Name: 金刚石光源下光束线I23真空长波长晶体学的样品制备和转移实验方案 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学习在金刚石光源I23光束线进行真空长波长晶体学的低温样品制备与转移技术。本实验方案利用专用低温转移系统（CTS）和定制工具，将生物大分子晶体从液氮环境安全转移至真空终端站，实现利用硫、磷等轻元素反常散射信号进行实验相位解析和结构测定。

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我们感谢 Adam Taylor、Adam Prescott、Ken Jones、Arvinder Palaha 和 Kevin Wilkinson 在低温样品转移系统（CTS）开发过程中提供的支持。&#160;本工作由欧洲委员会“地平线2020”计划资助的 iNEXT-Discovery（资助号 871037）提供资金支持。

1. 晶体收获
注意：应使用适当的个人防护装备：尽可能佩戴护目镜和手套。
<ol>
	<li>当SHs以组合载具（combipucks）形式到达用户实验室后（图3C），将组合载具的盖子与底座分离，使SHs仍附着在底座上，而小瓶保留在盖子中。</li>
	<li>将带有小瓶的盖子浸入液氮中。将一个SH加适配器（图3B，右）连接到磁性取样棒上，然后照常采集晶体。</li>
	<li>将每个样品直接进行闪冻处理至组合载具中，并记录样品的位置。关闭载具时，使用载具取样棒将底座与盖子连接。</li>
	<li>将组合载具从液氮转移至干式运输容器或液氮储存杜瓦瓶中。将干式运输容器运送至Diamond同步辐射光源（https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html）。</li>
</ol>
2. 样品转移至真空环境
<ol>
	<li>从组合架将SH加载至转移块
	<ol>
		<li>将样品块卡座的底部（图3H）已放置空的转移块图3D) 放入液氮泡沫容器内，置于其支撑底座上（图 3J-b). 
		&#8203;注意：转移块在真空腔内的取向对于样品转移的准确性至关重要。因此，应将转移块放置在块状载具底座上，并确保带箭头标记的销钉对准相应位置。 图3D 位于该模块的左侧。</li>
		<li>将样品管托盘放入装有液氮的泡沫容器中，确保托盘底部固定在泡沫容器内的磁性支架上（图 3J- a).</li>
		<li>将所有必要工具在液氮中预冷。使用图示的样品托分离工具 图3G 在高挡位 H 将盖子与底部分离，使底部仍固定在磁性支架上，而SHs暴露在液氮中。</li>
		<li>为将每个SH从其适配器上拆下，使用分离棒（图3F) 从组合架底座上取下SH，并将其放入水平位置转盘的转移块中相应位置 图3J- b.
		<ol>
			<li>将分离棒垂直插入SH +接头，尽可能插到底，注意保持垂直，避免接触样品。</li>
			<li>用拇指将分离手柄上的小杠杆向下移动，直至发出咔嗒声，以固定SH并从适配器上拉出SH。</li>
			<li>将分隔器 lowered 到所需模块位置，确保三个支脚中的一个插入模块的中心孔内。</li>
			<li>通过将杠杆向上复位来释放SH。对每个SH重复上述步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>要将样本加载到下一个样本块中，请使用转盘钥匙工具（图3E）将一个空模块旋转至水平位置。</li>
		<li>连接图示的 puck 分离工具 图 3G 使用低档设置 L 通过顺时针旋转将盖子固定到样品块插槽的盖上。</li>
		<li>所有样品架转移完毕后，将提手盖置于液氮中，待其温度平衡后，将其盖在底座上以封闭提手盒，操作如图所示 图3I使用分离工具轻轻抬起，使样品从转盘上释放。</li>
		<li>此时，可将样本块载杆转移至 CTS图4B）或液氮储存杜瓦瓶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将传输模块装入真空容器
	<ol>
		<li>确保穿梭装置已牢固连接至工作站。打开氮气和空气阀门，并确保气体正常流通。启动 CTS。</li>
		<li>如果显示屏上无任何警告信息，开始使用液氮对浴槽和转移舱进行降温。将随附的漏斗插入转移舱的加注口，缓慢将液氮倒入漏斗中，同时观察屏幕上的液位。当指示灯由红色变为蓝色时，停止加注。 
		注意：当触摸屏上显示的冷台温度低于100 K时，传输装置即可投入使用。可同时使用合适的漏斗将样品站杜瓦灌注液氮至杜瓦壁上标记的液位，或液氮液位显示器上的100%位置。操作过程中应持续监测液氮液位和温度传感器；期间需多次补充液氮。</li>
		<li>当传输冷台温度低于100 K，且传输罐和恒温浴中的液氮液面稳定后，使用附带的样品托盘分离工具将一个块状样品托盘从液氮中转移至CTS恒温浴中。取下块状样品托盘的盖子，然后盖上CTS恒温浴的盖子。</li>
