Name: 小鼠内淋巴囊解剖 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 34 s
Description: 学习小鼠内淋巴囊显微解剖技术，利用荧光报告基因和免疫组织化学方法实现可视化与分离。该方案支持单细胞转录组分析及内耳发育与疾病机制研究。

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本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）耳聋与其他交流障碍研究所（NIDCD）院内研究计划（NIH院内研究基金Z01-DC000060和ZIC DC000081，资助对象为先进影像核心实验室）的支持。我们感谢犹他大学（美国犹他州盐湖城）的Raoul D. Nelson博士和R. Lance Miller博士，以及埃默里大学医学院（美国佐治亚州亚特兰大）的Susan Wall博士，分享了Tg(ATP6V1B1-Cre)小鼠；同时感谢NIDCD动物设施工作人员对我们实验动物的悉心照料。我们衷心感谢Philine Wangeman博士提供的精美内耳插图。我们感谢Thomas B. Friedman博士和Robert J. Morell博士对本文稿的审阅与宝贵意见。

所有动物实验和操作均根据国家神经疾病和中风研究所/国家耳聋和其他沟通障碍研究所动物护理和使用委员会（#1264）以及东京医科牙科大学机构动物护理和使用委员会（A2020-058A）批准的方案进行。
注意：C57BL/6J 小鼠（货号 000664）、Pds-/-&#160;也称为 Slc26a4-/-&#160;小鼠（129S-Slc26a4tm1Egr/AjgJ，货号 018424）11、B6;CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm 小鼠12 以及 Ai9(LSL-RCL-tdT)（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze，货号 007909）小鼠13 均可从杰克逊实验室（Jackson Laboratory）获得，或通过申请获取。所有基因分型方法此前已有描述。B6;CBA-Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mm&#160;小鼠此前已与 C57BL/6J 品系回交至少五代，用于实验繁殖。本方法可适用于两种性别的动物，且无明显差异。过夜交配后的第一天记为胚胎发育第 0.5 天（E0.5）。
1. 颅骨内完整内耳的采集与固定
<ol>
	<li>采用机构批准的程序处死实验动物或定时妊娠母鼠，例如通过吸入 CO2。如有可能，应在通风橱中操作，以避免或尽量减少小鼠过敏原的扩散。在确认动物对足爪或尾部夹捏等疼痛刺激无反应后，进行断头。对于定时妊娠母鼠，若其内耳不用于后续实验，可选择颈椎脱位替代断头。</li>
	<li>通过剖腹术收获胚胎14，使用带球头的动脉剪以在操作过程中保护胚胎。使用环形镊子操作胚胎。将子宫角置于含冰的 4 °C 磷酸盐缓冲液（PBS）中，并按照先前描述的方法15分离各个胚胎，然后将其断头。</li>
	<li>从后向前将头部沿中线切开：首先切开头顶部皮肤，再切开颅骨顶部，每次切割约三分之一颅骨长度，避免颅骨弯曲；随后一次性切断颅底。 
	注意：对于胚胎，建议使用锋利刀片而非剪刀。关键在于，无论在任何发育阶段，切开颅骨时均不得使其变形。</li>
	<li>在不触碰或弯曲颅骨的前提下，小心取出半侧脑组织，以暴露骨迷路（图 1B，补充图 1A-B）。</li>
	<li>对于出生后第 5 天或更年长的小鼠，横切外耳道，并将皮肤向前拉向鼻部。修剪围绕内耳的颅骨部分（补充图 1C）。</li>
	<li>将每只动物的两个含内耳的半侧颅骨尽可能完整地转移至含有 10 mL 4 °C 4% 多聚甲醛（PFA）（溶于 1×PBS）的玻璃瓶或试管中，置于冰上并在通风橱中保存。 
	注意：此步骤中切勿尝试将内耳从颅骨中取出，以免损伤内淋巴管和内淋巴囊。</li>
	<li>在 4 °C 条件下于摇床上孵育 1 小时。若处理的组织来自表达荧光报告基因的动物，应将含有样本的管子包裹铝箔或置于盒中，以尽量减少光照暴露。 
	注意：若拟研究微管及其相关分子，组织固定应在室温（RT）下使用室温固定的固定剂进行。</li>
	<li>在通风橱中将 PFA 弃入适当的容器中。随后在室温下于摇床上用 10 mL 1×PBS 洗涤三次，每次 15 分钟，以在解剖前彻底清除固定剂。</li>
</ol>
2. 内淋巴囊显微解剖
<ol>
	<li>将每个内耳标本转移至含有1×PBS的35 mm组织培养皿中。</li>
	<li>将标本放置在培养皿中，使第8对脑神经的根部朝上。用#4镊子夹住耳蜗，以保持组织处于此位置（图1C）。</li>
