薄层色谱分析分枝杆菌的脂质成分
April 16th, 2021
提出一个协议，以提取各种分枝杆菌细胞壁的总脂质含量。此外，还显示了不同类型的肌酸的萃取和分析协议。还提供了一个薄层色谱协议来监测这些分形化合物。
分枝杆菌脂质是属的重要特征，在宿主分枝杆菌相互作用中至关重要。速度和多功能性是此过程的主要优点。该方法可用于了解脂质的作用和分枝杆菌的致病性及其免疫刺激作用。
对于非共价连结脂质提取，在层压流罩下带有 PTFE 衬里螺丝盖的玻璃管中加入 15 毫升一至两个氯仿到甲醇溶液中。然后，从固体介质中划出200毫克的分枝杆菌，并将分枝杆菌添加到玻璃管中。用不断的搅拌在一夜之间孵育管子。
第二天，通过玻璃漏斗将有机溶剂过滤成玻璃管，该漏斗内衬过滤纸。使用氮气通量后，蒸发管中的液相，用氮气填充管子，将管子储存在摄氏四度。然后，在细胞碎屑中加入 15 毫升 2 到 1 氯仿的甲醇溶液，并通过不断搅拌在一夜之间孵育管子。
第二天早上，让混合物休息一小时，然后使用巴斯德移液器将有机溶剂转移到过滤纸衬里玻璃漏斗中，放入同一个玻璃收集管中。然后，蒸发液相，如所示，然后用氮气重新填充管中四摄氏度的储存。对于肌酸提取，在带PTFE衬里螺丝盖的密封玻璃管中加入2至5毫升的搅拌溶液和200毫克的分枝杆菌生物量，并通过涡流混合内含物。
在80摄氏度的干燥浴池中将混合物孵化过夜。第二天，当管子冷却室温时，加入两毫升N六烷，并通过漩涡混合30秒。让管子沉淀，直到出现两个清晰的相位，并将上 N 六烷相转移到新管中。
将另外两毫升N六烷与管内含物混合，并再次收集上层。然后，通过氮流蒸发管内的成分，并将覆盖在氮气中的样品储存在摄氏四度。如所示。要通过 TLC 将样品用一块滤纸覆盖 TLC 腔室的一面墙，请在腔室角添加凡士林来密封腔室，将溶剂混合物涂在过滤纸上，并将溶剂的剩余体积添加到 TLC 室的底部。
关闭 TLC 室至少 20 分钟以饱和。同时，溶解200至1000微升氯仿玻璃管中的脂质，并使用毛细管玻璃管将10微升脂质氯仿悬浮剂直接涂抹在TLC板上。允许样品干燥五分钟后，将板插入饱和 TLC 室，并允许移动相流穿过 TLC。
当溶剂到达离板的上端一厘米时，将板置于层压通量下，直到二氧化硅完全干燥。然后，在乙醇中用 15 到 20 毫升 10% 摩尔数据磷酸水合物喷洒干板，直到板为亮黄色，并在 120 摄氏度下加热板两到五分钟。在这种具有代表性的分析中，利用两种不同的脱液系统和二维TLC，通过一维TLC对从各种分枝杆菌中提取的支核酸进行了分析。
还进行了两种甲基化程序，以确认五型肌酸的存在。在这两个分化系统中，肌酸大约位于板的中间，尽管，与五型肌酸对应的点，只有在皂化后才被观察到。二维TLC还允许识别单个肌酸类型。
例如，支核酸只表示一型肌酸，肌杆菌BCG表示一型和四型，分子细菌表示一型和五型，分不分母体表示一型和二型肌酸。从各种分枝杆菌物种的总脂质提取物被分析在其极性和大小的功能。它揭示了大多数A极地脂质，如PDIM，存在于麦芽草，但不是在分温杆菌，分核酸菌布鲁马和M abcesus的光滑的太平缓型。
酚酸甘油脂只存在于BCG的分细菌中，而糖肽只在分不育的样品中观察到。与霉菌酸类似，乙酰甘油和 PDIM、PIM 也可以通过一维 TLC 或 2D TLC 分析轻松可视化。使用两种类型的污渍在一维 TLC 中显示 PIM。
在尝试此协议时，要记住的最重要的事情是在整个过程中不要使用任何塑料仪器。
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概述
本文介绍了一种从各种分枝杆菌的细胞壁中提取总脂质含量的协议。它还详细说明了不同类型的分枝酸的提取和分析方法，并包括用于监测这些化合物的薄层色谱协议。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 生物化学
- 致病性
背景
- 分枝杆菌脂质对于理解宿主相互作用至关重要。
- 这些脂质在分枝杆菌的致病性中起着重要作用。
- 了解脂质提取可以帮助研究它们的免疫刺激作用。
- 所描述的方法为脂质分析提供了速度和多功能性。
研究目的
- 提供从分枝杆菌中提取脂质的可靠协议。
- 分析分枝酸在分枝杆菌生物学中的作用。
- 促进对分枝杆菌致病机制的研究。
使用的方法
- 使用氯仿和甲醇提取非共价链接的脂质。
- 将分枝杆菌样品纳入提取过程。
- 在不断搅拌下孵育以确保彻底提取。
- 薄层色谱法监测提取的化合物。
主要结果
- 成功从分枝杆菌细胞壁中提取总脂质含量。
- 通过分析方法识别各种分枝酸。
- 证明薄层色谱法在监测脂质化合物方面的有效性。
结论
- 所提出的协议对从分枝杆菌中提取脂质是有效的。
- 了解脂质谱可以增强对分枝杆菌致病性的认知。
- 这种方法可以应用于进一步研究分枝杆菌与宿主的相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Comprehensive lipid profiling of mycobacteria using thin layer chromatography (TLC) enables precise characterization of cell wall components critical for understanding pathogenicity and immunomodulatory potential. This workflow supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by distinguishing lipid classes and mycolic acid types across diverse mycobacterial species. The approach enhances predictive confidence for translational research and portfolio triage in infectious disease and immunotherapy pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of lipid-mediated virulence mechanisms and host-pathogen interactions.