		<li>要将模块装入穿梭机，请按下按钮打开 CTS 阀门（如尚未打开） 开启穿梭阀 显示屏上的按钮。顺时针旋转90°解锁推移手柄，并将其向前推进至浴槽中，使手柄上的导轨强制其沿正确路径移向浴槽。当浴槽内可见模块盖时，让盖子冷却。待液氮在盖子周围停止冒泡后，继续推进至转移模块。</li>
		<li>将手柄顺时针旋转180°，以将转移块锁定在滑轨上。</li>
		<li>将手柄拉回至初始后端位置，然后逆时针旋转90°将其锁定。</li>
		<li>按压 关闭穿梭阀 &amp;#38; 泵 在显示屏上启动穿梭疏散。</li>
		<li>一旦消息 穿梭体准备脱离 在触摸屏上显示后，按下穿梭装置下方的杠杆，并使用顶部的把手小心地将其抬起。</li>
		<li>将穿梭装置垂直运送至真空终端站的气闸处。</li>
		<li>将传输舱连接至真空终端站的气闸室。 
		注意：一旦牢固连接，终端站的触摸屏将确认载物台的状态和联锁情况。</li>
		<li>通过触摸屏上按压相应按钮，选择容器内的一个空位，并将样品架移至正确的装载位置。</li>
		<li>一旦样本支架就位， 打开 按钮将变为可用状态。按下此按钮以启动真空联锁程序。 
		注意：泵将启动，进度将显示在监视器上。此过程可能需要长达两分钟才能完成。</li>
		<li>序列完成后，状态将更改为 气闸开启，正在转移中将手柄顺时针旋转90°以解锁推杆，轻轻将推杆推入容器，使导轨再次引导推杆沿正确路径移向样品架位置。根据屏幕显示的视频画面进行引导，缓慢将样品块插入样品架，确保触摸屏上的样品块位置指示灯被激活。指示灯亮起后，将手柄逆时针旋转180°以释放样品块，然后将推杆从容器中拉出。待推杆完全缩回后，将手柄逆时针旋转90°以锁定推杆。</li>
		<li>一旦杆被锁定， 关闭 按钮将变为可用状态。按下该按钮以关闭末端站真空阀，并将穿梭装置与容器之间的空间通气至大气压，等待最多20秒以完成操作。</li>
		<li>等待显示屏显示状态 可以移除穿梭装置 序列完成后，取出穿梭装置，返回 CTS 以对下一个模块重复该过程。</li>
		<li>为准备转移下一个样品块，旋转样品杯内的样品块。推动内置的旋转装置 关键 亚克力盖顶部向下插入 锁定 在样品块卡匣的中心位置。在按住的同时，旋转 关键 将目标模块移至拾取位置。</li>
		<li>所有模块转移完成后，确保穿梭阀在安装于 CTS 上时处于打开状态。按下 烘烤 触摸屏上的按钮，并同时选择两者 浴液 和 穿梭，然后按压 烘烤. 
		注意：此步骤可同时加热转运罐和液氮罐，以蒸发残留的液氮，并在下次使用前去除积聚的冰霜或冷凝物。烘烤开始后，可关闭气体和空气供应。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

本方案的制定旨在满足在 I23 光束线上进行真空内长波长 MX 实验的样品制备要求。该方案已在光束线上使用一年，并助力多个项目成功完成。如本文所示结果表明，该方案能够在保持样品衍射质量的同时，实现将样品安全、可靠地转移至真空末端站。这是光束线运行中的一个重要环节，光束线工作人员将为用户提供现场培训。其中部分步骤对于程序的安全和成功实施尤为关键，需特别注意：将样品从 combipuck 底座转移至样品块时需精准操作并保持专注，以避免损坏样品（见步骤 2.1.4）；在各个阶段均需密切监测液氮液位，以防止样品暴露于空气中或与未充分冷却的部件发生接触（2.1.3 和 2.2.2）；在从末端站取出样品架之前（2.2.15），必须等待关闭程序（2.2.14）完全结束，以避免末端站真空环境遭到破坏。
该实验方案的概念构思与一项工程开发工作同步启动，旨在研制专用于将蛋白质晶体转移至真空环境的设备。该项目的最终成果即为上述的晶体转移系统（CTS）及其配套的样品操作工具。相较于其前身Leica EM VCT10014，CTS实现了显著改进，克服了多项局限性，例如转移过程中缺乏样品屏蔽和真空环境、液氮浴内部结冰、缺乏直观的用户界面以及安全功能不足等问题。CTS还具备多项提升用户体验的功能，包括对穿梭舱和样品站内部的温度及液氮液位进行实时监测、容量更大的液氮浴可同时容纳四个样品块而非仅一个，以及用于穿梭舱操作的自导向机制。CTS已完全集成至光束线控制系统，配备友好的触摸屏界面，并在与终端站连接时提供增强的真空与机械安全保障。
I23光束线是同类中首条长波长MX同步辐射实验装置，因此将蛋白质晶体引入高真空环境并在低温条件下储存需要付出大量努力。目前仍在持续改进样品制备工具和实验方案，并致力于优化各项操作流程。作为用户支持的一部分，光束线工作人员始终可协助解决各类技术问题。其中一个典型情况是影响真空系统完整性的故障，导致难以将样品穿梭装置连接或脱离CTS或实验站气闸。每周和每日都会执行不同级别的测试，用户培训中也将涵盖额外的检查步骤，以避免潜在故障，例如对穿梭装置所连接接口上的O型密封圈进行目视检查。尽管真空环境为在其他光束线无法实现的波长范围内开展衍射实验提供了机会，但额外的转移步骤降低了整体样品通量。
