Name: 薄层色谱分析分枝杆菌的脂质成分 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 了解薄层色谱法分析分枝杆菌脂质成分的技术流程。该方法采用有机溶剂提取与TLC分离，适用于Mycobacterium bovis BCG等多种分枝杆菌的脂质谱鉴定，助力研究其致病机制与免疫调节功能。

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本研究由西班牙科学、创新与大学部（RTI2018-098777-B-I00）、欧洲区域发展基金（FEDER Funds）以及加泰罗尼亚自治区政府（2017SGR-229）资助。Sandra Guallar-Garrido 获得了加泰罗尼亚自治区政府提供的博士研究生合同（FI）。

1. 从分枝杆菌中提取总非共价结合脂质（图1）
<ol>
	<li>从固体培养基上刮取0.2 g分枝杆菌，加入带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺旋盖的玻璃试管中。加入5 mL氯仿和10 mL甲醇组成的溶液（氯仿:甲醇，1:2）。 
	注意：使用有机溶剂时，必须使用玻璃容器，禁止使用塑料容器。此外，瓶子必须使用带PTFE衬垫的螺旋盖。 
	警告：氯仿是一种潜在有毒且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。 
	警告：甲醇是一种潜在有毒且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。</li>
	<li>将试管持续搅拌过夜，以提取分枝杆菌细胞表面非共价结合的脂质。 
	注意：若无轨道摇床，可尽可能频繁地进行定期手动搅拌以替代持续搅拌。</li>
	<li>用滤纸覆盖玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并将其收集至玻璃试管中。</li>
	<li>使用氮气流蒸发试管中的液相。用氮气充满试管，盖好后于4 °C保存。 
	注意：可将玻璃巴斯德吸管连接至氮气流，以精确对目标试管进行蒸发。此外，可将试管置于37 °C的干式恒温金属浴中。当溶剂完全蒸发后，在封闭前先用氮气充满试管。</li>
	<li>向细胞残渣中加入15 mL氯仿:甲醇（2:1）溶液。将试管持续搅拌过夜，以提取分枝杆菌细胞表面非共价结合的脂质。 
	注意：若无轨道摇床，可尽可能频繁地进行定期手动搅拌以替代持续搅拌。</li>
	<li>让混合物静置1小时。用巴斯德吸管回收有机溶剂。用滤纸覆盖玻璃漏斗，过滤有机溶剂，并收集至步骤1.3中 previously used 的同一玻璃试管中。使用氮气流蒸发试管中的液相。用氮气充满试管，盖好后再次于4 °C保存。</li>
</ol>
2. 通过酸性甲醇解提取分枝菌酸（图2A）
<ol>
	<li>向一个带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺旋盖的密闭玻璃管中加入 2–5 mL 酯化溶液。将 0.2 g 分枝杆菌生物量加入该玻璃管中。 
	注意：酯化溶液由 30 mL 甲醇、15 mL 甲苯和 1 mL 硫酸混合而成。分枝杆菌细胞可来自固体培养物，或在提取分枝杆菌中全部非共价连接脂质后所得的脱脂细胞（步骤 1.6 过滤后剩余的细胞）。 
	警告：甲苯为易燃且高度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。 
	警告：硫酸为腐蚀性且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。</li>
	<li>通过涡旋混合内容物。将混合物置于 80 °C 干浴中静置过夜。</li>
	<li>让试管冷却至室温，然后向试管中加入 2 mL 正己烷。涡旋振荡 30 秒以混合内容物，静置试管直至出现两个清晰的相层。 
	警告：正己烷为潜在的易燃物，具有刺激性，对环境有害且高度危险。必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。</li>
	<li>收集对应于正己烷相的上层相，并转移至新试管中。</li>
	<li>重复步骤 2.3。再次收集上层相，并转移至步骤 2.4 中使用的同一试管中。</li>
	<li>使用氮气气流吹干试管中的内容物。用氮气充满试管，密封后于 4 °C 保存。</li>
</ol>
3. 通过皂化和甲基化提取分枝菌酸（图2B）
<ol>
	<li>从固体培养基上刮取 0.2 g 分枝杆菌，加入带有聚四氟乙烯（PTFE）螺旋盖的玻璃试管中。</li>
	<li>加入 2 mL 含 5% 氢氧化钾的甲醇-苯溶液（80:20）。通过涡旋混合内容物。在 100 °C 下加热混合物 3 小时。 
	警告：苯为易燃、致癌且有害物质，必须在层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。</li>
	<li>让试管冷却至室温。加入 20% 硫酸将样品酸化至 pH = 1。</li>
	<li>加入 3 mL 乙醚。通过涡旋轻轻混合内容物。</li>
	<li>静置使两相分层。收集乙醚相并转移至新试管中。重复洗涤步骤，共进行三次。</li>
	<li>用 2 mL 蒸馏水洗涤乙醚提取物，将上层乙醚相转移至新试管中。重复洗涤步骤，共进行三次。</li>
	<li>在乙醚提取物中加入 2 g 无水硫酸钠以进行干燥。</li>
	<li>过滤悬浮液。使用氮气流吹干内容物。</li>
	<li>进行甲基化步骤时，将 3 g N-亚硝基-N-甲基脲溶解于预冷的溶液中，该溶液由 45 mL 乙醚和 9 mL 40% 氢氧化钾水溶液组成。 
	警告：N-亚硝基-N-甲基脲为有毒、刺激性、致癌且有害物质，必须在层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。</li>
	<li>将上清液（重氮甲烷）转移至另一已置于冰中冷却的烧瓶中，烧瓶内含氢氧化钾颗粒（约 30 g）。 
	注意：若上清液未立即使用，可在 -20 °C 下保存最多 1 小时。 
