细胞铺展过程中细胞边缘动力学的定量分析

本视频中描述的实验方案将定义用于大尺寸成像细胞铺展过程所需的操作步骤，以及一种可无偏、自动化地量化细胞铺展动态的计算工具的使用方法。该细胞铺展分析方法能够持续追踪细胞边缘运动及细胞铺展过程中的形态变化，而这一功能在目前大多数现有的细胞铺展检测中尚属缺失。此外，本方案引入了自动化的计算机处理与分析流程，可提供关于细胞圆度、面积以及铺展过程中细胞突起与回缩周期的相关信息。

这种自动化处理可减少数据分析中的偏差，并为大量细胞的铺展动态提供一种可靠的分析方法。当该方案与药物处理或基因科学与技术相结合时，适用于大规模研究调控细胞突起的分子因子的作用速度。本方案所使用的细胞为转基因编码 PH-Akt-GFP 的小鼠胚胎成纤维细胞，该标记可实现细胞质膜的荧光标记。

在开始细胞铺展实验之前，将细胞培养至90%汇合度。当细胞达到适当的汇合度后，用火焰灼烧一块22 mm × 22 mm的盖玻片，并将其放入35 mm的细胞培养皿中。用已用PBS稀释至2.5 µg/mL浓度的纤连蛋白溶液包被该盖玻片。

将培养皿连同盖玻片放入37度培养箱中孵育一小时。一小时后，吸除纤连蛋白溶液，注意勿使移液器枪头接触盖玻片。用PBS缓冲液洗涤培养皿，围绕盖玻片轻轻吹打两到三次。

进行细胞接种时，首先从细胞培养皿中吸除培养基。随后，用预热的PBS洗涤培养皿。向培养皿中加入650微升胰蛋白酶EDTA溶液，并倾斜培养皿使酶液均匀分布。

将含有胰蛋白酶的培养皿放入培养箱中孵育一分钟。孵育结束后，首先需要将 10 毫升细胞培养基加入离心管中。接着，迅速向培养皿中再加入 10 毫升培养基以中和胰蛋白酶。

为稀释将接种到盖玻片上的细胞，用移液器将培养皿中的1毫升内容物转移至离心管中。从该离心管中吸取约500至1,000微升稀释后的细胞悬液，加入含有盖玻片的培养皿中。确保盖玻片上的细胞密度为10%汇合度或每毫升50,000个细胞，并根据需要调整稀释细胞的加入体积。

这些细胞的作用是在图像采集过程中建立一个焦平面。将培养皿中剩余的细胞按每种处理条件分别传代至一个小培养皿中，接种量为细胞总数的五分之一。这些细胞将用于分析铺展动态。

将传代培养皿和盖玻片皿放入培养箱中孵育 8 至 24 小时。为了检测 Arp2/3 在细胞铺展中的重要性，首先向对照组和处理组的离心管中各加入 5 毫升细胞培养基。接着，向两个较大的离心管中各加入 20 毫升不含酚红的 DMEM 培养基。

将药物CK-666（Arp2/3复合物的抑制剂）或对照处理物（如DMSO）加入小管和大管中。开始对细胞进行药理学处理时，取出过夜孵育的传代培养皿。吸除所有培养皿中的细胞培养基，并用预热的PBS洗涤培养皿。

取含有 CK-666 或对照补充培养基的小管，将相应管中的内容物加入各传代培养皿中。用正确的药物处理标记每个培养皿，然后将培养皿放回培养箱继续孵育1小时。孵育1小时后，吸除各培养皿中的含药培养基。随后，向所有培养皿中加入预热的PBS，以彻底清除残留的酚红培养基。

加入 230 微升胰蛋白酶 EDTA，并将培养皿放入培养箱中孵育一分钟。从培养箱中取出经胰蛋白酶处理的培养皿，随后向标记为 B 管的离心管中加入五毫升不含酚红并添加了药物的 DMEM 培养基。然后向相应的培养皿中再加入五毫升相同的培养基以终止胰蛋白酶反应。反复吹打培养基数次，以使所有细胞从培养皿上脱落。

将培养皿中的所有内容物转移至另一个已标记为A管的离心管中。为制备适合成像的细胞稀释液，从A管中转移1毫升细胞至B管。对每种处理组重复上述所有稀释步骤。将所有离心管放入培养箱中孵育45分钟，以使细胞从胰蛋白酶消化中恢复。确保可容纳22 mm × 22 mm盖玻片的细胞磁力腔室的所有部件在使用前均已彻底清洁。

从培养箱中取出带有盖玻片的培养皿。吸除细胞培养基，并用预热的 PBS 清洗盖玻片。用镊子取下盖玻片，轻轻将其放置于磁力 chamber 的底板上。

接着拿起硅胶垫圈，将其放置在盖玻片上方。将磁力腔室的主体部分安装到底板上。向磁力腔室中加入一毫升不含酚红的DMEM培养基，培养基应与相应的处理条件相对应。

取一块无绒布，小心擦拭主体部分与底板之间的外壳，以检查是否存在任何泄漏。为完成磁力室的组装，将透明盖板轻轻放到底座主体上。最后，先用喷过水的无绒布擦拭盖玻片底部，再用另一块喷过70%乙醇的无绒布擦拭。

将共聚焦显微镜的台式培养箱预热至37度。将磁力腔室置于物镜上方。在采集铺展动态之前，先在绿色荧光通道中对已极化的细胞调焦。

这可确保细胞在贴附到盖玻片后处于焦平面内。取下磁力腔室的透明盖，从已从培养箱中取出的B管中吸取500微升液体。然后将透明盖重新盖回顶部。

为了确定适合进行细胞铺展分析的细胞，请寻找绿色光晕，这些光晕代表尚未贴附到盖玻片上或处于贴附最初阶段的细胞。采集图像并保存文件。完成细胞铺展的图像采集后，开始运行兼容的 Python 集成开发环境（如 Spyder）。

为了对细胞铺展动力学进行计算分析，请找到并打开相关脚本包中提供的细胞铺展图形用户界面（GUI）文件。点击运行按钮，将在后台打开分析用的图形用户界面面板。该界面包含进行分析所需的所有设置选项。

为分析细胞面积和圆度，请在细胞铺展面积选项卡中输入采集文件及必要设置。需根据细胞类型和图像采集参数进行相应调整。点击运行后，该脚本将为所有铺展细胞生成细胞圆度和面积随时间变化的曲线图。

对于明场图像数据，请按下明场图像生成与分析标签。该分析需要输入经过裁剪的单细胞图像序列。在插入所有设置并点击运行后，脚本将为指定细胞生成多个明场图像。

左侧为使用所提供的脚本自动分割的 DMSO 和 CK-666 处理组的代表性细胞。与对照组细胞表现出的各向同性且高度圆形的形态不同，Arp2/3 抑制的细胞表现出圆形度降低。此外，自动生成的显微动态图（kymographs）提供了关键的时间分辨率，有助于理解突出结构的动态变化。

对照细胞持续伸出突起，几乎不发生回缩。相比之下，Arp2/3抑制会破坏突起的稳定性，表现为细胞铺展过程中回缩事件显著增加。这些视频将帮助您理解如何正确接种细胞、实施药理学处理，以及准备用于定量分析细胞铺展动态所需的成像和计算工具。

该方案可进一步结合细胞骨架荧光成像和迁移实验，以鉴定调控细胞突起的分子因子。感谢观看，祝您的实验顺利成功。