手动转移方式每个转移块仅能容纳四个样品，真空腔内最多可放置五个转移块，因此总容量限制为20个样品。因此，对于样品间变异性较大的项目，应首先在Diamond高通量光束线上对样品进行预筛选，然后仅将最有前景的样品转移至后续优化的长波长实验中。尽管样品托架和转移块自数年前首次引入以来保持不变，但本文介绍的操作工具均为全新开发。由于I23专用样品托架在光束线冷却系统中起关键作用，因此其结构不可更改。为此，样品操作工具的设计目标是建立这种新型托架与MX用户群体长期采用的标准商用工具之间的连接，例如组合式样品架（combipucks）、晶体捞取棒（crystal harvesting wands）以及干式运输罐（dry shipper transport system）。这些工具的设计过程广泛征求了用户群体的意见，并经过多次迭代才得以完成。本文所介绍的设备、工具和操作流程代表了一套简单且可靠的系统，用于将用户样品转移至Diamond光源的I23光束线开展实验。该用于真空内长波长大分子晶体学的仪器为结构生物学开辟了新的研究机遇。

长波长X射线衍射被用于利用大分子中天然存在的特定轻原子的反常散射特性。这有助于解决晶体学相位问题，并明确确认这些元素在大分子中的身份与位置。尽管在大分子晶体学发展的早期阶段， 从头合成 通过多重同晶置换法解析了结构1，随着同步辐射光源可调谐X射线光束线的发展，基于多波长和单波长（SAD）反常衍射技术的实验相位法已成为主流方法2两种方法历史上都依赖于重金属提供的同晶或反常散射信号，这些重金属需要通过共结晶或晶体浸泡的方式人为引入晶体中3试错法以及不可预测的实验结果可能使这些实验变得极其耗时且令人沮丧。在蛋白质表达过程中掺入硒代蛋氨酸4 是一种克服这些限制并利用短波长下反常衍射的非常优雅的方法，尽管在真核蛋白表达系统中可能极具挑战性。
长波长MX由于可直接使用成功结晶实验获得的晶体而无需进一步处理，因此在基于天然SAD实验的结构测定中极具吸引力5,6。此外，能够接近具有重要生物学意义的元素（如钙、钾、氯、硫和磷）的吸收边，为直接确定这些元素在大分子中的位置提供了机会7,8,9,10。在中低分辨率下，基于2Fo-Fc电子密度图和化学环境进行元素指认可能较为困难，特别是对于电子数相近的元素或具有部分占有率的弱结合离子。这些不确定性可通过在目标元素吸收边下方和上方收集数据，并解析由此产生的模型相位反常差值傅里叶图谱来解决11,12。在这些图谱中定位硫原子位置也有助于在低分辨率电子密度图中构建模型13。这些轻元素的吸收边出现在波长λ = 3至6 Å范围内（见图1，顶部）。该波长范围远超任何同步辐射MX光束线以往的能力，要在该范围内实现高效运行，需克服若干技术挑战，如下文所述。
位于英国 Diamond Light Source 的 I23 光束线是一种独特的仪器，专为促进长波长 MX 实验而设计，其波长可调范围为 λ = 1.13 至 5.9 Å（能量范围为 E = 2.1 至 11 keV）。通过在高真空环境中运行14，可消除空气对 X 射线的吸收和散射，从而提高衍射实验的效率和信噪比。一个大型真空终端站封装了样品环境的全部组件，包括半圆柱形 Pilatus 12M 探测器、多轴测角仪、在线观测与准直系统，以及用于样品传递和储存的定制设备（图 2）。每一件设备均经过优化，以确保能够收集到最高质量的长波长数据。弯曲的 Pilatus 12M 探测器可采集至衍射角 2θ&#160;= ±100°&#160;，即使在最长波长下也能获得足够高分辨率的衍射数据（图 1，底部）。120 个探测器模块经过专门挑选，以适配低能量范围，并额外提供了超高清增益模式的校准。
探测器的最低可能阈值为1.8 keV，这会导致在低于3.6 keV的能量下出现更显著的角落和边缘效应，并在最长波长处导致数据质量下降，尤其对于镶嵌度较低的晶体更为明显。在实验设计时，必须同时考虑该效应以及探测器量子效率的下降15。多轴测角仪可实现晶体的重新取向，从而支持最大化反常信号强度和质量的数据采集策略，并提高所采集反常数据的完整性。样品吸收是实验中的一个限制因素，特别是在最长波长下尤为突出。目前常用的MX数据处理软件包中实现的吸收校正方法16,17在波长约3 Å范围内效果良好。对于更长的波长，则需要基于断层重建的解析吸收校正方法18，或采用激光烧蚀技术去除非衍射物质并将晶体切割成形状明确的样品19。后者还可帮助减小较大晶体的尺寸，因为在较长波长下进行X射线衍射实验时，较小的晶体效率更高14。在数据采集过程中维持样品低温环境的挑战通过传导冷却来解决，因为开放式气流冷源装置与真空环境不兼容。因此，需要使用高导热材料（如铜）将样品连接至脉管制冷机。在整个MX实验中广泛使用的不锈钢SPINE标准针，以及任何其他 commercially available 的样品支架，由于其热导率较差，均不适用于真空环境下的长波长MX实验。
用于真空内MX的样品托架（SHs）必须是热量移除热通路中的关键组成部分（图3A）。因此，它们由导热性良好的铜体制成，并包含一个销钉，具有两个重要特征：一是带有强磁体的底座，以确保与冷态测角仪头部之间形成充分的热连接；二是由聚酰亚胺制成的样品支架，以最大限度减少X射线的吸收和散射20。设计时已尽力确保晶体捞取和快速冷冻的操作体验与标准MX实践几乎完全相同。由于专用I23 SHs不能直接兼容其他同步辐射光束线，因此使用一种不锈钢适配器，以实现与晶体捞取用磁性探针以及其他MX光束线上的现有测角仪接口的兼容（图3B）。该适配器在利用其他Diamond MX光束线的自动化设施时也至关重要，这些设施基于ALS型机器人夹持头21和Unipuck式底座布局22，适用于在样品存在差异时快速进行初筛，从而挑选出衍射质量最佳的晶体。样品制备与装载流程可分为两个阶段：
