Name: 斑马鱼拉瓦尔异种草和肿瘤行为分析的一代 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学习使用斑马鱼幼鱼异种移植模型进行肿瘤行为分析，通过共聚焦成像和免疫荧光技术实现单细胞分辨率观察。该标准化方案支持高通量药物筛选和个性化医疗研究，可在四天内快速评估抗癌治疗效果。

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感谢Champalimaud基金会、Congento（LISBOA-01-0145-FEDER-022170，由FCT/Lisboa2020共同资助）&#160;以及FCT-PTDC/MEC-ONC/31627/2017&#160;提供的经费支持。感谢FCT为VP（SFRH/BD/118252/2016）和MML（PD/BD/138203/2018）提供的博士奖学金。感谢Fior实验室所有成员参与的重要讨论；感谢B. Costa和C. Rebelo de Almeida分享数据；感谢本实验室成员C. Rebelo de Almeida、M. Barroso和L. Leite参与本视频的制作。我们谨向CF鱼类设施（C. Certal、J. Monteiro等）以及Champalimaud传播、活动与外展团队表示感谢，特别感谢Alexandre Azinheira出色的影片制作，以及Catarina Ramos和Teresa Fernandes提供的帮助。

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</ol>

斑马鱼作为癌症发育和药物筛选模型的重要性日益增加，已催生了大量出版物3,4,7,13,14,16,18,19,20,21。然而，将癌细胞注射到斑马鱼胚胎中的技术需要极高的操作技巧，对研究人员而言可能具有挑战性。本方案旨在提供实用信息和一些技巧，以帮助克服建立斑马鱼胚胎异种移植模型初期所面临的困难。
注射前的细胞处理 
该优化方案可用于在斑马鱼中建立多种形态的细胞系异种移植模型，并可适用于不同类型的（癌）细胞。我们建议用于斑马鱼异种移植的所有细胞系均应无支原体污染。与其他细菌污染不同，细胞培养物中支原体的存在不会在显微镜下产生易于察觉的明显变化22。支原体污染可能影响细胞系的移植能力、对药物的敏感性以及斑马鱼胚胎的存活率。
尽管细胞可能持续增殖较长时间，但其表型和基因型可能发生改变。熟悉细胞系在培养中的形态和行为非常重要。建议在冻存细胞复苏后，将传代次数控制在3至12代之间，以获得可重复的实验结果。因此，应定期进行支原体检测。
注射当天，细胞应处于对数生长期（即达到约70%汇合度之前的指数生长期）。这将有助于实现充分的移植以及肿瘤特有特征的正常发育。为防止异种移植中细胞表型出现差异，关键是要在不同实验之间保持用于注射的细胞汇合度一致。注射的细胞数量可根据各细胞系的特性进行调整，因为某些细胞系可能需要较高的注射密度才能在斑马鱼胚胎中良好生长。
细胞标记的注意事项 
为了更清晰地观察用于注射及后续分析的人类肿瘤细胞，可使用荧光染料对肿瘤细胞进行标记。由于细胞大小存在差异，每厘米的细胞总数2 在贴壁培养中，不同细胞系的细胞生长情况存在差异。这将影响染色方案的效果以及用于注射的细胞收获数量。某些细胞体积较大，每瓶产生的细胞数较少（如 Hs578T），或以簇状生长（如 BFTC905），此类细胞在单次实验中需合并多个培养瓶的细胞。在此情况下，不应直接在培养瓶内进行染色，否则会导致染料用量过多（成本较高）。另一方面，对离心次数敏感或每瓶产量较高的细胞（如 HCT116），可在培养瓶内直接染色，随后使用 EDTA/细胞刮刀消化收集（更多信息请参见 表1).
在注射当天，应尽可能使用EDTA而非酶法来解离细胞，以便细胞更快地恢复细胞间连接，并减少离心步骤。然而，如果细胞对EDTA敏感、贴壁性极强或以细胞簇形式生长，则可采用酶法处理。注射所需的最佳细胞浓度及注射用培养基取决于各细胞系的特性，因此可能需要进行适当调整（表1）。
显微注射校准 
与将寡核苷酸或药物递送至斑马鱼胚胎不同，在使用异种移植的细胞系进行显微注射时，无需使用网格测微尺来校准注射针。注射过程中经过一段时间后，细胞会开始堵塞针尖，此时需要剪断针尖以增大其直径，或直接更换新的注射针。这一操作使得使用测微尺进行校准变得不可行。
为解决这一问题，通过调节喷射压力和脉冲次数（1-3次脉冲），控制所分配的细胞数量，使其体积达到与胚胎眼相似的大小。随后，为进一步控制肿瘤大小，在移植后1天（1 dpi），根据肿瘤大小对异种移植体进行分选，如 图6 B-B&#34;所示。如图6C示例所示，该分选方法可有效降低肿瘤大小的变异程度：若将所有样本合并（+，++，+++），标准化肿瘤体积误差（STEV）约为++类别的两倍（约906个细胞对比约422个细胞），变异系数约为31.9%，而++类别的变异系数为14.5%。由于注射的参考标准是体积，不同细胞类型的总细胞数差异较大，这取决于细胞的大小和形态。例如，具有大量细胞质的大细胞（如乳腺癌Hs578T细胞）形成的肿瘤较小（约600个细胞）。此外，不同细胞系所需的细胞数量也各不相同。例如，HT29结直肠癌和RT112尿路膀胱癌细胞系显示，注射的细胞数量越多，斑马鱼胚胎的死亡率越高。因此，在建立异种移植模型的过程中，需要进行一段优化期，以检测该细胞系是否对胚胎具有毒性作用，或是否需要调整注射密度（更高或更低）。
注射部位 
在制备斑马鱼胚胎异种移植模型时，最常见的差异之一是注射部位的选择。通常选择卵黄作为注射部位，因其易于接近。然而，我们观察到注射到卵黄中的细胞更容易死亡。尽管在技术上更具挑战性，我们建议将细胞注射到体腔（PVS）中，并尽可能远离心脏。在体腔内，若细胞具有转移特性，则可发生细胞聚集、招募血管和免疫细胞、迁移、内渗、外渗并形成微转移灶8,11。
移植效率 