	警告：氢氧化钾颗粒为刺激性和腐蚀性物质，必须在层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。 
	警告：重氮甲烷具有高毒性且可能爆炸，必须在配备安全玻璃的层流罩内操作，并佩戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和丁腈手套）。</li>
	<li>将步骤 3.10 中获得的含重氮甲烷的 2 mL 乙醚溶液加入步骤 3.8 中获得的含分枝菌酸的干燥乙醚提取物中。在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>在 40 °C 下蒸发悬浮液。用氮气充满试管，密封后于 4 °C 保存甲基化脂质。 
	&#8203;注意：在层流罩中将乙醚溶液中的重氮甲烷完全蒸发，直至乙醚失去黄色。</li>
</ol>
4. 薄层色谱（TLC）分析
<ol>
	<li>使玻璃薄层色谱（TLC）展开槽充分饱和。为此，将一张滤纸贴在TLC展开槽的一侧内壁上，并使其与由混合溶剂组成的流动相接触。将剩余的溶剂倒入TLC展开槽底部。 
	注意：TLC展开槽底部必须至少覆盖1 cm深的流动相。在本实验中，使用了不同的流动相来展开TLC板。这些流动相包括：85 mL正己烷加15 mL乙醚；100 mL二氯甲烷；90 mL氯仿、10 mL甲醇和1 mL水；30 mL氯仿加8 mL甲醇和1 mL水；60 mL氯仿加35 mL甲醇和8 mL水；95 mL氯仿加5 mL甲醇；以及90 mL石油醚（60-80 °C）加10 mL乙醚。 
	注意：在二维TLC分析中，第一向使用正己烷:丙酮（95:5）展开三次，第二向使用甲苯:丙酮（97:3）单次展开，用于分析分枝菌酸组成。分析磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIMs）时，第一向使用氯仿:甲醇:水（60:30:6）展开一次，第二向使用氯仿:乙酸:甲醇:水（40:25:3:6）展开。分析分枝菌酸二酯（PDIM）和阿拉伯半乳聚糖（AG）时，第一向使用石油醚（60-80 °C）:乙酸乙酯（98:2）展开三次，第二向使用石油醚（60-80 °C）:丙酮（98:2）单次展开。 
	警告：乙醚为潜在有毒且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。 
	警告：二氯甲烷为潜在有毒且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。 
	警告：石油醚为易燃、对环境有害且极度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。 
	警告：乙酸为易燃且具有腐蚀性的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。 
	警告：乙酸乙酯为易燃且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。 
	警告：丙酮为易燃且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。</li>
	<li>关闭TLC展开槽，使其饱和至少20分钟。在此期间，将玻璃试管中的脂质溶解于0.2–1 mL氯仿中。 
	注意：溶解脂质所用体积可根据样品预期浓度进行调整。</li>
	<li>使用毛细玻璃管将每种悬浮液各取10 µL直接点样于TLC板上，并在室温下干燥5分钟。 
	注意：样品应点在板的底部区域，两侧各留出1 cm空间。各样品点之间应至少间隔0.5 cm。样品点样完成后，试管可用氮气再次吹干，并于4 °C保存以备后续使用。</li>
	<li>将TLC板插入含有流动相的饱和展开槽中，使流动相沿板展开。 
	注意：任何对TLC展开槽的移动都会影响板上溶剂的运行，进而影响脂质的迁移。若进行二维TLC分析，则需要两个TLC展开槽分别容纳两种洗脱体系。</li>
	<li>当溶剂前沿距离TLC板顶端约1 cm时，取出TLC板，并置于层流条件下直至硅胶完全干燥。 
	注意：若分析分枝菌酸组成并使用正己烷:乙醚（85:15）作为流动相，&#160;需重复步骤4.4和4.5两次，共进行三次展开。</li>
	<li>使用所需的显色剂显色；如需加热，则对TLC板加热。 
	注意：在本实验中，使用15–20 mL以下溶液喷雾显色：10%磷钼酸水合物乙醇溶液，喷至板面呈亮黄色，随后在120 °C加热；5% α-萘酚乙醇溶液（由20% α-萘酚硫酸溶液配制）&#160;喷雾后于120 °C加热；钼蓝试剂（4.2 M硫酸中含1.3%三氧化钼），喷至出现磷酸酯条带，或使用1%蒽酮硫酸溶液显色。 
	警告：磷钼酸水合物为易燃且具腐蚀性的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。 
	警告：乙醇为潜在易燃且危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。 
	警告：1-萘酚为易燃、具腐蚀性且极度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。 
	警告：钼蓝喷雾试剂为具腐蚀性、有毒且极度危险的物质，必须在层流罩内操作，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、护目镜和腈手套）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种提取分枝杆菌细胞壁中非共价连接脂质化合物的简单方案，该方法被视为金标准。此外，还展示了从四种不同分枝杆菌提取的脂质通过一维和二维薄层色谱（TLC）进行的进一步可视化结果。
连续使用两种氯仿与甲醇的混合液来提取分枝杆菌细胞中的脂质成分，是目前最广泛使用的溶剂组合23,24,25,26,27,28,29。该混合液能够从细胞中回收多种非极性和极性脂质。然而，文献中也已报道其他用于提取总脂质或特定分枝杆菌脂质的方法，Hameed 等人近期对此进行了综述29。例如，Fol...