第一阶段：由用户在其各自实验室中进行晶体收获与快速冷冻
在评估项目是否适用于 I23 数据收集后，会将带有与晶体尺寸相匹配的环（已预先装配好适配器）的样品托（SH）寄送至用户实验室，用于晶体捞取。为防止任何损坏，样品托和适配器不应分开，应作为一个整体单元，使用标准的晶体捞取磁性镊子，以适当尺寸的环捞取晶体。与常规MX实验一样，该操作在显微镜下手动完成，晶体随后立即在装有液氮的泡沫杜瓦瓶中进行快速冷冻23。由于磁力不匹配，目前样品托与Unipuck不兼容。样品的储存和运输采用Combipuck（见材料表），用户可根据需要申请获取，同时提供配套的干式运输罐插件（图3C）。这些样品托与广泛使用的Unipuck具有相同的底板，可在Diamond同步辐射光源的其他MX光束线上实现样品的快速预筛。在定制样品托实现商业化之前，向用户出借此类设备是目前最合适的安排。运输至光束线需使用MX领域通用的标准干式运输罐。
第二阶段：将冷冻冷却的样品转移至真空终端站
样品到达光束线后，需准备转移至真空终端站。此过程包括将样品架（SH）从组合样品盘（combipucks）中取出，并与适配器分离。将生物样品引入真空环境在冷冻电子显微镜领域已有常规操作，其中一些成熟的技术理念已被应用于I23线站的样品转移。简而言之，样品架在液氮环境中被转移至传样块上（图3D）。这些传样块具有优异的热导性和较大的热容，可防止晶体在真空条件下升温至玻璃化转变温度。最多可将四个传样块（每个可容纳四个样品）在液氮中装入一个传样块样品盘（图3H），该样品盘用于将样品转移至低温传样系统（CTS），或在实验间歇期间存放于液氮杜瓦瓶中。&#160;
由Diamond Light Source开发的低温转移系统由两个子组件构成：样品站和转移舱（图4A）。样品站包含一个用于临时储存蛋白质晶体的液氮浴，并具备特定功能以确保操作安全并提供用户友好的使用体验（图5）。该低温转移系统通过可编程逻辑控制器和用户友好的触摸屏界面进行控制。样品站内置发光二极管，以增强可视化效果；同时配备一组闭环控制的加热器，在样品转移完成后自动干燥液氮浴。系统还集成了多种传感器，以确保运行安全和高效。样品站具有定制化硬件，可提供可靠的电气接口，用于与转移舱交互操作，例如在样品转移过程中抽至粗真空，以及监测转移舱内的液氮液位和温度。
传输装置（图6）是一种便携式设备，用于从样品站的液氮浴中取出转移块，并在低温和真空环境下将其传送至终端站。该装置配备有液氮杜瓦瓶，以在传输过程中保持样品低温，同时具备杜瓦瓶内液位监测功能，以及多种用于操作和用户安全的传感器。传输臂采用磁力驱动设计，并设有精密加工的导槽，以引导用户安全地将转移块装入和卸出终端站。从传输装置到真空腔体的转移通过气闸室完成。气闸室是传输装置与终端站之间的接口，用于在打开传输装置和终端站的真空阀门之前，抽空传输装置与终端站之间的间隙空间。抽气和通气过程完全自动化，可通过带有用户友好界面的大尺寸触摸屏进行操作（图4C）。本方案用于将一个嗜热菌素晶体转移至真空终端站以进行数据采集。

<table><tbody><tr><td>12M 探测器</td><td>Dectris，瑞士</td><td></td><td>单光子计数X射线探测器</td></tr><tr><td>CombiPuck</td><td>MiTeGen</td><td>&lt;strong&gt;SKU: M-CBP-P1&lt;/strong&gt;</td><td>用于I23样品架及样品的低温储存与运输</td></tr><tr><td>晶体 harvesting 磁力棒</td><td>分子维度公司（Molecular Dimensions）</td><td>&lt;strong&gt;MD7-411&lt;/strong&gt;</td><td>用于晶体 harvesting</td></tr><tr><td>干式运输罐（CX100）</td><td>分子维度公司（Molecular Dimensions）</td><td>&lt;strong&gt;MD7-21&lt;/strong&gt;</td><td>用于I23样品架及样品的低温储存与运输</td></tr><tr><td>干式运输罐插件（CombiPuck 运输棒）</td><td>MiTeGen</td><td>&lt;strong&gt;SKU: M-CBP-PTC1&lt;/strong&gt;</td><td>用于I23样品架及样品的低温储存与运输</td></tr><tr><td>聚酰亚胺（Kapton）</td><td></td><td></td><td>由聚酰亚胺（Kapton）制成的样品支架</td></tr><tr><td>Perpsex 盖板</td><td></td><td></td><td>内置旋转键的丙烯酸盖板</td></tr><tr><td>甜蛋白（Thaumatin）粉末</td><td>&amp;nbsp;Sigma-Aldrich</td><td>&lt;strong&gt;T7638&lt;/strong&gt;</td><td>用于通过蒸气扩散法生长甜蛋白晶体</td></tr></tbody></table>