由于不同细胞系的基础细胞死亡/存活/增殖程度存在差异，以及各细胞系可能表现出的固有免疫原性不同，因此在接种后第4天（4 dpi）各细胞系间的移植效率和肿瘤大小存在差异是可预期的9。
转移 
转移包含一系列多步骤的级联事件，可人为分为两个阶段。在第一阶段，肿瘤细胞必须从原发部位脱离，迁移并侵入邻近组织，随后进入血液循环。在第二阶段，肿瘤细胞必须在循环系统中存活，从血管或淋巴管中穿出，并最终在继发部位定植23。为了区分这些早期和晚期事件，并评估不同肿瘤细胞执行这些步骤的潜能或能力，我们设计了一种简单的检测方法。
通常情况下，当肿瘤细胞被注射到PVS时，可直接进入循环系统，随后在尾部造血组织（CHT，尾部区域）中被物理性截留。然而，根据每种肿瘤细胞的特性，我们发现某些肿瘤细胞在接种后第4天仍保留在CHT中，并能够形成微转移灶，而其他肿瘤细胞则会消失（在被CHT截留后被清除）。
因此，通过比较在细胞直接进入循环时（CIRC，细胞仅需完成转移的后期步骤）与未直接进入循环时（NO CIRC，细胞需经历转移的早期和后期步骤才能形成微转移灶）的微转移效率（在4 dpi时），我们可以评估这些细胞的早期或晚期转移潜能。我们已观察到某些肿瘤细胞在两种情况下（CIRC和NO CIRC）均能高效地在CHT中形成微转移灶，表明这些细胞具备完成整个转移级联过程的能力（例如SW480和MDA-MB-468）8,11。相反，另一些肿瘤细胞在两组中的转移潜能均非常低，几乎无法形成微转移灶，即使被直接注射入循环中（例如在24 hpi时可在CHT中观察到，但在4 dpi时已消失不见，如Hs578T）8。然而，我们明确发现还存在另一类细胞——仅在被注射入循环时才能形成微转移灶（仅在CIRC组中可观察到微转移灶）。这表明这些细胞在执行转移级联的初始步骤方面效率较低，但另一方面仍能在循环中存活，并完成外渗及在远端部位定植的过程。
免疫染色与成像 
在固定之前，该注射方案可用于其他活体成像方法，例如活细胞微分干涉差（DIC）显微镜、转盘显微镜、高分辨率活细胞共聚焦成像以及光片显微镜等。
在荧光体视显微镜下观察时，死亡细胞和细胞碎片会呈现明亮的信号，可能被误认为是活细胞，尤其是在研究目的为评估细胞系转移潜能的情况下。我们希望强调使用共聚焦成像结合特异性活力标记物和DAPI来评估肿瘤及微转移灶存活状态的重要性。此外，使用特异性的人源抗体（如抗人线粒体抗体或抗人HLA抗体）来检测人源细胞至关重要。在实施该实验方案时，应通过比较体视显微镜与共聚焦显微镜下的染色结果，训练实验人员的判读能力。经过一段时间的实践后，实验人员便能够在荧光体视显微镜下清晰区分细胞碎片与活细胞。
尽管其他量化肿瘤负荷的方法（如整体荧光面积）被广泛使用，但我们建议采用全组织免疫染色结合共聚焦成像作为更精确的方法。脂溶性染料染色的效率往往差异很大（即某些细胞染色非常充分，而另一些则不然——可能与其细胞膜的脂质含量有关），而且脂溶性染料经常形成聚集体，同时死细胞往往荧光更强，从而产生多种可能被误判为活细胞的假象。
可通过转导荧光蛋白来标记细胞，以辅助细胞追踪并省去细胞染色步骤。然而，需确保转导细胞与非转导细胞在斑马鱼异种移植模型中产生相同的结果。
此外，巨噬细胞可吞噬这些荧光标记的细胞碎片，从而被荧光标记并发生迁移，产生假阳性的转移细胞。因此，我们建议采用一系列分析工具，这些工具当然也可扩展应用于其他多种检测指标，以更准确地解读肿瘤行为：
<ul style="list-style-type: square;">
	<li>增殖 - 使用 DAPI 或抗 pHH3Ser10 抗体（Merck Millipore 货号 #06-570）对有丝分裂相进行定量分析，</li>
	<li>细胞凋亡性死亡 - 使用抗活化型 Caspase3Asp175 抗体（Cell Signalling Technologies 货号 #9661）或同等抗体，</li>
	<li>肿瘤大小 - 通过 DAPI 计数人源肿瘤细胞，人源细胞具有非常独特的染色质结构，因此可轻松与斑马鱼细胞区分；在训练识别能力时，也可始终使用染料进行二次确认，</li>
	<li>转移研究 中为明确检测人源细胞，可使用抗人 HLA 抗体（Abcam EP1395Y 货号 #ab52922）或抗人线粒体抗体（Merck Millipore 货号 #MAB1273-克隆 113-1）。</li>
</ul>
对于使用DAPI复染的对照癌细胞HCT116（平均细胞核直径为10–12 µm）进行共聚焦成像时，在Z轴堆栈中以5 µm间隔采集图像，我们观察到约50%的细胞会同时出现在两个相邻的切片中。因此，如果对每个切片中的细胞都进行计数，则存在将同一细胞重复计数的高风险。为避免定量分析中的此类问题而反复比对不同切片，会导致耗时且容易出错。为了便于对细胞总数进行定量，并提高不同研究人员之间的可重复性，我们建立了本方案中先前描述的肿瘤大小计算公式8。
我们引入了一个校正系数（1.5），以校正切片间约50%的细胞重叠。研究发现，不同研究人员对整个肿瘤进行手动计数的平均误差为20%。两名研究人员使用该公式时，误差仅为2%。该公式的使用具有93%的准确率和98%的可重复性。我们还测试了自动化方法，但由于阈值设置问题，其误差超过50%。
由于凋亡细胞的特性，活化型Caspase 3阳性细胞的定量较为困难。为了减少错误和结果的变异，我们建议由同一名研究人员对对照组和实验组样本进行计数。此外，在学习该技术时，新手研究人员必须对已有经验丰富的研究人员完成定量的图像进行计数，以比较结果并进行训练。
如果需要，可以延长检测时间。但需要注意的是，斑马鱼幼鱼从受精后约7天（注射后5天）开始需要进行活体喂养。此外，针对受精后超过6天的幼鱼，所适用的动物福利指南和法规可能有所不同。
本方案提供了实用的工具，使单名研究人员每小时可注射约200-300条斑马鱼幼鱼；并在三周内完成包括分析和统计学解释在内的全部实验。我们希望本方案能够帮助研究人员熟练掌握斑马鱼异种移植模型的建立技术。这一过程并不容易，需要不断练习，但您终将成功。祝您好运！