分枝杆菌属 是一个包含致病性和非致病性物种的属，其特征是具有由特殊脂质构成的高度疏水且不可渗透的细胞壁。具体而言，分枝杆菌细胞壁含有分枝菌酸，这类物质为α-烷基、β-羟基脂肪酸，其中α-支链在所有分枝菌酸中均保持一致（长度除外），而β-链（称为全分枝菌酸链）是一条长链脂肪族链，可能含有多种不同的官能团，根据文献记载包括（α-、α'-、甲氧基-、κ-、环氧基-、羧基-和ω-1-甲氧基-分枝菌酸），因而形成七种类型的分枝菌酸（I–VII）1此外，分枝杆菌细胞壁中还含有其他具有明确重要性的脂质。例如，致病性分枝杆菌种类 结核分枝杆菌， 的&#160;结核病的致病因子2 产生特定的脂质类毒力因子，例如分枝菌酚二霉菌酸酯（PDIMs）、酚糖脂（PGL）、二酰基、三酰基和五酰基海藻糖（DAT、TAT 和 PAT）或硫酸化脂质等3它们存在于分枝杆菌表面，被认为与调控宿主免疫反应的能力相关，因而影响分枝杆菌在宿主体内的演化与持续存在4例如，三酰甘油（TAG）的存在与北京谱系2-亚谱系的高毒力表型相关 M. tuberculosis 可能是因为其能够减弱宿主的免疫反应5,6其他相关脂质包括存在于结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌中的脂寡糖（LOSs）。在以下情况下 Mycobacterium marinum，其细胞壁中脂寡糖（LOS）的存在与其滑行运动能力以及形成生物膜的能力相关，并可干扰巨噬细胞模式识别受体的识别，影响宿主吞噬细胞对细菌的摄取与清除7,8此外，某些脂质的缺失或存在可使同一物种的不同成员在与宿主细胞相互作用时表现出毒力或减毒特征，从而被划分为不同的形态型。例如，粗糙形态型中糖肽脂质（GPL）的缺失 脓肿分枝杆菌 与诱导吞噬体内部酸化以及随之发生的细胞凋亡能力相关9，而光滑型菌株的表面含有GPLs。此外，分枝杆菌细胞壁的脂质含量与其调控宿主免疫反应能力相关。这一点在利用某些分枝杆菌诱导针对不同疾病的保护性免疫应答时具有重要意义10,11,12,13.&#160;例如，已有研究证明 Mycolicibacterium vaccae一种腐生性分枝杆菌，目前正处于作为结核病免疫治疗疫苗的III期临床试验阶段，表现出两种菌落形态型。含有表面聚酯的光滑型表型可触发Th2反应，而缺乏聚酯的粗糙型表型在与宿主免疫细胞相互作用时可诱导Th1反应。14分枝杆菌细胞中存在的脂质谱不仅取决于分枝杆菌的种类，还取决于分枝杆菌培养的条件：孵育时间15,16 或培养基的成分17,18事实上，培养基成分的改变会影响抗肿瘤和免疫刺激活性 M. bovis BCG&#160;和 分枝杆菌属布鲁马埃菌体外实验17此外，由...引发的保护性免疫特征 M. bovis 卡介苗抗 M. tuberculosis 小鼠模型中的挑战也取决于所使用的培养基 M. bovis BCG 生长17这些结果可与不同培养条件下分枝杆菌的脂质组成相关联。基于上述原因，研究分枝杆菌的脂质含量具有重要意义。本文展示了一种用于提取和分析分枝杆菌细胞壁脂质组成的可视化实验方法。