样品制备与转移方案：在 diamond light source 同步辐射光源 i23 光束线上进行真空内长波长晶体学实验

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

长波长大分子晶体学（MX）利用大分子中常天然存在的元素（如硫、磷、钾、氯或钙）的反常散射特性，从而无需额外标记即可通过实验相位法直接解析蛋白质和核酸的结构。为了消除此波长范围内X射线在空气中的显著吸收，这类实验需在真空环境中进行。位于英国钻石光源（Diamond Light Source）的I23光束线是全球首条为此类长波长MX实验专门设计和优化的同步辐射装置，其工作波长可延伸至5 Å。
为了实现这一点，一个大型真空容器包裹着样品环境的所有终端站组件。在真空条件下储存和收集数据时，为保持样品处于低温状态，必须使用具有高热导率的样品支架。这有助于高效散热，确保样品冷却至约 50 K。本方案描述了在 I23 光束线上进行样品制备及将其转移至真空环境中的操作步骤。通过遵循大分子晶体学领域内已建立的统一实践与方法，样品冷却至液氮温度的操作可在配备标准 MX 工具的任何实验室环境中完成。
样品的低温保存与运输仅需使用标准的市售设备。将低温冷却的晶体从液氮转移至真空终端站时，需要专用设备。本机构已自主开发了定制的样品处理工具和专用的低温转移系统（Cryogenic Transfer System, CTS）。采用本方案制备的样品所收集的衍射数据显示出色的合并统计参数，表明样品在操作过程中质量未发生改变。这为在标准同步辐射光束线波长范围之外开展真空内MX实验提供了独特的机会。

采用上述方案将甜蛋白晶体引入真空终端站。在波长为 2.7552 Å（能量为 4500 eV）的条件下收集衍射数据，共采集 3600 张图像，旋转步长为 0.1°，每张图像曝光时间为 0.1 秒。光束尺寸调整为 150 µm × 150 µm，并将透射率降低至 10%，对应的光通量为 7.1 × 109 光子/秒。选择 λ = 2.7552 Å 的波长，是在增强反常散射信号与样品吸收效应之间，以及在波长变长导致分辨率下降之间权衡的结果。尽管该波长远离硫元素的理论吸收边（λ = 5.0095 Å），但在该波长下，硫的散射因子虚部 f" 为 1.57 e-，相比 1.7 至 2 Å 波长范围内的值，增强了 1.6 至 2.1 倍。由此产生的更强反常信号使得在更具挑战性的项目中成功实现硫原子单波长反常散射（S-SAD）相位测定成为可能。
在 I23 光束线上已利用该波长采集的数据成功开展了多种具有挑战性的相位测定实验24,25,26,27。尽管在更短波长下也可实现硫原子单波长反常散射（S-SAD）的相位测定，但这通常需要合并多个同晶型晶体的数据以累积足够的反常信号，使数据多重性超过 10028。由于在较长波长下反常信号显著增强，大多数在 I23 光束线上完成的相位测定项目仅需单个晶体的数据即可完成。典型的衍射图像如图7左侧所示。使用 Xia2-3dii29 进行数据处理获得了优异的合并统计指标，详见表1。图7右侧展示了甜蛋白（thaumatin）数据集中一张代表性衍射图像的部分区域，显示了布拉格衍射点周围极低的背景信号。这种低背景特性是真空实验装置的典型特征，可确保仅有样品散射的X射线到达探测器，从而获得较高的 I/σ(I) 值。
最高可达到的分辨率为1.8 Å，这是由于探测器的几何构型以及所选用的X射线波长决定的。该数据集产生了很强的反常散射信号，体现在反常正态概率参数的中段斜率为2.677，从而促进了通过自动相位解析流程CRANK2进行结构解析。最终获得的高质量电子密度图使得Buccaneer能够成功实现自动模型构建。30 CRANK2 中的一个模块31，对仙茅蛋白氨基酸序列的100%位置均实现了准确定位。使用ANODE计算的定相反常差值傅里叶图11，揭示了16个结构非常有序的硫原子，以及来自Cys159的一个具有两种替代构象的硫原子，这通过反常散射原子位置处18个显著峰高的峰值得以证实 表2. 索马甜中的16个半胱氨酸残基形成了8个二硫键，这些二硫键在2Fo-Fc图中均清晰可见图8).
<img alt="X射线吸收与分辨率图表，显示能量水平；Ca、K、Cl、S、P元素的光谱分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：长波长MX实验获得的高分辨率衍射数据。（A）f"值随能量变化的曲线图，显示在I23光束线上可探测到的轻元素吸收边。（B）P12M探测器四角处可达到的最高分辨率随能量的变化。缩写：MX = 大分子晶体学。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="X射线断层扫描装置示意图，包含测角仪、探测器、样品位置及成像过程细节。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：真空腔体的水平截面图，显示终端站所有组件。 缩写：OAV = 同轴观察系统。