- Supports functional target validation by differentiating species-specific lipid signatures.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct visualization of mycolic acid and surface lipid diversity.
- Provides actionable data for prioritizing targets with immunomodulatory relevance.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lipid extracts for downstream phenotypic or biochemical assays.
- Standardizes TLC-based lipid analysis for reproducible, quantitative comparison across strains.
- Enables scalable screening of lipid profiles to support compound evaluation and lead identification.
- Delivers robust platform for cross-study and cross-species lipidomic benchmarking.
Translational & Preclinical Research
- Aligns lipid biomarker profiles with disease-relevant mycobacterial models.
- Ensures continuity from discovery-stage lipid analysis to preclinical validation of immunomodulatory effects.
- Supports risk-adjusted advancement of candidates targeting lipid-mediated pathways.
- Provides mechanistic insights for translational biomarker development.
Pipeline & Workflow Integration
This TLC-based lipid analysis method integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, target validation, and translational biomarker alignment in mycobacterial R&D.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of lipid function and diversity in mycobacteria.
- Screening: Provides reproducible, quantitative lipid profiles for assay development and compound screening.
- Analytics: Delivers clear TLC readouts for comparative analysis of lipid classes and mycolic acid types.
- Translational Research: Connects lipidomic findings to disease models and immunomodulatory candidate evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical platform for broad mycobacterial lipid studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in lipid-targeted research.
- Operational Value: Standardizes lipid extraction and TLC analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying lipid-driven biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunomodulatory and anti-infective candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid extraction, TLC operation, and interpretation of lipidomic profiles.
- Demands access to organic solvent handling infrastructure and glassware to avoid contamination.
- Necessitates cross-team standardization of extraction and TLC protocols for reproducibility.
- Adaptable to a wide range of mycobacterial species and model systems.
- Plastic instruments must be avoided to prevent interference with organic solvent extraction.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
Extraction of The Total Non-Covalent-Linked Lipids from Mycobacteria
2:13
Mycolic Acid Extraction by Acid Methanolysis
3:26
Thin Layer Chromatography (TLC) Analysis
4:57
Results: TLC Analysis of the Lipid Composition in Different Species of Mycobacteria
7:15
Conclusion