<table><tbody><tr><td>乙酸</td><td>Merck</td><td>100063</td><td>注意。用于分析的无水乙酸 EMSURE&amp;reg; ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Carlo Erba</td><td>400971N</td><td>注意。丙酮 RPE-ACS-ISO 用于分析，1000 ml</td></tr><tr><td>蒽酮</td><td>Merck</td><td>8014610010</td><td>用于合成的蒽酮。</td></tr><tr><td>苯</td><td>Carlo Erba</td><td>426113</td><td>注意。苯 RPE - 用于分析 - ACS，2.5 L</td></tr><tr><td>毛细玻璃管</td><td>Merck</td><td>BR708709</td><td>BRAND&amp;reg;&amp;nbsp;一次性 BLAUBRAND&amp;reg;&amp;nbsp;微量移液管，intraMark</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Carlo Erba</td><td>412653</td><td>注意。氯仿 RS - 用于高效液相色谱（HPLC）- 等度级 - 以乙醇稳定，2.5 L</td></tr><tr><td>干燥块式加热器</td><td>J.P. Selecta</td><td>7471200</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Carlo Erba</td><td>412622</td><td>注意。二氯甲烷 RS - 用于高效液相色谱（HPLC）- 等度级 - 以烯烃稳定，2.5 L</td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Carlo Erba</td><td>412672</td><td>注意。乙醚 RS - 用于高效液相色谱（HPLC）- 等度级 - 未稳定，2.5 L</td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Panreac</td><td>1313181211</td><td>注意。乙酸乙酯（Reag. USP, Ph. Eur.）用于分析，ACS, ISO</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Carlo Erba</td><td>4146072</td><td>注意。无水乙醇 RPE - 用于分析 - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP，1 L</td></tr><tr><td>玻璃漏斗</td><td>VidraFOC</td><td>DURA.2133148 1217/1</td><td></td></tr><tr><td>玻璃试管</td><td>VidraFOC</td><td>VFOC.45066A-16125</td><td>带聚四氟乙烯（PTFE）盖的玻璃试管</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Carlo Erba</td><td>412722</td><td>注意。甲醇 RS - 用于高效液相色谱（HPLC）- GOLD - 超梯度级，2.5 L</td></tr><tr><td>钼磷酸水合物</td><td>Merck</td><td>51429-74-4</td><td>注意。</td></tr><tr><td>钼蓝喷雾试剂，1.3%</td><td>Sigma</td><td>M1942-100ML</td><td>注意。</td></tr><tr><td>正己烷</td><td>Carlo Erba</td><td>446903</td><td>注意。正己烷 99% RS - ATRASOL - 用于痕量分析，2.5 L</td></tr><tr><td>N-亚硝基-N-甲基脲</td><td>Sigma</td><td>N4766</td><td>注意</td></tr><tr><td>轨道摇床平台</td><td>DDBiolab</td><td>995018</td><td>NB-205L 台式摇床培养箱</td></tr><tr><td>石油醚（60-80&amp;ordm;C）</td><td>Carlo Erba</td><td>427003</td><td>注意。石油醚 60 - 80&amp;deg;C RPE - 用于分析，2.5 L</td></tr><tr><td>喷雾器</td><td>VidraFOC</td><td>712/1</td><td></td></tr><tr><td>无水硫酸钠</td><td>Merck</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>硫酸 95-97%</td><td>Merck</td><td>1007311000</td><td>注意。硫酸 95-97%</td></tr><tr><td>TLC 展开槽</td><td>Merck</td><td>Z204226-1EA</td><td>矩形薄层层析（TLC）展开槽，完整尺寸 L &amp;times; H &amp;times; W 22 cm &amp;times; 22 cm &amp;times; 10 cm</td></tr><tr><td>TLC 板</td><td>Merck</td><td>1057210001</td><td>TLC 硅胶60- 20x20 cm x 25 u</td></tr><tr><td>TLC 板加热器</td><td>CAMAG</td><td>223306</td><td>CAMAG TLC 板加热器 III</td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Carlo Erba</td><td>488551</td><td>注意。甲苯 RPE - 用于分析 - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP，1 L</td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Fisher Scientific</td><td>10132562</td><td>IKA&amp;nbsp;Agitador IKA v&amp;oacute;rtex 3</td></tr><tr><td>1-萘酚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102269427</td><td>注意。</td></tr></tbody></table>