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="质谱设备组件，镀金探针；实验装置，精密测量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：样品处理工具。（A）I23 样品托架。（B）MX 脊柱标准针（左侧）与带适配器的 I23 样品托架（右侧）对比。（C） 带 I23 样品托架（蓝色）的 Combipuck 盖与底座。带两个转移块（金色）的 Block puck 盖与底座。后方可见一种适用于 Combipuck 和 Block puck 的干式运输罐手杖。（D） 带四个 I23 样品托架的转移块。（E） 用于旋转 Block puck 底座的钥匙工具。（F） 分隔棒。（G） 带两个箭头指示高低档位的 Puck 分隔工具。（H） 带四个空铜块的 Block puck 底座。（I） Block puck 的盖子。（J） 泡沫容器，内含将样品托架从 Combipuck 底座转移至铜块所需的所有工具。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="带有控制面板的低温系统装置；实验分析设备及内部腔室视图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：低温转移系统。（A）连接有转移舱的 CTS 样品站，以及用于加液的漏斗。（B）一个载样托盘，其中放置了两个转移块，位于 CTS 内部。（C）CTS 控制软件触摸屏。缩写：CTS = Cryogenic Transfer System（低温转移系统）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="触摸屏、样品架旋转装置、液氮传感器组成的低温工作站示意图，用于样品制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：低温转移系统样品站。 缩写：LEDs = 发光二极管；LN2 = 液氮。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="液氮转移系统示意图；组件标注；杜瓦瓶，手柄；低温使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：低温转移系统转运装置。 缩写：LEDs = 发光二极管；LN2 = 液氮。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="转染效率热图、基因编辑实验结果、颜色编码的数据分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：衍射图像。左侧，来自收集的仙茅蛋白晶体数据集的一张衍射图像。右侧，被低计数背景像素包围的衍射斑点。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结构分析；晶体学；示意图；电子密度图；分子构象。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图8"> 
图8：利用自动流程CRANK2（默认设置，无后续精修）解析的甜蛋白（Thaumatin）结构。（A）甜蛋白的整体结构，显示1.6σ水平的2Fo-Fc电子密度图（蓝色）以及在ANODE中计算得到的5σ水平带相位的反常差值傅里叶图（绿色）。（B）仅显示5σ水平带相位的反常差值傅里叶图的甜蛋白整体结构。（C）甜蛋白中二硫键的局部放大图，显示1.6σ水平的2Fo-Fc电子密度图（蓝色）和5σ水平的带相位的反常差值傅里叶图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>名称</td>
			<td>Thaumatin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>数据收集波长 (Å) (能量 (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>图像数量 × 每帧角度 (°)</td>
			<td>3600 × 0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>空间群</td>
			<td>P 41212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>晶胞常数</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>分辨率 (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>完备性</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rmeas</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rpim</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>多重性</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>中点斜率</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：在DLS的I23线站使用2.755 Å波长测定的甜蛋白（Thaumatin）数据收集与处理统计信息。分辨率、完整性、Rmerge、Rmeas、Rpim、CC1/2、I/σ(I) 和冗余度的高分辨率区间数据在括号中列出。缩写：DLS = Diamond Light Source。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>最近的原子</td>