	<li>识别关键解剖标志：前庭导水管、前半规管和后半规管、公共脚以及乙状窦（静脉）（图1D）。 
	注意：野生型小鼠的内淋巴囊呈半透明状，难以观察。为成功进行内淋巴囊的显微解剖，理解其解剖结构和定位至关重要（图1E）。</li>
	<li>使用连接1 mL注射器的27 G针头切开硬脑膜、前庭导水管以及内淋巴囊周围下方的结缔组织（图1D，F）。 
	注意：对于成年小鼠，微解剖前使用10% EDTA（pH 7.4）对标本进行脱钙有助于切开前庭导水管，但并非必需。对于出生后第5天以上的开放型内淋巴囊的解剖，建议将切口线置于前庭导水管稍偏前的位置，以便切入内淋巴囊腔（图2A）。</li>
	<li>用镊子夹住位于内淋巴囊外侧的结缔组织，并向上牵拉，将其从颞骨上剥离（图1G）。</li>
	<li>小心清除任何残留碎片。标本通常包含内淋巴囊上皮、周围结缔组织、部分前庭导水管以及乙状窦（图1H–I）。如有必要，可将内淋巴囊上皮与周围组织分离（图1J）。</li>
	<li>（可选）对于开放型内淋巴囊的解剖，握住标本的茎部，以便观察腔的横截面。将27 G针头插入腔内，并移动针头，将内淋巴囊切成两片薄层组织（图2B–C）。用镊子夹住每一片状组织的边缘，并将其彼此分离（图2D–F）。</li>
</ol>
3. 免疫组织化学
<ol>
	<li>显微解剖后，使用#5镊子将内淋巴囊转移至9孔玻璃斑点板中。</li>
	<li>使用显微镜确保内淋巴囊保持未接触状态，用200 µL移液器除去除含组织的一滴外的所有1x PBS。加入200 µL通透化与封闭溶液（含0.15% Triton X-100的1x PBS（PBS-TX）和5%牛血清白蛋白（BSA）），在室温下于旋转摇床上孵育1小时。</li>
	<li>除去阻断液，仅保留含有组织的一滴，加入200 µL一抗，4 °C孵育过夜。抗pendrin抗体6 在封闭液中以1:1000稀释可用于鉴定富含线粒体的内淋巴囊细胞，尽管在部分富含核糖体的细胞中也可观察到微弱表达16 (图5).</li>
	<li>在室温下用 1× PBS 洗涤 3 次，每次 15 分钟，随后加入二抗孵育。对于本实验所展示的标记，将商品化原液用封闭液按 1:500 稀释后的荧光染料偶联二抗 200 µL 加入组织中，于室温避光、摇床上孵育 1 小时。可使用荧光染料偶联的鬼笔环肽（phalloidin），其可识别 β-肌动蛋白（ACTB），用于显示内淋巴囊和内淋巴管的存在，以及其周围的结缔组织图 5A，C，F-G).</li>
	<li>将内淋巴囊组织置于载玻片与盖玻片之间，使用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂进行封片。室温避光干燥1小时后，在盖玻片与载玻片交界处涂抹透明指甲油以密封样本，减少气泡产生。若需观察蛋白质在顶端区域的差异性分布 与 在安装步骤中，建议通过切开边缘并展开来打开囊泡，以便暴露上皮细胞的基底外侧表面。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜成像。首先用10倍物镜观察内淋巴囊标本，以获得囊组织标记的全局视图（图 5A- D）。然后使用63倍物镜，以详细观察内淋巴囊中线粒体和核糖体丰富细胞内目标蛋白的分布情况。图5F- G).</li>
</ol>

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<li>Miller, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+B1-subunit+promoter+drives+expression+of+Cre+recombinase+in+intercalated+cells+of+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase B1-subunit promoter drives expression of Cre recombinase in intercalated cells of the kidney.</a> Kidney International. 75 (4), 435-439 (2009).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).</li>
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<li>Honda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+underlying+fluid+absorption+by+the+developing+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture underlying fluid absorption by the developing inner ear.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