斑马鱼（Danio rerio）正成为研究发育和疾病的强大脊椎动物模型生物。斑马鱼在遗传上与人类高度保守（约70%的基因同源性，约84%的疾病相关基因），并且具有基本相似的器官形态特征1,2。这种保守性使得斑马鱼可用于模拟多种人类疾病，包括癌症3,4。
由于体型小、全年高繁殖力以及体外受精等特点，斑马鱼的饲养和维护比小鼠更容易且成本更低3,5。斑马鱼胚胎在出生后的前5-7天内无需活体喂养，已被广泛用作发育、感染和癌症研究的有效模型1,4,6,7。斑马鱼胚胎在受精后48小时（hpf）孵化，此时已发育为自由游动的个体，所有器官均已形成，包括跳动的心脏、功能性循环系统、肝脏、脑、肾髓等1,3。此外，在此发育阶段，仅有先天免疫系统发挥作用，适应性免疫系统仍在发育中，因此可在无需使用免疫缺陷突变体的情况下实现人类细胞的高效移植7,8。然而需要指出的是，并非所有人源细胞都能以相同效率成功移植9，例如对于白血病细胞，已有研究表明，为了实现高效移植，需要先耗竭吞噬细胞（中性粒细胞和巨噬细胞）10。
斑马鱼具有良好的遗传可操作性，且其早期胚胎具有光学透明性，因此可在单细胞水平上进行高分辨率的活体成像，从而推动了生物学多个领域内先进成像技术的建立。此外，在癌症研究中，这些特性有助于实时研究宿主与肿瘤相互作用的最初阶段，例如分析血管生成和转移潜能，以及与先天免疫系统的相互作用8,9,11,12,13。
尽管在短期异种移植实验中，没有足够时间发生转移 &#34;进化&#34;- 可以分析肿瘤细胞的转移能力（即它们完成转移各步骤的效率，如侵袭、内渗、循环中存活、外渗和定植），从而研究这些过程 体内 并实时8,11,13,14).
其生命周期的特征使斑马鱼成为癌症个体化医学研究的独特模型。相关实验可在较短时间内完成，几周内即可获得结果7,8,9,11,12,15,16。这些实验的快速性和可行性为医生和研究人员提供了获得转化研究成果的机会，这对于时间极为紧迫的癌症患者具有重要意义。
尽管在成功建立斑马鱼胚胎异种移植模型方面已有越来越多的尝试，但仍需对注射操作流程进行标准化，并在注射后对细胞活力及肿瘤行为进行评估。
在本方案中，我们为研究人员提供了在斑马鱼胚胎中注射人源癌细胞系，以及后续固定、免疫染色、成像和肿瘤细胞行为定量分析的清晰且详细的逐步操作指南。