通过薄层色谱法分析分枝杆菌的脂质组成

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

分枝杆菌物种在生长速度、色素产生、在固体培养基上表现出的菌落形态以及其他表型特征方面可能存在差异。然而，它们都具有分枝杆菌最关键的共同特征：即其独特且高度疏水的细胞壁。分枝杆菌含有由阿拉伯半乳聚糖、肽聚糖以及链长和类型因菌种而异的长链分枝菌酸组成的膜共价连接复合物。此外，分枝杆菌还能在其细胞表面非共价结合地产生多种脂类，例如二分枝菌酰基苯酚二醇（PDIM）、酚糖脂（PGL）、糖肽脂（GPL）、酰基海藻糖（AT）和磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIM）等。其中一些脂类被认为是致病性分枝杆菌的毒力因子，或在宿主与分枝杆菌相互作用中发挥关键抗原作用的脂类。因此，由于分枝杆菌脂类在多个领域具有重要应用价值——从阐明其在分枝杆菌感染致病性中的作用，到作为免疫调节剂用于治疗感染性疾病及其他病理状态（如癌症）的潜在用途——人们对分枝杆菌脂类的研究具有显著兴趣。本文介绍一种简便的方法，利用有机溶剂混合物从固体培养基中培养的分枝杆菌细胞中提取并分析其总脂含量及分枝菌酸组成。获得脂质提取物后，采用薄层色谱法（TLC）对提取的化合物进行检测分析。本示例实验使用了四种不同的分枝杆菌：环境来源的快速生长 海分枝杆菌和偶然分枝杆菌， 减毒的慢生长型 Mycobacterium bovis 卡介苗（bacillus Calmette-Guérin, BCG）以及机会性致病的快速生长菌 脓肿分枝杆菌， 表明本方案中所示方法可广泛适用于多种分枝杆菌。

为了展示不同分枝杆菌种类中存在的多种脂质，选择了粗糙型且生长缓慢的牛分枝杆菌BCG（M. bovis BCG），并加入了粗糙型且生长迅速的堪萨斯分枝杆菌（M. fortuitum）和布鲁马埃分枝杆菌（M. brumae），最后还包括了脓肿分枝杆菌（M. abscessus）的光滑型菌落形态。这四种菌种使我们能够观察到一系列来源于分枝杆菌的脂质，例如酰基海藻糖（AT）、糖脂（GPLs）、邻苯二甲酸二异丙酯（PDIM）、苯酚糖脂（PGL）、磷脂酰肌醇甘露糖苷（PIM）、分枝菌酸二阿拉伯半乳聚糖（TDM）和分枝菌酸单阿拉伯半乳聚糖（TMM）。此外，这四种菌种具有不同的分枝菌酸图谱。
完成分枝菌酸提取实验步骤后，采用两种不同但同样有效的洗脱体系，通过一维薄层色谱（1D-TLC）对脂质提取物进行分析（图3A，B）。第一种流动相（图3A）由正己烷与乙醚（85:15）组成，...

