温度依赖性效应。该方案通过铝制夹具和电阻加热元件实现精确温控，支持高熔点脂质和天然细胞提取物的膜形成与电学表征。

温度控制下液滴界面双层膜的组装与表征

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