<table><tbody><tr><td>细菌学用琼脂</td><td>VWR</td><td>97064-336</td><td>琼脂平板</td></tr><tr><td>anti-Caspase3&lt;sup&gt;Asp175 &lt;/sup&gt;(Rabbit monoclonal)</td><td>Cell Signalling Technologies</td><td>9661</td><td>全组织免疫染色一抗（稀释比例 1:100）</td></tr><tr><td>anti-human HLA (Rabbit monoclonal)</td><td>Abcam EP1395Y</td><td>ab52922</td><td>全组织免疫染色一抗（稀释比例 1:100）</td></tr><tr><td>anti- 488 (Rabbit monoclonal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35552</td><td>全组织免疫染色二抗（稀释比例 1:200）</td></tr><tr><td>anti- 594 (Rabbit monoclonal)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35560</td><td>全组织免疫染色二抗（稀释比例 1:200）</td></tr><tr><td>CellTracker Deep Red Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C34565</td><td>脂溶性染料（稀释比例 1:1000）</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C2925</td><td>脂溶性染料（稀释比例 1:1000）</td></tr><tr><td>50 mL 锥形离心管</td><td>VWR</td><td>525-0610</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>VWR</td><td>525-0604</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td>细胞核与染色体复染剂</td></tr><tr><td>激光拉针仪 P-2000</td><td>Sutter-Instrument</td><td></td><td>微电极拉制仪</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Abdos</td><td>P10202</td><td></td></tr><tr><td>切边显微镜载玻片</td><td>RS France</td><td>BPB016</td><td>封片用载玻片</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>气动皮升注射泵</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td>微量注射仪</td></tr><tr><td>矩形盖玻片，Menzel Gl&amp;auml;ser</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>631-9430</td><td>封片用盖玻片</td></tr><tr><td>SeaKem LE 琼脂糖</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>琼脂平板</td></tr><tr><td>薄壁玻璃毛细管</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td>硼硅酸盐毛细管</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12605036</td><td>酶解解离溶液</td></tr><tr><td>凡士林</td><td></td><td></td><td>用于玻片封固的石油 jelly</td></tr><tr><td>Vybrant CM-DiI Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22888</td><td>脂溶性染料（稀释比例 1:1000）</td></tr><tr><td>Vybrant DiO 细胞标记溶液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td>脂溶性染料（稀释比例 1:1000）</td></tr><tr><td>ZEISS Axio Zoom.V16 for Biology</td><td>ZEISS</td><td></td><td>&amp;nbsp;荧光体视变倍显微镜</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710</td><td>ZEISS</td><td></td><td>共聚焦显微镜</td></tr></tbody></table>