许多研究人员曾使用石蜡包埋或冷冻切片进行内淋巴囊的形态学研究。切片制备的缺点在于，由于内淋巴囊上皮细胞的大小和形状差异极大，形成皱褶状且呈假复层排列的细胞层，因此很难完整观察到复杂的细胞间连接。本方案中描述的整体免疫染色结合z轴层析成像技术，能够更清晰地呈现内淋巴囊的三维结构。
为了成功进行显微解剖，关键在于在脑海中构想出内淋巴囊的完整轮廓，即使在野生型小鼠中其不可见。观察图3以及补充图1-2中所示的荧光报告信号，有助于识别小鼠内淋巴囊的位置和大小。
尽管上述方案中使用该整体解剖方法进行免疫染色，但该技术也可用于获取内淋巴囊组织以进行基因表达分析，例如RT-qPCR、微阵列表达分析，甚至单细胞RNA测序。使用本方案制备的组织进行单细胞RNA测序分析的结果已有先前报道16。对于内淋巴囊上皮细胞的基因表达分析，最好收集分离的上皮组织，以避免与其他邻近组织的污染。虽然胚胎期的内淋巴囊可以从邻近结缔组织中分离出来，但在较晚的发育阶段则困难得多。对于来自较年老小鼠的样本，建议在37 °C下用胶原酶/分散酶孵育5分钟，这有助于分离内淋巴囊上皮。
本方案所述整体免疫染色的一个缺点是，在解剖或在载玻片与盖玻片之间封片的过程中，原始的三维结构可能因操作损伤而受到影响。需谨慎操作，以避免因人为处理导致的假象。

哺乳动物的内耳由耳蜗、球囊、椭圆囊、三个半规管以及内淋巴囊组成（图1A）。这些器官构成一个连续的、充满液体的上皮结构，称为膜迷路，相邻器官之间直接相连，或通过联合管、球囊管、椭圆囊管或内淋巴管等细小管道结构相连。与其他内耳器官相比，内淋巴囊具有独特的特征。首先，它缺乏感觉上皮细胞；相反，内淋巴囊含有专门负责离子转运的细胞。其次，尽管膜迷路通常被包裹在骨迷路之中，但内淋巴囊是一个例外，其部分结构突出于岩骨之外，进入颅内腔。这种形态在内耳的进化过程中似乎高度保守。第三，内淋巴囊是在胚胎发育早期阶段由耳囊最先形成的结构，早于其他器官的形成。此外，多种病理状态与内淋巴囊扩大或内淋巴腔室异常有关。SLC26A4 基因（亦称pendrin基因）中致病性变异的存在会导致一种相对常见的感音神经性听力损失，其特征是伴随前庭导水管扩大（EVA）的内淋巴囊扩张1。当伴有甲状腺肿时，此病症被称为Pendred综合征2,3。一些学者也认为梅尼埃病与内淋巴腔室异常（积水）有关4。内淋巴囊的独特特征及其形态改变所关联的病理状态，均提示其在内耳发育与维持中具有关键作用。
尽管内淋巴囊具有重要意义，但目前对其发育过程、细胞组成、分子通路及功能特征的认识仍然有限。这在一定程度上是由于该组织难以观察和进行显微解剖。内淋巴囊是一种囊状结构，由单层上皮细胞构成，通常呈半透明状，在光镜立体显微镜下很难从其周围结缔组织中辨识出来。尽管已有少数研究人员建立了整体封片解剖技术并发表了实验结果5,6,7,8,9,10，但尚无文献专注于详细描述该操作的技术细节。
本研究描述了在不同年龄的野生型小鼠内耳中，以整体封片方式获取并分离内淋巴囊的显微解剖方法。同时展示了在缺乏 SLC26A4 表达的小鼠模型中进行类似解剖的结果，该模型具有扩张的内淋巴管和内淋巴囊。本文报道了一种转基因小鼠品系，其在内淋巴囊中表达编码 Cre 重组酶的转基因。当存在 Cre 表达的荧光报告基因（此处为 tdTomato）时，可通过有限的解剖利用荧光清晰地可视化内淋巴囊，并获取其大小相关信息。该报告基因小鼠品系还可作为教学工具，用于练习和完善内淋巴囊的解剖操作。对内淋巴囊组织进行解剖的能力，将有助于进一步表征这一研究尚不充分但至关重要的内耳结构。

<table><tbody><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Crystalgen</td><td>221-057</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 结核菌素注射器，配 27G × 13 mm 针头</td><td>BD</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>9孔斑点玻璃板</td><td>Pyrex</td><td>13-748B</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 标记的鬼笔环肽</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A34055</td><td></td></tr><tr><td>动脉&amp;nbsp;剪刀&amp;nbsp;球形尖端</td><td>Fine Science Tools</td><td>14080-11</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>用于在入射光下捕获图像的相机</td><td>Leica</td><td>DFC 