本文介绍了一种提取多种分枝杆菌细胞壁总脂质含量的方案。此外，还展示了不同类型分枝菌酸的提取与分析方案。同时提供了一种薄层色谱法用于监测这些分枝杆菌化合物。

结核分枝杆菌属的不同物种在生长速度、色素产生情况以及在固体培养基上表现出的菌落形态等方面可能存在差异，此外……

分枝杆菌的脂质是该属的重要特征，在分枝杆菌与宿主的相互作用中起关键作用。该方法的主要优点是快速且具有高度灵活性。此方法可用于研究脂质在分枝杆菌致病性及其免疫刺激效应中的作用。对于非共价连接脂质的提取，在层流罩中向带有聚四氟乙烯衬里螺旋盖的玻璃管中加入15毫升氯仿与甲醇体积比为1:2的溶液。然后，从固体培养基上刮取200毫克分枝杆菌，并将分枝杆菌加入该玻璃管中。将试管在持续搅拌条件下孵育过夜。第二天，将有机溶剂通过铺有滤纸的玻璃漏斗过滤至玻璃试管中。使用氮气吹扫以蒸发试管中的液相，然后向试管中充入氮气，并在4摄氏度条件下保存。随后，向细胞碎片中加入15毫升体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液，持续搅拌并过夜孵育。次日早晨，先让混合物静置一小时，然后使用巴斯德移液管将有机溶剂转移至铺有滤纸的玻璃漏斗中，收集到同一根玻璃收集管内。随后，按所示方法蒸发液相，再用氮气重新填充试管，并于4°C条件下保存。对于分枝菌酸提取，向带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺帽的密闭玻璃管中加入2至5毫升搅拌溶液以及200毫克分枝杆菌生物量，通过涡旋振荡混合管内物质。将混合物置于干燥浴中，在 80 摄氏度下孵育过夜。第二天，待试管冷却至室温后，加入 2 毫升正己烷，并通过涡旋振荡混合 30 秒。静置试管，直至出现两层清晰的相，然后将上层的正己烷相转移至新试管中。向试管内容物中再加入两毫升正己烷，再次收集上层液体。然后，用氮气吹干试管中的内容物，并将样品在氮气保护下于4°C保存，如图所示。为通过薄层色谱（TLC）分析样品，先在TLC展开槽内壁一侧贴上一张滤纸，于展开槽四角涂抹凡士林以密封槽体，将溶剂混合物沿滤纸壁缓慢加入，并将剩余溶剂加至TLC展开槽底部。关闭薄层色谱（TLC）展开槽至少20分钟以使其饱和。在此期间，将玻璃管中的脂质溶解于200至1000微升氯仿中，并用毛细玻璃管吸取10微升脂质氯仿悬液，直接点样到TLC板上。待样品干燥5分钟后，将TLC板放入已饱和的展开槽中，使流动相沿TLC板展开。当溶剂迁移至距离板上端1厘米处时，将板置于层流通风橱中，直至硅胶完全干燥。然后，用15至20毫升的10%摩尔浓度磷酸二水合物乙醇溶液均匀喷洒干燥的板，直至板面呈现亮黄色，并在120摄氏度下加热2至5分钟。在此代表性分析中，通过一维薄层色谱法（使用两种不同的洗脱体系）以及二维薄层色谱法，对从不同分枝杆菌种类中提取的分枝菌酸进行了分析。还进行了两种甲基化处理，以确认五型分枝菌酸的存在。在两种洗脱体系中，分枝菌酸均大致位于板的中部，但五型分枝菌酸对应的斑点仅在皂化后观察到。二维薄层色谱法还可用于鉴定不同类型的分枝菌酸。例如，Mycobacterium brumae 仅表达Ⅰ型分枝菌酸，Mycobacterium bovis BCG 表达Ⅰ型和Ⅳ型，Mycobacterium fortuitum 表达Ⅰ型和Ⅴ型，而 Mycobacterium abscessus 表达Ⅰ型和Ⅱ型分枝菌酸谱型。通过分析不同分枝杆菌物种的总脂质提取物，依据其极性和分子大小进行表征。结果显示，大多数极性脂质（如 PDIMs）存在于 Mycobacterium bovis BCG 中，但在 Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium brumae 以及 M. abscessus 的光滑形态型中则未检出。分枝杆菌牛型卡介苗（mycobacterium bovis BCG）中仅存在酚类糖脂，而分枝杆菌脓肿亚种（mycobacterium abcessus）的样本中则仅检测到糖肽脂。与霉菌酸、酰基甘油以及PDIMs、PIMs类似，这些物质也可通过一维薄层色谱（TLC）或二维薄层色谱（2D TLC）分析轻松可视化。在一维薄层色谱中，使用了两种类型的染色剂以显示PIMs。进行本方案时最重要的是在整个操作过程中不要使用任何塑料仪器。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