斑马鱼幼鱼异种移植模型的建立及肿瘤行为分析

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

斑马鱼幼体异种移植模型目前被广泛用于癌症研究，以开展针对人类癌症的体内实时研究。该模型能够在单细胞分辨率下快速观察抗肿瘤治疗（化疗、放疗和生物制剂）的响应、血管生成及转移过程，因此成为开展临床前研究的首选模型。

与其它模型相比，斑马鱼幼鱼异种移植实验具有多项实验优势，但最显著的优势可能是尺寸规模的缩小以及随之而来的实验时间缩短。这种规模的缩小使得单细胞成像成为可能，能够使用相对较少的人源细胞（与活检样本量相兼容），适用于中高通量药物筛选，但最重要的是显著缩短了实验周期。上述所有优势使斑马鱼异种移植实验在未来的个体化医学应用中极具吸引力。

目前已开发出多种使用不同人类肿瘤的斑马鱼异种移植方案；然而，仍缺乏一种通用且标准化的方案来高效建立斑马鱼幼鱼异种移植模型。本文提供了一套详细的逐步操作流程，并附有异种移植操作技巧，以及肿瘤行为分析、整体免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导规范。

本文提供了一步一步的操作方案，并附有建立异种移植瘤的技巧，以及肿瘤行为分析、全组织免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导原则。