495</td><td></td></tr><tr><td>用于拍摄荧光图像的相机</td><td>Leica</td><td>DFC 7000 GT</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>康宁</td><td>430053</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>康宁</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶/分散酶</td><td>罗氏</td><td>10269638001</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>康宁</td><td>2940-223</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>超细邦剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>替代选项：超细显微解剖剪；直型；尖端锋利；20毫米刃长；3 1/2&quot; 总长度</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔Alexa Fluor 488标记二抗</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>MicroSlides Superfrost</td><td>VWR</td><td>48311-702</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床，例如 Mini Shaker</td><td>Daigger</td><td>980275</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛水溶液</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（10倍浓度），pH 7.4</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>兔抗Pendrin抗体</td><td>内部</td><td></td><td>RRID:AB_2713943，PB826（Choi &lt;em&gt;等&lt;/em&gt;, 2011)</td></tr><tr><td>环形止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>摇床，例如 GyroMini</td><td>Labnet</td><td>S0500</td><td></td></tr><tr><td>配备 PlanApo 1.0x 物镜的体视显微镜</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>不锈钢单刃刀片，0.009英寸&quot;</td><td>GEM Personna</td><td>62-0176</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 组织培养皿</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ACROS Organics</td><td>32737-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

从小鼠中分离内淋巴囊

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

对人类听力和平衡障碍的突变小鼠模型的研究揭示了许多可能与人类表型相关的结构和功能改变。尽管在理解耳蜗和前庭神经感觉上皮的发育与功能方面已取得重要进展，但关于内淋巴囊的发育、细胞组成、分子通路及功能特征的知识仍然有限。这在很大程度上是由于该组织难以观察和进行显微解剖，内淋巴囊是一种仅由单层细胞构成的上皮组织。本文介绍了一种从不同年龄的野生型小鼠内耳中获取并显微解剖内淋巴囊的方法。同时展示了一例在 Pendrin 缺陷型前庭导水管扩大小鼠模型中进行类似解剖的结果。本文还介绍了一种带有荧光标记内淋巴囊的转基因小鼠模型。这种报告小鼠可在有限解剖条件下便捷地可视化内淋巴囊并测定其大小，也可作为教学工具用于教授内淋巴囊的解剖方法。这些解剖技术将有助于进一步表征这一研究尚不充分的内耳结构。

从出生后第5天（P5）小鼠中分离野生型内淋巴囊的每一步显微解剖操作均在相关视频中进行了详细展示，关键步骤的截图以及内淋巴囊的暴露过程如图所示 图1 和 图2. 