薄层色谱分析分枝杆菌的脂质成分

Mycobacterium tuberculosis 在液体培养基中培养后，测定其代谢组学谱。可通过改变条件来测试营养补充剂、氧化剂和抗结核药物对该微生物代谢谱的影响。提取物制备步骤适用于一维 1H 和二维 1H-13C...

样品制备 结核分枝杆菌 核磁共振代谢组学研究用提取物

本视频演示了基于薄层色谱法分离分枝菌酸的技术。该技术根据分枝菌酸——存在于分枝杆菌细胞壁中的长链脂质——的极性差异实现不同类型分枝菌酸的分离。...

基于薄层色谱法分离分枝杆菌酸变体：一种根据极性分离分枝杆菌细胞壁脂质的方法

分离和表征革兰氏阴性菌脂多糖（LPS）的脂质A区域，有助于深入了解基于细胞表面的抗生素耐药机制、细菌存活与适应性，以及化学结构多样的脂质A分子如何差异性地调节宿主先天免疫反应。...

革兰氏阴性菌脂质A的分离与化学表征

哺乳动物皮肤及其附属结构含有可溶剂提取的脂质，这些脂质可提供具有物种特征性的化学组成。本文介绍了一种常规方法，利用薄层色谱法分离自皮肤及其附属组织中提取的各类主要脂质，并通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法测定其甘油三酯谱型。...

通过制备型薄层色谱与基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析蝙蝠皮肤脂质中的三酰甘油成分

细菌细胞壁由肽聚糖构成，肽聚糖是一种由肽交联的糖链组成的高分子网络结构。超高效液相色谱法（UPLC）可实现对肽聚糖组分的高分辨率和高通量分析，有助于新发现。本文介绍了一种分离细胞壁（囊状体）并将其制备用于UPLC分析的实验方法。...

通过超高效液相色谱进行组分分析的细菌细胞壁分离与制备

本文介绍了一种结合激光捕获显微切割与液相色谱-质谱分析的技术方案，用于在肺结核肉芽肿内对药物分布进行空间定量。该方法具有广泛适用性，可实现对组织内药物浓度的高空间分辨率定量。...

利用激光显微切割液相色谱质谱法（LCM-LC/MS）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

我们介绍一种采用液相色谱串联质谱法鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces...

使用液相色谱串联质谱法对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）细胞脂质组进行定量分析

本文介绍了一种利用14C-乙酸对酵母进行代谢标记的实验方案，并结合薄层色谱法分离中性脂质。...

中性脂质合成分析 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 通过代谢标记和薄层色谱法

细菌囊泡在致病过程中发挥重要作用，并具有广阔前景的生物技术应用价值。由于囊泡具有异质性，其分析和应用受到限制；因此，亟需一种简单且可重复的方法来分离不同大小的囊泡。本文中，我们展示了利用尺寸排阻色谱法分离由Aggregatibacter...

利用尺寸排阻色谱分析细菌外膜囊泡的异质性

本方案描述了分泌蛋白的培养、收集与浓缩方法 结核分枝杆菌培养滤液蛋白（CFPs）经定量后，通过等电聚焦分离为20个组分，再利用制备型SDS-PAGE和电洗脱系统进一步分离为30个组分。...

培养滤液蛋白（CFPs）的分离与分级 结核分枝杆菌

本方案利用基于等电点的制备型等电聚焦电泳（IEF），将不溶性细胞壁和膜蛋白分离为简单的组分（每份含1-5个蛋白质），再按分子量进行分离。所得组分可直接用于免疫学和蛋白质组学分析，无需进一步纯化。...

细胞壁和细胞膜蛋白质的分离与分级 结核分枝杆菌 用于下游蛋白质分析

了解薄层色谱法分析分枝杆菌脂质成分的技术流程。该方法采用有机溶剂提取与TLC分离，适用于Mycobacterium bovis BCG等多种分枝杆菌的脂质谱鉴定，助力研究其致病机制与免疫调节功能。

通过薄层色谱法分析分枝杆菌的脂质组成

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