斑马鱼幼鱼异种移植模型正被广泛用于癌症研究，以开展人类癌症的体内实时研究。其快速……

斑马鱼异种移植模型目前被广泛用于癌症研究。您可以将人类肿瘤细胞注射到幼体斑马鱼中，甚至成年斑马鱼体内。本文所展示的是一种幼体模型的逐步操作方案，可用于在活体动物中研究多种人类癌症的典型特征。你可以研究细胞增殖，可以研究血管生成，可以研究转移，还可以研究肿瘤微环境中的相互作用。一个很大的优势是，你可以在很短的时间内完成这些研究，例如仅需四天。另一个显著优势是，你可以利用共聚焦显微镜或光片显微镜，以单细胞分辨率对这一过程进行活体观察。你可以研究细胞如何迁移、如何相互作用，甚至如何进行相互通讯。因此，这是一个研究癌症生物学的非常强大的模型。斑马鱼异种移植模型可用于研究肿瘤对化疗、放疗甚至抗体靶向治疗等抗癌疗法的反应。此外，本方案还可进行调整，采用手术样本或活检组织来源的患者细胞，进而构建斑马鱼替身模型。准备进行注射。注射前两周，在培养中扩增细胞。在熟练掌握该技术之前，应准备过量的细胞和斑马鱼，因为在训练过程中会损失大量细胞和斑马鱼。随附PDF文件中的表一提供了多种细胞系注射时体外汇合度的最佳百分比详细指南。注射前3天，交配具有目标遗传背景的斑马鱼。注射前24小时，清洗斑马鱼胚胎培养板。弃去所有死亡和未发育的胚胎，并更换 E3 培养基。在细胞培养室中，弃去细胞培养液，用 1× PBS 洗涤一次以去除死亡细胞，然后加入新鲜培养基。准备注射操作所需的工具，例如显微注射针、琼脂糖平板以及用于排列胚胎以便注射的发夹。制备平板时，在洁净培养皿盖内倒入一层溶解的2%琼脂糖溶液，待其凝固后，借助直尺在琼脂糖表面制作三到四条直线凹槽，用于胚胎的排列对齐。注射日。将已孵化的胚胎与未孵化的卵分离。在此阶段，向胚胎培养基中添加蛋白酶可促进孵化。将胚胎放入28摄氏度的培养箱中，直至进行注射。用于注射的细胞标记。为帮助建立可重复的细胞标记技术，请参阅书面方案中的表一和表二，其中汇总了细胞系列表及多种标记溶液的信息。移除细胞培养基，并用 1× PBS 洗涤培养瓶两次。使用脂溶性染料对细胞进行标记，避免光照，并将培养瓶置于 37 度孵育。也可在细胞脱离后，于 1.5 ml 微离心管中进行标记。移除细胞标记溶液，用1× PBS洗涤细胞以去除多余的染料。加入相应的解离试剂，在37摄氏度下孵育细胞。用无菌细胞刮棒轻轻刮擦培养瓶以促进细胞解离，并用血清移液管收集细胞。将细胞转移至1.5 ml微量离心管中并进行离心。弃去上清液，用细胞培养基重新悬浮沉淀。使用台盼蓝排斥法或其它合适方法，通过血细胞计数板（Neubauer chamber）对细胞活力进行定量。将细胞在注射用培养基中离心并重新悬浮。细胞在培养基中的推荐浓度见论文中的表一。自此步骤开始，细胞必须始终置于冰上。注射操作步骤。将胚胎置于1X三卡因中麻醉5分钟。随后，转移少量已麻醉的胚胎至琼脂糖平板上，并借助发夹环将其排列整齐。确保胚胎之间保持一定距离，尤其要避免一个胚胎的卵黄与下一个胚胎的头部相互接触。为防止胚胎死亡，需注意在琼脂糖板上小心添加一至三滴1X三卡因溶液，以确保排列好的胚胎不会在板上干燥。轻轻敲击微量离心管以重新悬浮细胞。使用Microloader吸头将细胞悬液反向加载至注射针中，避免产生气泡，因为气泡可能破坏胚胎的完整性。打开气压阀，设置显微注射仪，并小心地将显微注射针插入针夹中。将显微注射针在靠近尖端处剪断。小心刺入胚胎的卵黄，降低注射针的角度，谨慎推进，直至针尖到达卵周隙。一旦针尖进入卵周隙，即可注入细胞。尽量注入与胚胎眼睛大小相近体积的细胞，并尽可能远离心脏，以防止心脏水肿。必要时调整显微注射仪的压力。将注射后的胚胎转移至含有1X三卡因溶液的洁净培养皿中，静置休息5到10分钟。这将使伤口有足够时间闭合。移除1倍浓度的三卡因溶液，并加入新鲜的E3培养基。然后，在34摄氏度下孵育胚胎。该温度可同时保证斑马鱼胚胎和人源肿瘤细胞的存活。转移性检测。