按照本方案在胚胎第16.5天（E16.5）、出生后第5天（P5）和第30天（P30）对表达tdTomato荧光的内淋巴囊进行解剖的代表性结果如图所示。 图3 以及在 补充图1 和 补充图2在携带 Tg(ATP6V1B1-Cre) 转基因并存在 Cre 表达报告基因 Ai9（LSL-RCL-tdT）的小鼠中，移除脑组织后，借助荧光解剖显微镜可在颅骨内清晰观察到内淋巴囊。 图3A- B，以及 补充图1 对于在透射光和tdTomato荧光下拍摄的不同解剖阶段内淋巴囊的图像。在这些小鼠中，Cre以镶嵌模式在整个内淋巴囊及导管的细胞中表达。图3，另见 补充图2 用于内淋巴囊的可视化 与 无荧光报告基因）。尽管该报告基因的表达并不特异于内源性表达 Atp6v1b1，该结构仅限于内淋巴囊中富含线粒体的细胞16，该上皮的两种细胞类型之一（图5E），它是识别和解剖内淋巴囊的有用辅助工具。
在图4中展示了从前庭导水管扩大小鼠模型中分离出的内耳。与对照组同窝小鼠相比，SLC26A4（pendrin）缺陷小鼠的内淋巴囊和内淋巴管出现扩大。
完整内淋巴囊免疫组织化学的代表性图像，包含和不包含结缔组织的样本如图所示 图5. 还展示了P5野生型小鼠开放的内淋巴囊的免疫组织化学结果（图 5F- G）。内淋巴囊由单层上皮构成，折叠成袋状结构，其腔内含有内淋巴。该上皮包含两种细胞类型：富含线粒体的细胞和富含核糖体的细胞（图5E）。由于内淋巴液已不存在，整体封片的内淋巴囊会变得扁平。此时内淋巴囊呈现为两层相互缠绕的上皮结构，难以确定在此上皮中表达的蛋白质的亚细胞定位。通过打开内淋巴囊，可清晰观察到单层上皮结构，并能更明确地判断目标蛋白相对于内淋巴囊腔（即内淋巴所在腔面）的分布情况。潜在的顶端（腔面侧，即内淋巴所在位置） 与 可更准确地确定这些蛋白质的基础富集情况。例如，SLC26A4 在富含线粒体细胞的顶端侧富集图 5F).
<img alt="内耳解剖示意图及分离过程；内淋巴解剖结构、耳蜗、神经；提取过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1. 出生后第5天（P5）野生型小鼠内淋巴囊的全组织解剖。 
（A）成年小鼠内耳膜迷路示意图（右侧）。图中所示为内淋巴囊、耳蜗及前庭结构的位置。本图改编自Honda等人的研究16。 
（B）中矢状切面显示左侧半颅骨。箭头所示为内淋巴囊的位置。（O，枕骨；F，额骨） 
（C）耳囊连同颞骨的鳞部。 
（D）叠加于C图虚线框中的重要解剖标志。（ES，内淋巴囊；ED，内淋巴管；VA，前庭导水管；ASC，前半规管；PSC，后半规管；CC，总骨脚；SS，乙状窦） 
（E）沿D图中连续白线穿过内淋巴囊的横截面示意图。内淋巴囊的近端由一个骨性管道覆盖，即前庭导水管，内含内淋巴管。在远端，内淋巴囊被结缔组织（CT）包绕，向外延伸并突出于骨迷路之外，夹在硬脑膜（DM）与乙状窦之间，位于颞骨的鳞部（TB）下方。 
（F）使用细针沿D图中黄色虚线围绕内淋巴囊进行切割。 
（G）通过镊子夹住星号（*）所示位置（亦见E图）并轻轻剥离，小心地将组织从颞骨上分离下来。 
（H）带有周围组织的完整分离内淋巴囊。 
（I）该分离内淋巴囊及其周围组织的示意图。 
（J）去除周围组织后的孤立内淋巴囊。 
比例尺：2 mm（B），1 mm（J）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎ES的手术解剖、显微镜图像以及显示操作过程和所用工具的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2。P5野生型小鼠打开的内淋巴囊的解剖。 
（A）在步骤2.4中，前庭导水管上的切口线略微偏向前方（红色虚线），以便切开进入内淋巴囊腔。 
（B）夹住样本的茎部，将27号针头插入腔内，并移动针头将内淋巴囊切成两片组织。 
（C）B图的示意图。 
（D）用镊子夹住每一片组织的边缘，并将其彼此分离。 
（E）D图的示意图。 