			<td>峰高（sigma）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS9</td>
			<td>25.83</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS56</td>
			<td>25.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MET112</td>
			<td>24.54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS149</td>
			<td>24.37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS126</td>
			<td>24.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS145</td>
			<td>24.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS134</td>
			<td>23.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS177</td>
			<td>23.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS204</td>
			<td>23.43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS66</td>
			<td>23.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS164</td>
			<td>22.54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS193</td>
			<td>22.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS158</td>
			<td>21.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS77</td>
			<td>21.21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS121</td>
			<td>20.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS71</td>
			<td>19.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS159_1</td>
			<td>12.27</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CYS159_2</td>
			<td>8.34</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：由CRANK2生成的定相并自动构建的模型，经ANODE计算得到的反常差值傅里叶图峰值高度。

本文介绍了一种用于在 Diamond Light Source 的 I23 光束线上进行长波长大分子 X 射线晶体学实验的低温样品制备方法，以及将晶体转移至真空终端站的实验方案。

样品制备与转移方案：在 Diamond Light Source 同步辐射光源 I23 光束线上进行真空内长波长晶体学实验

长波长宏分子晶体学（MX）利用硫、磷、钾等元素的反常散射特性，……

长波长大分子晶体学利用蛋白质和核酸中天然存在的轻原子所产生的反常散射信号。该技术用于实验求解晶体学相位问题，并确定这些元素的种类与位置。位于钻石光源（Diamond Light Source）的I23线站是一种独特的同步辐射装置，专为长达五埃波长的实验而优化设计。它能够探测具有重要生物学意义的元素的吸收边，例如钙、钾、氯、硫和磷。由于长波长范围内的X射线会被空气显著吸收，因此这些实验需在真空环境中进行。为了在真空环境中使样品保持低温，晶体被安装在专用的、具有良好热导性的样品支架上。将低温样品从液氮转移至真空终端站的过程与冷冻电子显微镜中使用的技术非常相似。本方案介绍了使用英国钻石光源（Diamond Light Source）开发的工具和设备将晶体转移至真空环境的操作步骤。首先将CombiPuck的盖子与底座分离，使样品支架仍附着在底座上，而小管则保留在盖子中。将装有样品管的盖子浸入液氮中，然后将样品架和适配器连接到磁性取样棒上，收集晶体。将每个样品直接快速冷却并装入CombiPuck中，记录样品位置。使用样品盘取样棒将底座与盖子连接，以封闭样品盘。将CombiPuck从液氮转移至干式运输罐或储存容器中。将已装有空转移块的块状插槽底座放置于泡沫容器内的支撑底座上，然后注入液氮。接着，将CombiPuck放入盛有液氮的泡沫容器中，确保插槽底座固定在泡沫容器内部的磁性固定装置上。将所有必要工具在液氮中预冷。然后，使用载物盘分离工具的高档设置，将盖子与底座分开，使底座仍固定在磁性支架上，从而在液氮中暴露出内部的样品架。将分离棒垂直放置在样品架和适配器上方，并尽可能向下插入，确保分离棒保持垂直。用拇指将分离器探头上的小杠杆向下推动，直至听到咔嗒声，以固定样品架，然后从适配器中拉出样品架。将分离器移至目标转移板位置上方，确保三个支脚中的一个插入转移板的中心孔中。向上拨动杠杆，释放样品架。将样本载入下一个转移模块时，使用转盘钥匙工具将一个空的转移模块旋转至水平位置。当所有样本架转移完毕后，将盖子浸入液氮中，然后盖上模块盒以封闭模块。等待温度平衡后，将盖子完全扣合到底座上，轻轻提起，使其从转盘上脱离。将穿梭车连接至工作站。打开氮气和空气阀门，并确保气体正常流动。然后，启动 CTS。使用液氮冷却浴槽和转移架。将提供的漏斗放入转移架的加注口，同时在屏幕监控液位，缓慢将液氮倒入漏斗中。当指示器由红色变为蓝色时停止加注。使用漏斗将液氮注入水浴中。利用附带的样品托盘分离工具，将一个样品托盘从液氮转移至 CTS 水浴中。取下样品托盘的盖子，并盖上 CTS 水浴的盖子。将转移块装入转运装置时，顺时针旋转手柄90度以解锁，然后将手柄向前推进至浴槽，使手柄上的导轨确保其沿正确路径移动。待块盖冷却后，继续推进手柄，将转移块装入转运装置。要将转移块锁定在转运装置上，请将手柄顺时针旋转180度。将手柄拉回到初始后方位置，并通过逆时针旋转90度将其锁定。在显示屏上按下“关闭穿梭阀泵”以开始抽空穿梭舱。当触摸屏上显示“穿梭舱准备就绪，可移动”和“请勿移动推杆，阀门已关闭”信息后，按下滑座下方的杠杆，并使用顶部手柄小心地将其抬起。将样品传输舱以直立位置运送至真空终端站的气闸室并进行连接。通过触摸屏按下相应按钮，选择腔体内的空位，并将样品架移至正确的装载位置。当样品架到位后，按下“打开”按钮，启动真空联锁程序。当序列完成后，状态变为“气闸开启”，将穿梭装置插入，顺时针旋转手柄90度以解锁推杆。轻柔地将推杆推入容器，使导轨强制推杆沿正确路径移向样品存储舱。根据屏幕上显示的视频画面，缓慢将转移块插入存储舱，并确保触摸显示屏上的块位置图标已激活。激活后，将手柄逆时针旋转180度以释放转移块，并将推杆从容器中拉出。完全缩回后，将手柄再逆时针旋转90度以锁定推杆。按下“关闭”按钮，关闭末端站真空阀，使推杆与容器之间的空间通气至大气压。当气闸显示状态为“OK to detach”时，取下穿梭器。将穿梭器放回 CTS 浴槽中，并按下“Open Shuttle Valve”以在装载下一个样本块之前排空穿梭器。当交通灯变为绿色且显示“OK to move rod”消息时，可将下一个转移块引入穿梭器。为准备下一个转移块，请在浴槽内旋转样本块载具。将亚克力盖顶部的内置旋转钥匙向下推入样本块载具中心的锁孔中。在保持按压的同时，转动钥匙，使所需的转移块位于拾取位置。所有样品块转移完成后，确保穿梭阀处于打开状态，按下触摸屏上的“Bake”按钮，选择“Bath”和“Shuttle”，然后按下“Start Bake”。位于Diamond Light Source的长波长大分子晶体学光束线I23能够接近具有重要生物学意义元素的吸收边，例如钙、钾、氯、硫和磷，从而获得增强的反常散射信号，可用于相位确定或定位这些元素在大分子中的位置。衍射数据来自一颗甜蛋白（thaumatin）单晶，波长选择为2.75 Å，是在增强的反常信号与长波长下样品吸收效应之间权衡的结果。真空装置确保只有被样品散射的X射线到达探测器，从而在布拉格衍射峰周围提供低背景信号。该数据集产生了非常强的反常散射信号，有助于通过自动相位解析流程CRANK2解决结构问题。所得电子密度图质量很高，实现了成功的自动模型构建，甜蛋白（thaumatin）氨基酸序列的100%残基均被正确放置。索马atin中的16个半胱氨酸残基形成了8个二硫键，这些二硫键在电子密度图中均清晰可见。由于真空长波长蛋白质晶体学是一个新兴领域，我们开发了新的样品处理工具和设备。本方案指导用户如何在Diamond Light Source的I23光束线上，安全地将样品转移至真空终端站。真空环境为开展其他光束线无法实现的波长范围内的衍射实验提供了独特机遇。长波长X射线晶体学能够直接从天然晶体对大分子进行实验相位测定，同时也可明确鉴定与分子结合的离子。

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