若需研究细胞系的转移潜能，可在注射后约一小时，使用荧光体视显微镜对注射后的胚胎进行筛选，并根据循环中是否存在癌细胞，将胚胎分为两组。注射后一天。在荧光体视显微镜下仔细分析每个胚胎，筛选出肿瘤注射位置正确的个体。根据肿瘤大小对筛选出的异种移植体进行分类。以眼睛大小作为比较依据。丢弃任何形态异常、心脏或卵黄水肿、移植瘤中癌细胞极少，或癌细胞仅存在于卵黄内的胚胎。根据所需的实验设计分配移植瘤，并开始药物检测。每天更换药物和 E3 培养基。将异种移植样本在 34 摄氏度条件下孵育，直至实验结束。注射后第四天。在实验的最后一天，用1X三卡因溶液麻醉异种移植体，并将其小心地排列在琼脂平板上。丢弃任何已死亡或肿胀的异种移植体。这些异种移植体不纳入移植效率的定量分析。在荧光体视显微镜下仔细分析每个异种移植样本，评估卵黄周隙中是否存在肿瘤。根据实验设计，挑选出感兴趣的异种移植样本，并用25倍浓度的三卡因实施安乐死。随后在室温下用4%多聚甲醛固定至少4小时，以进行后续免疫染色。否则，在4°C下过夜保存，并于次日用100%甲醇替换甲醛。在100%甲醇中固定的异种移植组织可无限期保存于20°C。用于共聚焦成像的全组织免疫染色。全组织免疫荧光技术共需三天，具体安排如下：第一天用于异种移植组织的通透化处理及一抗孵育；第二天用于洗涤及二抗孵育。第三天，进行异种移植组织的洗涤、固定，并在封片剂中保存。该实验步骤的更多细节请参见随附的 PDF 文件。异种移植组织的封片。用凡士林或硅脂密封盖玻片的边缘，以防止封片介质泄漏。使用巴斯德移液管将异种移植组织转移到盖玻片上，并用发夹小心地将其排列整齐。在另一块盖玻片上加入封片剂。小心地将两块盖玻片合并，然后放置在显微镜载玻片上，以便于操作。进行共聚焦成像。使用带水校正功能的25倍复消色差浸没物镜可对肿瘤进行单细胞分辨率的成像，效果最佳。利用Z轴堆叠功能采集样品，每层切片之间的间隔为5 µm。在Fiji软件中打开原始数据。每个异种移植瘤的每个z轴层析图像中，从顶部、中部和底部各选取三个具有代表性的切片。打开Fiji软件中的Cell Counter插件。在Cell Counter工具中，点击“Initialize”（初始化），选择一种计数器类型，然后在图像上点击以手动启动计数模式。每次点击时，计数器都会询问已计数的细胞数量。要获得肿瘤中细胞的总数，请使用以下公式。要评估特定标记物（如免疫细胞、有丝分裂相、活化型caspase等）的总数或百分比，需使用“Cell Counter”插件，在z轴层叠图像的所有切片中，手动量化对特定标记、标记物或目的转基因呈阳性的细胞。请注意，某些细胞可能位于两个切片之间。在z轴堆栈中前后切换，以确保没有细胞被重复计数。代表性结果。按照本实验方案所述方法构建HCT 116结直肠癌细胞系异种移植瘤模型。将异种移植瘤随机分配至未处理对照组和FOLFIRI化疗组。采用免疫荧光法检测凋亡细胞，使用抗裂解型caspase-3抗体进行染色，并用DAPI对核酸进行复染。有丝分裂指数、凋亡及肿瘤大小的定量结果显示，FOLFIRI 可显著降低有丝分裂，并显著诱导凋亡，同时伴随肿瘤体积减小 54%。这些特征在高通量表型药物筛选中具有重要价值，也可用于在较短时间内评估多种抗癌治疗方案对细胞内在特性及生理效应的影响。斑马鱼异种移植模型的另一大优势在于，可研究不同肿瘤细胞之间的相互作用，并分析每种细胞类型如何影响其他细胞的行为。可以共注射不同的人类癌细胞、同一肿瘤的不同克隆，或来自不同肿瘤的细胞。在此示例中，来源于同一患者的两种结直肠癌细胞系被标记上不同的疏水性染料，并以1:1的比例混合后进行注射。我们希望本方案能够帮助研究人员真正成为生成斑马鱼异种移植模型的专家。这并不容易。你需要不断练习，反复练习。不要放弃。我相信你一定会成功的。祝你好运。

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