（F）内淋巴囊已被分离为两片，包含上皮层及其周围组织。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="E16.5、P5、P30 胚胎脑发育，荧光显微镜，生长分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3。E16.5、P5 和 P30 时期 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn 小鼠内淋巴囊的解剖。所有图像均使用配备 tdTomato 荧光检测功能、物镜倍数为 1× 的体视显微镜获得 tdTomato 荧光图像。 
(A, B) E16.5 时期 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn 小鼠头骨的正中矢状切面，在去除半侧脑组织前（A）和去除后（B）。tdTomato 荧光标示出内耳的位置。内淋巴囊即使在未解剖的情况下也清晰可见（箭头所示）。 
(C, E, G) 分别为 E16.5、P5 和 P30 时期分离的内耳。 
(D, F, H) 相应显微解剖获得的内淋巴囊和导管的高倍放大图像。在 P30 时期，内淋巴管被骨组织包裹，因此特别难以分离。比例尺：2 mm（A, B, C, E, G），500 µm（D, F, H）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="胚胎解剖结构比较，Slc26a4 +/− 与 Slc26a4 −/−，显微镜图像，发育研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
图4。耳囊的大体解剖结构，显示扩大的内淋巴囊。 P105时期的Slc26a4+/-（左）和Slc26a4-/-（右）同窝小鼠的内耳。与Slc26a4+/-小鼠相比，Slc26a4-/-小鼠的前庭导水管、内淋巴囊和内淋巴管（黑色虚线）明显扩大。比例尺：2 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="SLC26A4 蛋白表达的荧光显微镜图像及上皮细胞层细胞示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5。E16.5 和 P5 时期内淋巴囊上皮中线粒体丰富细胞的 SLC26A4 表达。 
（A, B）来自 E16.5 小鼠的分离内淋巴囊，使用抗 SLC26A4 抗体（绿色）和标记 β-肌动蛋白（ACTB，红色）的鬼笔环肽进行标记。 
（C）来自 P5 小鼠的打开状内淋巴囊的低倍图像，使用抗 SLC26A4 抗体（绿色）标记。鬼笔环肽（ACTB，红色）可用于突出显示内淋巴囊本身及其周围结缔组织的存在。 
（D）使用抗 SLC26A4 抗体（绿色）标记的分离内淋巴囊。 
（E）内淋巴囊上皮的示意图，突出显示两种细胞类型：其顶膜表面覆盖微绒毛的线粒体丰富细胞，以及核糖体丰富细胞。 
（F-G）P5 时期内淋巴囊上皮的高倍图像，在打开内淋巴囊后使用抗 SLC26A4 抗体（绿色）和鬼笔环肽（ACTB，红色）进行标记。G 显示顶膜水平的代表性图像，F 显示沿白色虚线位置的 z-层扫描重建横截面图像。细胞核用 DAPI（蓝色）标记。 
比例尺：100 μm（A, B）；200 μm（C, D）；20 μm（F, G）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/62375fig5v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充图1. P5 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn 小鼠内耳在解剖三个步骤中的入射光图像及相应的tdTomato荧光图像。可通过tdTomato荧光轻松观察内淋巴囊和内淋巴管。 
(A-B) P5 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn 小鼠完整半颅骨后部的内耳区域。 
(C-D) 去除皮肤和部分颅骨后，可更清晰地观察内淋巴囊区域。 
(E, F) 已分离的内耳，内淋巴囊仍与结缔组织相连。 
(A, C, E) 入射光下拍摄的图像。(B, D, F) 对应组织的tdTomato荧光图像。比例尺：2 mm（A-B），1 mm（C-F）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充图 2. E16.5 和 P5 时期R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn 与同窝出生R26LSL-RCL-tdT/+小鼠分离的内淋巴囊荧光比较。tdTomato 荧光显著增强了对内淋巴囊及导管的识别能力。 
(A-C) E16.5 时期 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn 小鼠 (A) 与同窝出生 R26LSL-RCL-tdT/+ 小鼠 (B, C) 的显微解剖内淋巴囊。 
(D-F) P5 时期 R26LSL-RCL-tdT/+;Tg(ATP6V1B1-Cre)1Rnel/Mn 小鼠 (D) 与同窝出生 R26LSL-RCL-tdT/+ 小鼠 (E, F) 的显微解剖内淋巴囊。 
(A, B, D, E) tdTomato 荧光图像。(C, F) 对应于 B 和 E 的透射光图像。比例尺：500 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62375/JoVE_HondaLee_SupplementaryFigure2.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本研究介绍了如何从小鼠内耳中分离不同年龄阶段的内淋巴囊。文中展示了在Slc26a4基因敲除小鼠模型中进行类似解剖的结果，该模型表现为内淋巴囊扩大。此外，还介绍了一种转基因小鼠模型，其内淋巴囊表达荧光报告基因，可用于直观观察内淋巴囊结构，并作为教学工具。

人类听力与平衡障碍的突变小鼠模型研究揭示了许多可能与这些疾病相关的结构和功能改变……

内淋巴囊对于内耳的正常发育至关重要。由于其在体内难以进行结构、生理和分子层面的研究，因此从动物模型（尤其是小鼠模型）中分离内淋巴囊是必不可少的。由于内淋巴囊具有薄而脆弱的上皮结构，并且紧邻周围组织且与其粘连，其分离与制备极为困难。我们的方法有助于可视化并识别囊结构及其与邻近组织的分离。影响内淋巴囊正常功能的疾病和障碍可导致听力和平衡能力丧失。本技术对于阐明内淋巴囊功能背后的细胞、分子和生理过程至关重要。本实验操作将由我实验室的博士后访问学者 Hyun Jae Lee 演示。首先，将内耳组织置于含有 PBS 的 35 毫米组织培养皿中，并使第八对脑神经根朝上。使用 4 号镊子夹住耳蜗部位，辨认前庭导水管、前半规管和后半规管、公共脚以及乙状窦。然后使用安装在1毫升注射器上的27号针头切开硬脑膜和前庭导水管，以及内淋巴囊周围下方的结缔组织。在内淋巴囊外侧的结缔组织上做切口后，用镊子夹住结缔组织，并将其从颞骨上向外牵拉剥离。仔细清除任何残留的碎屑，并将内淋巴囊上皮与周围组织分离。解剖开放的内淋巴囊时，握住标本的茎部以观察管腔的横截面。然后将27号针头插入管腔内，移动针头将内淋巴囊切分为两片。用镊子夹住每一片状组织的边缘，并将其彼此分离。在代表性分析中，通过 tdTomato 荧光观察了这些小鼠在半脑去除前后颅骨的正中矢状切面。内淋巴囊即使在未解剖的情况下也清晰可见。分别分离了胚胎第 16.6 天以及出生后第 5 天和第 30 天小鼠的内耳。在更高倍镜下观察内淋巴囊。对于出生后30天的小鼠（P30），由于内淋巴管被骨组织包裹，难以分离。采用抗SLC26A4抗体和鬼笔环肽标记，对E16.5和P5时期完整内淋巴囊进行免疫组织化学研究。使用鬼笔环肽（Phalloidin）标记内淋巴囊及其周围结缔组织。P5期打开的内淋巴囊上皮的高倍图像显示，绿色标记的SLC26A4定位于部分细胞的顶端区域。进行该操作时最重要的是要格外轻柔，以避免损伤内淋巴囊。通过该方法分离得到的固定内淋巴囊组织可用于原位杂交、RNA扩增检测（RNA scope）以及免疫组织化学。活体组织可用于提取RNA，以进行转录组分析和生理学研究。该方法已被用于研究内淋巴囊的转录组，无论是整体分析还是单细胞RNA测序分析，均有助于鉴定其不同的细胞类型。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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